Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health (ES07408 e EB00208).

1. ECIS / Taxi elettrodi Preparazione <ol><li> La superficie d&#39;oro del ECIS / taxi matrice di elettrodi (composto 8 camere per vetrino) viene prima stabilizzato mediante pre-trattamento con sterile cisteina 10 mM in acqua deionizzata (dH 2 O) per 15 min a temperatura ambiente in condizioni sterili. </li><li> Aspirare la soluzione cisteina da ciascuna camera di elettrodo, risciacquare 3 volte con sterile dH 2 O, e sostituirlo con 250 pl di mezzo completo (RPMI 1640, FBS 10%, 25 mM di tampone HEPES). </li><li> Collegare la matrice di elettrodi a contatto pin sul possessore dello strumento matrice per eseguire il controllo elettrodo. </li><li> Chambers che sono collegati correttamente sarà evidenziato in verde sullo schermo del computer. Se i contenitori sono evidenziati in rosso, non sono collegati e l&#39;elettrodo deve essere riposizionato nel supporto matrice di stabilire contatti per tutte le camere. </li><li> Una volta che tutte le camere sono collegati, fare clic sul pulsante &quot;check&quot; nel software di controllo per scoraggiareminare la resistenza iniziale e valori di capacità per ogni camera. I valori della resistenza deve essere compresa tra 1600 e 2000 ohm, e valori di capacità deve essere compresa tra 5 e 6 nanofarads per una matrice 8 camera. Se una camera non è all&#39;interno di questi parametri accettabili, la camera individuo non deve essere utilizzato per raccogliere dati. </li><li> Scollegare l&#39;elettrodo dal titolare array per preparare le singole camere agarosio. Aspirare il terreno dalle camere e lavare ogni camera 3 volte con sterile dH 2 O. </li></ol> 2. Preparazione Agarose Chambers <ol><li> In un tubo di polipropilene sterile 15 ml conica, misura 0,03 g di Seakem GTG agarosio e aggiungere 1 ml di PBS sterile. Rimettere il tappo del tubo in modo impreciso, e sciogliere l&#39;agarosio in autoclave per un ciclo di 2 min liquido (fusione in un forno a microonde non è efficace per questo test). Questo breve periodo di tempo non si scioglierà il tubo conico. Per le celle meno esigenti che non richiedono siero per la cultura, (ad esempio Dictyostelium discoideum) 0,5%agarosio può essere fatto nel mezzo appropriato e fusi in un forno a microonde. L&#39;autoclave è necessaria per le celle che richiedono siero, come sarà denaturato se fuso in forno a microonde. </li><li> Aggiungere 5 ml di mezzo RPMI completo riscaldato in un bagno di acqua (55 ° -60 ° C) direttamente al agarosio caldo, ad una concentrazione finale di 0,5% agarosio e pipettare su e giù delicatamente per miscelare. </li><li> Pipettare 300 pl di mezzo fuso agarosio in ciascuna camera, sostituire le ECIS / matrice copertura taxi e permettono di gel a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare rimanente agarosio nel tappo della provetta 15 ml di valutare gelificazione agarosio. Questo eccesso di agarosio sarà utilizzato anche in parte 4: Taglio di pozzi in agarosio. </li></ol> 3. Costruzione e affilatura la cannula strumento Well taglio <ol><li> Contrasta due cannule 14 estremità smussata calibro, con un &quot;5/64 bit. Ruotare la punta del trapano in ciascuna apertura cannula con un trapano a bassa velocità, rendendo certa la punta taglia tutta bordo interno di ogni op cannulazare per formare un bordo tagliente (Figura 4A). </li><li> Praticare due fori attraverso i 1 &quot;x 2&quot; x &quot;in plexiglass (Figura 4B-D) con un 5/64&quot; ¼ bit in un trapano a colonna. Inserire ogni affilato cannula calibro 14 in modo che sporga una distanza uguale in ogni foro plexiglass. </li></ol> 4. Taglio Wells in agarosio <ol><li> Sterilizzare il 14 cannule di calibro con una leggera fiammeggianti le punte. Prima di taglio pozzetti nella camera ECIS, permettono la cannule raffreddare a temperatura ambiente, o raffreddare le cannule toccando l&#39;agarosio nel tappo del tubo 15 ml. Se la temperatura della cannula è troppo elevata, l&#39;agarosio si scioglierà come i pozzetti camera sono tagliate, rendendo i pozzetti deformi e difettoso. </li><li> Allineare la coppia cannula sopra i due punti d&#39;oro che circondano l&#39;elettrodo bersaglio in ciascuna camera (figura 2c e 5). Inserire la cannula verticalmente, senza alcun movimento orizzontale, fermandosi al contatto tra la cannula dolce ela superficie dell&#39;elettrodo. Rimuovere con cautela la cannula, ancora una volta senza alcun movimento orizzontale. Posizionamento dei pozzi aggiuntivi per opporsi gradienti è possibile anche con una riconfigurazione del jig cannula. </li><li> Aspirare delicatamente il tappo di agarosio lasciato dalla cannula, con una sterile 9 &quot;pipetta Pasteur, collegato alla bassa pressione di vuoto, con una trappola a vuoto cattura dei rifiuti agarosio. </li><li> Aggiungere 300 pl di mezzi completi RPMI alla superficie di ciascuna camera a 37 ° C, per 2 min per saturare la agarosio, e quindi delicatamente aspirare il supporto dalla superficie ed i pozzetti senza disturbare l&#39;agarosio. </li></ol> 5. Caricamento del Wells <ol><li> Ogni bene è in grado di contenere un volume di 7 pl. Per un pozzetto in ogni camera, si aggiungono 7 microlitri di sospensione di cellule. Per cellule T Jurkat, utilizzare 2 x10 7 cellule / ml. Queste cellule risponderà a 7 microlitri di 200 ng / ml SDF-1α diluito in RPMI incompleto, che manca di siero. Utilizzare mezzi completi da solo come un cont negativorol. </li><li> Dopo che i pozzetti vengono caricati, visualizzare ogni camera della matrice con un microscopio invertito per garantire che tutti i pozzetti sono stati tagliati e riempito correttamente. Le cellule devono essere entro i confini del confine del pozzo. Se si sono visti in entrambi i pozzetti, o si stanno diffondendo al di là delle frontiere delle cellule e, quindi un divario si è formato sotto l&#39;agarosio. Nota: i pozzi impropriamente istituiti, in quanto i dati non possono essere interpretati in modo affidabile da quelle camere. </li></ol> 6. Raccolta dei dati <ol><li> Posizionare l&#39;elettrodo nel supporto matrice e ri-collegare gli elettrodi d&#39;oro sulla matrice di elettrodi ai molla pogo pin del titolare e fare clic su &quot;setup&quot;. I pozzi che sono stati collegati correttamente sarà evidenziato in verde. Se i pozzetti sono rossi, essi non sono collegati e l&#39;elettrodo deve essere riposizionato nel supporto