Ringraziamo S. Burkhart, C. Hofmann e Simone Gräßle per l&#39;eccellente assistenza tecnica e siamo grati al signor Ferg per un aiuto con l&#39;analisi dei dati. Ringraziamo anche S. Rastegar per i commenti critici sul manoscritto. Riconosciamo finanziamento da parte Studienstiftung des deutschen Volkes (a MW), la DFG (DI913/4-1) e le BioInterfaces Helmholtz programma in KIT.

1. Preparare la diluizione di lavoro della Biblioteca Chemical Prediluire composti della libreria del medicamento da testare (ad esempio farmaci approvati dalla FDA, Enzo Life Science) in E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2) con una stazione robotizzata di manipolazione dei liquidi (per es Multiprobe II, 8 aghi con Adattatore punta smaltimento, PerkinElmer). Concentrazioni adatti sono ad esempio 40 mg / ml a 3% DMSO, ma questo dipende dal tipo di libreria utilizzate. Le impostazioni Multiprobe II corrispondenti alle operazioni descritte di seguito vengono riportati in Tabella 1. Il protocollo descritto nella tabella permette la preparazione di quattro piastre aliquote in parallelo. <ol><li> Pipettare 10 microlitri aliquote della biblioteca magazzino (2 mg / ml in DMSO) in pozzetti profondi (ad esempio piastra a 96 pozzetti bagagli, rotondo Bene, 0,8 ml, ABgene). Le colonne 1 e 12 devono essere lasciati liberi - questi riceveranno i controlli positivi e negativi all&#39;interno della piastra. </li><l<html> i&gt; Dispensare 490 ml di E3 con 1% DMSO nelle aliquote preparate della biblioteca con il Multiprobe II. Diluizione viene eseguita con aghi fissi, senza punte di smaltimento. </li><li> Aggiungere 10 ml di DMSO nella colonna 1 e 10 ml di una soluzione di desametasone 5 mM (in DMSO) a colonna 12 come controlli all&#39;interno della piastra. La concentrazione di DMSO in tutti i pozzetti è ora 3%, la concentrazione di desametasone nei pozzetti di controllo positivi è 100 mM in E3 / 3% DMSO. </li><li> Sigillare la piastra con resistente DMSO adesivi fogli di tenuta. Conservare le piastre a -80 ° C fino al loro utilizzo. </li></ol> 2. Allevamento di Reporter Pesce Raccogliere embrioni da riproduzione naturale di accoppiamenti di gruppo tra GRE: pesce Luc transgenico. Sollevare embrioni (non più di 60) in nove centimetri piastre di Petri contenenti E3 mezzo supplementato con 1 mg / ml di blu di metilene fungicida fino a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) in un incubatore a 28 ° C. Cambiare E3 mezzo regolarmente. title &quot;&gt; 3. Preparazione di Luciferase Medium (E3L) Preparare una soluzione acquosa luciferina magazzino di 50 mm con l&#39;aggiunta di dH 2 O al flaconcino contenente la polvere luciferina. Questa soluzione madre può essere conservato a -80 ° C per diversi mesi. Diluire il luciferina magazzino in E3 mezzo ad una concentrazione finale di 0,5 mm per ottenere E3L medie. 4. Distribuire larve in 96 pozzetti <ol><li> Preparare 1 ml punte per pipette con ampio foro tagliando circa 5 mm di punta e brevemente fiammeggiante i bordi taglienti. </li><li> Pool larve da diverse croci da essi versando con attenzione di piastre di Petri in un becher. Raccolto circa 50 larve alla volta versandole delicatamente su un setaccio (dimensione dei pori di diametro 0,25 millimetri) e collocare immediatamente il setaccio in una piccola capsula di Petri (diametro 5,5 centimetri) riempito con E3L medie. </li><li> Con una punta larga foro pipetta, 225 ml di mezzo contenenti una larva ciascuno dei pozzetti di bianco96 pozzetti (Optiplate, PerkinElmer). </li><li> Sigillare le piastre con i fogli di colla di tenuta (ad esempio TopSeal-A, PerkinElmer) e incubare a 28 ° C durante la notte. Questo preincubazione impedisce la registrazione di cambiamenti transitori bioluminescenza subito dopo l&#39;aggiunta di luciferina, un fenomeno che si verifica anche in cellule in coltura 19. </li></ol> 5. Trattamento farmacologico <ol><li> Rimuovere la piastra contenente