matrice. </li><li> Selezionare &quot;8WE1&quot; (8 e 1 elettrodo) dal menu a tendina nel pannello software per indicare la configurazione dell&#39;array. </li><li> Selezionare &quot;Controlla&quot; nel software contrpannello olo per determinare la resistenza iniziale e valori di capacità per ciascun pozzetto. I valori di resistenza deve essere compresa tra 1600 e 2000 ohm, mentre i valori di capacità dovrebbero essere tra 5 e 6 nanofarads. </li><li> Selezionare più frequenze per misurare la resistenza a diverse frequenze. Vi è una scelta di personalizzazione frequenze, o utilizzando un set di frequenze raccomandate. Le impostazioni standard, più frequenza di acquisizione acquisire i dati a 11 frequenze preimpostate (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 e 64.000 Hz) ad una velocità di 8 pozzetti / min. L&#39;intervallo di tempo tra le misurazioni possono anche essere personalizzati. La raccolta di dati di frequenza più consente di analizzare capacità, impedenza, e resistenza. Raccogliere valori di resistenza a 4.000 Hz è in genere sufficiente per gli studi chemiotassi di cellule di mammifero, ma le frequenze aggiuntive possono fornire informazioni in altri contesti 12,13. </li><li> Durata dell&#39;esperimento totale può essere impostata, sulla destrapannello o l&#39;esperimento può essere fermato manualmente, facendo clic su &quot;finish&quot; una volta che le cellule hanno prodotto la resistenza che sono indicativi di arrivo dell&#39;elettrodo. Il tempo necessario per le cellule per arrivare al elettrodo dipende dal tipo cellulare utilizzato. </li><li> Fare clic su &quot;Start&quot; per avviare la raccolta dei dati. </li></ol> 7. Data Management <ol><li> Anche se i dati possono essere esportati in Excel, il software ECIS 1600R, che accompagna il sistema ECISθ è il metodo più efficiente per analizzare i dati di ECIS / Taxi. </li><li> I dati del software di analisi barra degli strumenti contiene i pulsanti di opzione Z, R, e C. Si tratta di stabilire se l&#39;impedenza, la resistenza, o di capacità, rispettivamente, viene tracciata sull&#39;asse verticale contro l&#39;asse x (tempo trascorso). </li><li> ECIS / Taxi dati vengono visualizzati come più efficace resistenza nel tempo a 4.000 Hz. Rapide fluttuazioni resistenza, o microtransients (Figura 1), sono prove di movimento cellulare sull&#39;elettrodo. Compilazione, obinning r i punti dati in modo che non tutti i punti sono rappresentati graficamente, non è raccomandato per ECIS / Taxi, dato che microtransients media fuori dei dati. </li><li> Una volta che il grafico è stato realizzato con il software ECIS1600R, può essere esportato scegliendo &quot;grafico export&quot; dal menu file e salvato come. Tif o. File jpg. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Chemiotassi cellulare è indicata da un aumento della resistenza a 4.000 Hz. L&#39;arrivo di celle sul elettrodo bersaglio è anche indicata dalla comparsa di rapide fluttuazioni resistenza chiamati microtransients o micromovimento come descritto in Opp et. al., 2009 (Figura 1) 14. Un risultato negativo è indicato da costante, o una leggera diminuzione, in resistenza a 4.000 Hz, come visto in rosso in figura 1. L&#39;assenza di microtransients è anche un segno di un&#39;assenza di movimento delle cellule all&#39;elettrodo. L&#39;aumento della resistenza è direttamente proporzionaleproporzionale al numero di celle che attraversano l&#39;elettrodo 10. L&#39;aggiunta di anticorpo monoclonale specifico per un fattore chemiotattico o tossine conosciute per interferire con i recettori accoppiati a proteina G può bloccare chemiotassi 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg" /> Figura 1. La chemiotassi di cellule Jurkat T umane in risposta a SDF1α. Umane cellule T Jurkat (2.0x10 6 cellule / ml) sono stati esposti a un gradiente di SDF-1α (concentrazione iniziale 100 ng / ml) o RPMI 1640 come controllo negativo. La resistenza normalizzata a 4000 Hz è stata rappresentata graficamente. Umane cellule T Jurkat spostata in risposta a SDF-1α, come dimostra l&#39;aumento di resistenza e microtransients, mentre nessun movimento è stato visto con esposizione a RPMI 1640. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg" /> Figura 2. Vista dall&#39;alto di un ECIS / Taxi elettrodi without agarosio. Ogni ECIS / taxi elettrodo è composto da 8 camere singole. Ogni camera condivide un elettrodo grande (a), e contiene un singolo elettrodo bersaglio (b). Ogni camera ha anche 2 cerchi oro (c), che sono utilizzati come guida per il taglio dei pozzetti nel agarosio con le cannule. I quadrati oro (d) sono le piazzole di contatto che si collegano ai perni pogo per applicare la corrente AC all&#39;elettrodo. Gli elettrodi target individuali sono ciascuno in circuito con controelettrodo maggiore (e). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg" /> Figura 3. Due pozzetti sono tagliati in ciascuna camera di agarosio-riempita. Quando il chemioattraente è aggiunto a un pozzetto si diffonde per creare un gradiente di agarosio, con la maggiore concentrazione di chemoattract più vicino al chemioattrattore bene. Le cellule viaggiano sotto l&#39;agarosio verso alte concentrazioni di chemioattraente e può passare sopra l&#39;elettrodo di destinazione. Comele cellule attraversano l&#39;elettrodo di destinazione, un aumento di resistenza è registrato dal software ECIS 1600R. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg" /> Figura 4. Inserimento di due cannule calibro 14 in plexiglass. A) A 5/64 &quot;punta viene usato per affilare la punta della cannula. B) Due fori devono essere praticati in plexiglass per ospitare il 14 cannule calibro secondo il colpo layout. C) Utilizzare un trapano a colonna per garantire che i fori sono perpendicolari alla superficie pleixglass. D) due cannule affilato vengono inseriti attraverso ¼ &quot;in plexiglass, 2 mm di distanza (misurata dai bordi interni). Queste cannule vengono accuratamente affilati inseriti agarosio per tagliare i pozzi. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg" /> Figura 5. Allineamento cannule con punti d&#39;oro in ECIS / Taxi da camera. Per tagliare i pozzi, le cannule affilata deveessere allineati con i punti d&#39;oro che fiancheggiano l&#39;elettrodo bersaglio sul fondo della ECIS / Taxis camera. La cannula deve essere inseriti verticalmente, senza alcun movimento orizzontale, e rimosso allo stesso modo.

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+gradients+of+chemotactic+factors+in+chemotaxis+assays.">Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays.</a> Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).</li><li>Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+chemokinetic+behavior+of+inflammatory+lung+macrophages+in+a+linear+under-agarose+assay.">Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay.</a> J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).</li><li>Keese, C. G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole+Cell+Biosensor+bsed+on+Cell-Substrate+Interactions.">A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).</li><li>Laevsky, G., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+of+actin+filaments+by+myosin+II+is+a+major+contributor+to+cortical+integrity+and+cell+motility+in+restrictive+environments.">Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments.</a> J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).</li><li>Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+amoeboid+chemotaxis:+an+evaluation+of+the+cortical+expansion.">Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion.</a> 11, 5-6 (1990).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).</li><li>Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurements+of+leukocyte+chemotaxis.">Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis.</a> J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).</li><li>Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+MCP-1+expression+in+airway+epithelial+cells:+role+of+CCR2+receptor+in+airway+epithelial+injury.">Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury.</a> J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).</li><li>Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aryl+hydrocarbon+receptor+repressor+is+a+putative+tumor+suppressor+gene+in+multiple+human+cancers.">The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers.</a> J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).</li><li>Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+assess+in+vitro+cytotoxicity.">Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).</li><li>Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+conflicting+chemotactic+signals.+The+role+of+memory+in+leukocyte+navigation.">Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation.</a> J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).</li><li>Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+signaling+hierarchy+determines+direction+of+migration+in+opposing+chemotactic+gradients.">An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients.</a> J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).</li></ol>