la diluizione di lavoro della biblioteca dal -80 ° C freezer circa 4 ore prima dell&#39;uso. Vortice delicatamente la piastra e brevemente girare in una centrifuga per raccogliere il liquido sul fondo della piastra. </li><li> Rimuovere i fogli adesivi di tenuta dalle piastre larve. </li><li> Con un dispositivo di dispensazione a 96 canali ad azionamento manuale (ad esempio Liquidator, Steinbrenner) pipetta la soluzione di farmaco su e giù per 3 volte. Poi aliquota 25 microlitri della diluizione di lavoro della biblioteca chimica nei pozzetti contenenti le larve (con l&#39;esempio precedente, questarisultati in una concentrazione finale di 4 mg / ml in E3 con 0.3% DMSO). Preparare 10 (minimo: 5) piastre di replica con larve per piastra biblioteca. </li><li> Sigillare i piatti con i fogli adesivi di tenuta ed etichettare ogni piatto con un adesivo del codice a barre. </li></ol> 6. Luminescence registrazione <ol><li> Mettere le piastre contenenti le larve nelle unità accatastamento di un lettore bioluminescenza EnVision con maggiore sensibilità luminescenza (PerkinElmer). In alternativa, utilizzare un sistema robotizzato incubatore come quelli impiegati per sistemi di screening di colture cellulari di mammifero in combinazione con il lettore. </li><li> Record bioluminescenza per due giorni utilizzando le impostazioni del lettore analoghi a quelli descritti nella tabella 2 per il lettore EnVision. Adattare il numero di ripetizioni del test per il numero di piatti nella corsa adatta al tempo di funzionamento richiesto. </li><li> Dopo la fine della corsa, controllare le piastre per la presenza di larve morte per valutare la tossicità generale del compounds. </li></ol> 7. Analisi dei dati Tutte le analisi dei dati viene eseguita in R ambiente di programmazione statistica utilizzando script personalizzati. <ol><li> Calcolo AUC Al fine di identificare i composti che attivano GC segnalazione indipendentemente dalle loro proprietà cinetiche, determinare l&#39;area sotto la curva (AUC) delle tracce di luminescenza registrati (bioluminescenza conteggi in funzione del tempo) come parametro di screening. AUC sono approssimate con la regola trapezoidale (vedi figure 2a e un &#39;). </li><li> Normalizzazione Log trasformare i valori AUC per garantire una maggiore normalità dei dati (figure 2b e b &#39;). Poi normalizzare il registro trasformata valori di AUC per ogni piastra libreria con il metodo Z-score robusta (vedi 20). Questo normalizzazione comporta valori che rappresentano il numero di deviazioni standard dalla media di tutti i punti di dati. In questo modo,errori sistematici, come la variabilità inter-run, vengono rimossi dai dati. I dati possono essere visualizzati tracciando il robusto Z-score medio delle repliche per ciascun bene (figure 2 quater e c &#39;). </li><li> Metriche di qualità <ol><li> Heatmap Per visualizzare effetti piastra correlate, tracciare i dati per ogni piastra come heatmap utilizzando ad esempio la funzione heatmap.2 del pacchetto gplot 21. In questo modo, effetti di bordo o per composti di riporto possono essere facilmente individuati (es confrontare figura 3a con 3b). Escludi piastre sub-ottimali da ulteriori analisi. </li><li> Curva ROC Per determinare la sensibilità e specificità del test, calcolare un ricevitore operating characteristic (ROC) curva esempio con l&#39;ausilio del pacchetto Bioconductor ROC 22 utilizzando i valori di Z-score determinati in 7.2 (figura 3c). Successivamente, determinare la AUC di questa curve. Un valore AUC vicino a 1 indica alta sensibilità e specificità del test. </li></ol></li><li> Hit Identificazione Per ottimizzare il valore di cut-off per l&#39;identificazione dei composti attivi, determinare l&#39;indice Youden. Per calcolare l&#39;indice, sottrarre il vero tasso positivo stimato (TPR) dal tasso di falsi positivi (FPR) della curva ROC per aumentare i valori di cut-off robusti