David A Knecht e Michael A Lynes avere un brevetto rilasciato per la ECIS / Taxi tecnologia, che, come è stato autorizzato dalla University of Connecticut di Biofisica Applicata, Inc.

Caratteristiche innovative della ECIS / Taxi test includono la capacità di automatizzare la raccolta dei dati in tempo reale, come le cellule rispondono a chemoattractant. Mentre l&#39;applicazione più comune di questa tecnologia è quello di misurare le risposte cellulari a gradienti chemiotattici individuali, o per gradienti costituiti da miscele di agonisti e antagonisti chemiotassi, la ECIS / Taxi approccio è anche soggetto a variazioni a queste configurazioni che possono essere molto utile nella valutazione dell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Biofisica Applicata </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Electrode Array </td><td> Biofisica Applicata </td><td> 8W chemiotassi </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarosio </td><td> Applicazioni BioWhittaker molecolari </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone siero fetale bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomicina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> Penicillina 5000 UI / ml, streptomicina 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampone Hepes </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> Soluzione 1M, cellule di grado coltura </td></tr><tr><td> 14 Gauge Cannula in acciaio inox (2) 4 pollici </td><td> Laboratori di alimentazione </td><td> 5-8365-1 </td><td> Punto di Blunt </td></tr></tbody></table>

measurement of cellular chemotaxis with ecis/taxis

Movimento cellulare in risposta a stimoli esterni è fondamentale per molti processi cellulari compresa la guarigione della ferita, infiammazione e la risposta alle infezioni. Un metodo comune per misurare chemiotassi è il dosaggio camera di Boyden, in cui vengono separate le cellule e chemioattrattore da una membrana porosa. Come cellule migrano attraverso la membrana verso il chemioattraente, aderiscono alla parte inferiore della membrana, o rientrano nei mezzi sottostanti, e vengono successivamente colorate e visivamente contato 1. In questo metodo, le cellule sono esposte a un gradiente ripido e transitoria chemiotattico, che si ritiene essere una rappresentazione povera di gradienti trovano nei tessuti 2. Un altro sistema di dosaggio, il sotto-agarosio chemiotassi saggio, 3, 4 misure cella movimento su un substrato solido in un film sottile che forma acquosa sotto lo strato di agarosio. Il gradiente che si sviluppa in agarosio è bassa e si ritiene sia un appropriate rappresentazione della natura gradienti. Chemiotassi può essere valutata mediante imaging microscopico della distanza percorsa. Sia il test camera di Boyden e il sotto-agarosio test di solito sono configurati come i saggi degli endpoint. Il automatizzato ECIS / Taxi sistema combina la sotto-agarosio approccio con impedenza di rilevamento elettrico Cell-substrato (ECIS) 5, 6. In questo saggio, elettrodi bersaglio si trovano in ciascuna delle camere 8. Una grande contro-elettrodo attraversa ciascuna delle camere 8 (Figura 2). Ciascuna camera è piena di agarosio e due pozzetti sono il taglio in agarosio su entrambi i lati dell&#39;elettrodo bersaglio. Un pozzetto viene riempito con la popolazione cellulare di test, mentre l&#39;altra contiene le fonti di chemioattraente diffusione (Figura 3). Corrente passata attraverso il sistema può essere usato per determinare la variazione di resistenza che si verifica come cellule passare l&#39;elettrodo bersaglio. Celle sul bersaglio elettrodoe aumentare la resistenza del sistema 6. Inoltre, rapide fluttuazioni della resistenza rappresentano cambiamenti nelle interazioni delle cellule con la superficie dell&#39;elettrodo e sono indicative di variazioni di forma in corso cellulari. Il ECIS / taxi sistema può misurare il movimento della popolazione cellulare in tempo reale per lunghi periodi di tempo, ma è anche abbastanza sensibile da rilevare l&#39;arrivo di una singola cellula all&#39;elettrodo bersaglio. Dictyostelium discoidium è noto di migrare in presenza di un gradiente di folato 7, 8 e la sua risposta chemiotattica può essere misurato da ECIS / Taxis 9. Chemiotassi dei leucociti, in risposta a SDF1α e antagonisti di chemiotassi è stata misurata con ECIS / Taxi 10, 11. Un esempio della risposta di leucociti SDF1α è mostrato in Figura 1.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis at JoVE.com

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

L&#39;ECIS / Taxi sistema è un sistema automatico, in tempo reale test che misura chemiotassi cellulari. In questo saggio, cellule si muovono sotto uno strato di agarosio per arrivare ad un elettrodo bersaglio. Movimento cellulare è misurata dalla comparsa di resistenza a 0 corrente alternata.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

measurement-of-cellular-chemotaxis-with-ecistaxis

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  University of Connecticut. L'ECIS / Taxi sistema è un sistema automatico, in tempo reale test che misura chemiotassi cellulari. In questo saggio, cellule si muovono sotto uno strato di agarosio per arrivare ad un elettrodo bersaglio. Movimento cellulare è misurata dalla comparsa di resistenza a 0 corrente alternata.

Video: Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Gli studi di chemiotassi batterica Utilizzando Microfluidica - Intervista

Ricerca

Biologia

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades. Today, such pipettes are made from glass capillaries using a programmable puller. Such instruments heat the capillary using either a metal filament or a laser and draw out the glass using gravity, a motor or both. Pipettes for patch-clamp recording are formed using only heat and gravity, while sharp electrodes for intracellular recording use a combination of heat, gravity, and a motor. The procedure used to make intracellular recording pipettes is similar to that used to make injection needles for a variety of applications, including cRNA injection into Xenopus oocytes. In general, capillary glass &lt;1.2 mm in diameter is used to make pipettes for patch clamp recording, while narrower glass is used for intracellular recording (outer diameter = 1.0 mm). For each tool, the puller is programmed slightly differently. This video shows how to make both kinds of recording pipettes using pre-established puller programs.

This video shows how to use a programmable puller to make patch pipettes and sharp electrodes for electrophysiology. The same procedure can be used to make a variety of glass tools, including injection needles.

Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Glass microelectrodes (also called pipettes) have been a workhorse of electrophysiology for decades.  Today, such pipettes are made from glass capillaries ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...