Z-score. Prendete il robusto Z-score con il più alto indice Youden (TPR meno FPR) come punto di cut-off. Il TPR / FPR può essere stimato rilevazione dei pozzetti di controllo positivi o di composti attivi noti all&#39;interno della biblioteca. Quando si utilizza il controllo positivo pozzi assicurarsi che essi corrispondano alla forza hit previsto. </li></ol> 8. Rianalisi <ol><li> Rivalutare composti hit positivi trattando larve con diluizioni seriali dei composti ottenuti da un fornitore diverso, utilizzando la stessa registrazione set-up descritto sopra. I veri risultati dovrebbero indurre una luminescenzaLSO in questo saggio, idealmente in modo dose-dipendente. </li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Vi presentiamo qui il flusso di lavoro e di analisi dei dati per uno schermo chimico misurazione dell&#39;attività GC in vivo utilizzando il GRIZLY test 18. Il saggio presenta caratteristiche di controllo di qualità e misure di performance che sono paragonabili con schermi cellulari basati convenzionali, un vantaggio importante per il suo utilizzo in ambienti ad alto rendimento. Inoltre, tuttavia, il saggio in vivo rileva anche i composti che non sono accessibili agli schermi in vitro. Questo è esemplificato dalla presenza del pregnenolone pro-ormone tra i risultati. Così, il saggio GRIZLY estende il campo di schermi volte a attività di segnalazione GC. L&#39;importanza del rilevamento di effetti in vivo con nostra analisi risulta anche da risultati ottenuti con il DBT inquinanti organostannici e TBT 18. DBT, ma non TBT, ha mostrato di inibire la segnalazione GC in colture cellulari di mammifero, e abbiamo osservato lo stesso in colture cellulari zebrafish esprimerezione del GRE: Luc giornalista. Importante, tuttavia, nel saggio GRIZLY, TBT ha mostrato attività inibitoria sulla via GC, in quanto può essere convertito DBT dal metabolismo larvale. Questa inibizione è stata osservata già a rilevanza ambientale concentrazioni di TBT. Tali risultati illustrano ulteriormente il potenziale del dosaggio GRIZLY nella rilevazione degli effetti composti a base di inter-organo di cross-talk e metaboliche modifiche dei composti nell&#39;animale vivo. Essi sottolineano anche la potenziale applicazione del test GRIZLY per il monitoraggio ambientale. Così, effetti interferenti endocrini possono essere studiate a livello di segnale del recettore, in cui il disgregatore interferisce con l&#39;attività di segnalazione GC indotta da un agonista GR come desametasone. Un&#39;altra possibilità è quella di studiare gli effetti composti su pregnenolone stimolata sintesi GC. L&#39;alta qualità rendimento del saggio dovrebbe consentire un rapido screening delle librerie di campioni ambientali. L&#39;uso di luciferasi come argene eporter consente un elevato range dinamico di rilevazione di attività di segnalazione 23. In effetti, la sensibilità del test permette di rilevare osmotica indotta da stress produzione GC dal singolo larve 18. La risoluzione temporale massimo raggiunto con il reporter luciferasi permette di seguire attività di segnalazione nel tempo, che rende possibile analizzare anche la cinetica dei dati. Un potenziale svantaggio per alcune applicazioni è l&#39;idoneità limitata per il monitoraggio spaziale di questo sistema giornalista. Sistemi reporter fluorescenti potrebbero essere più adatto per saggi che richiedono il monitoraggio di alcune zone delle larve. Tuttavia, tali dosaggi possono soffrire di sensibilità inferiori a causa di effetti di sfondo causati dalla luce di eccitazione, che pone anche limiti al rilevamento di composti fluorescenti. Inoltre, potrebbero fornire la risoluzione cinetica meno a causa della generalmente maggiore stabilità delle proteine ​​fluorescenti 23.Inoltre, essi presentano sfide in termini di apparecchiature di imaging, analisi dei dati e l&#39;archiviazione dei dati che potrebbero limitare il loro utilizzo per i laboratori di ricerca più piccoli. Il set-up del test GRIZLY come un saggio basato micropiastra consente una facile integrazione nei flussi di lavoro di screening tipici. Il saggio è facilmente applicabile anche nei laboratori di ricerca più piccoli grazie alla sua semplicità d&#39;uso e l&#39;analisi dei dati. Allo stesso tempo, permette un notevole grado di automazione, ad esempio automatizzato applicazione della droga pipettando robot o la distribuzione automatizzata di embrioni da embrioni ordinamento dispositivi 24,25. La semplice lettura non richiede microscopi automatizzati di screening o sofisticato software di analisi delle immagini, ma offre un ricco insieme di dati su aspetti temporali e quantitativi della via di segnalazione studiato. In sintesi, presentiamo un protocollo passo-passo per un saggio relativamente poco costoso, robusta e facile da maneggiare lo screening chimico per GCsegnalazione attività in vivo e in tempo reale. Il test permette la determinazione degli effetti in vivo di composti su GC segnalazione non rilevabile in coltura cellulare saggi basati. Tra le tante applicazioni per il dosaggio sono ad esempio la determinazione degli effetti genetici sulla segnalazione dei glucocorticoidi, il monitoraggio ambientale degli effetti interferenti endocrini sulla sintesi glucocorticoide e segnalazione di attività, e lo screening di composti per gli effetti indesiderati sulla segnalazione GC o per l&#39;romanzo modulatori vivo di questo importante via di segnalazione.

Glucocorticoidi (GC) sono ormoni steroidei prodotti dalla ghiandola surrenale che svolgono ruoli importanti durante la risposta allo stress e nella regolazione del metabolismo 1. GC legano citoplasmatici recettori glucocorticoidi (GRS) della superfamiglia dei recettori nucleari che, in seguito al legame, traslocare nel nucleo 2. Qui, si possono per esempio reprimere la trascrizione interferendo con altri fattori di trascrizione (transrepression) o attivare la trascrizione genica attraverso elementi glucocorticoidi risposta (gres, transattivazione). A causa delle loro proprietà anti-infiammatorie, GC sia naturali che artificiali sono ampiamente utilizzati farmaci nel trattamento di una serie di malattie, come l&#39;asma o artrite 3. Tuttavia, in particolare l&#39;uso a lungo termine di GC può portare a gravi effetti collaterali, tra cui il diabete e glaucoma 4. Pertanto, nuovi composti destinati GC segnalazione con efficienza di trattamento potenzialmente più vantaggioso e tollerabilità sono molto ricercati poppaER. Importante, effetti ligando osservati in cellule in coltura possono differire da quelli osservati in vivo 5. Tali effetti potrebbero risultati polarizzazione ottenuti con colture cellulari convenzionali basati test di screening farmaceutiche. Chimica in vivo screening abilitato dal modello zebrafish ha recentemente venuto a fuoco, in quanto consente la determinazione degli effetti non rilevabili in coltura cellulare 6,7. Vie di segnalazione ormonali possono anche essere influenzati da inquinanti ambientali. I cosiddetti interferenti endocrini (IE) influiscono vari ormone regolamentato processi 8. Quindi, la riproduzione e la differenziazione sessuale degli organismi acquatici possono essere modulate sostanze con attività estrogeno-simile. Recentemente, sono state espresse preoccupazioni che i disturbi metabolici potrebbero essere collegati agli IE nell&#39;ambiente 9. Una via di mira da tale &quot;disturbo metabolico&quot; è la via glucocorticoide, che è stata anche implicata nella xenoBiotics effetti sullo sviluppo e la funzione immunitaria 10,11. Tuttavia, rispetto alla grande quantità di informazioni disponibili sui composti che interferiscono con il sesso steroide azione ormonale, relativamente poco si sa circa gli effetti endocrini perturbazione mediati attraverso il GR. Pertanto, sono necessari strumenti che permettono di monitorare gli effetti degli inquinanti sulla segnalazione GC in vivo. Il pesce zebra è stata a lungo un modello popolare in biologia dello sviluppo e più recentemente ha attirato anche ricercatori di altri campi, tra cui endocrinologia 12. Rispetto ad altri teleostei, il sistema di segnalamento GC di zebrafish è più simile a quello dei mammiferi, poiché il genoma zebrafish contiene soltanto un gene GR rispetto ai recettori ripetuto in molte altre specie ittiche 13-15. Inoltre, l&#39;asse ipotalamo-ipofisi-surrene è già funzionale da 5 giorni di età larve zebrafish, che aumentano la produzione endogena GC in risposta a stress 14,16-18. Recentemente abbiamo generato una linea transgenica zebrafish, GRE: Luc, che consente il monitoraggio di attività di segnalazione GC in vivo e in tempo reale 18. La linea porta un gene reporter luciferasi costrutto sotto il controllo di un promotore minimo TATA box e quattro GRE concatemerized (Figura 1A). GC bioluminescenza indotta può essere misurata dal singolo GRE: Luc larve in piastre da 96 pozzetti microtiter in vivo per periodi di tempo prolungati. Questo test GRIZLY (per &quot;glucocorticoidi Responsive In vivo Zebrafish Luciferase attività&quot;) può essere utilizzato in una serie di campi di ricerca diversi, come la ricerca stress, monitoraggio ambientale, e le schermate farmacologici 18. Siamo stati in grado di rilevare la crescita endogena di cortisolo dopo stress osmotico dal singolo larve e potuto seguire la maturazione della risposta durante lo sviluppo. Inoltre, abbiamo potuto monitorare gli effetti sulla segnalazione GC di composti organostannicis che richiedono metabolizzazione dalla larva. È importante sottolineare che la linea era in grado di rilevare questi effetti a concentrazioni rilevanti per l&#39;ambiente. Infine, in una schermata pilota il saggio sensibile e specifico rilevato composti con attività GC da una libreria chimica, compreso un composto che stimola la produzione di cortisolo endogeno nelle larve. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per schermi chimici utilizzando il test GRIZLY.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer composition + reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved drug library</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiprobe II</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>8 channel, equipped with disposable tip adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquidator 96</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
 <td></td>
			<td>hand-operated 96-channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision XCite Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasticware + consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Storage Plate</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0765</td>
			<td>round well, 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover films,</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>6018412</td>
			<td>self adhesive, DMSO resistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
			<td>LRF-200L</td>
			<td>for liquidator 96, 200 &#956;l, low retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005299</td>
			<td>white opaque 96-well microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Labels</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1608182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered polypropylene IsoTip pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>S058.4809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRE:Luc fish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-120920-1</td>
			<td>available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system

Ormoni dello stress glucocorticoidi e loro derivati ​​artificiali sono ampiamente utilizzati farmaci per trattare l&#39;infiammazione, ma il trattamento a lungo termine con glucocorticoidi può portare a gravi effetti collaterali. Sistemi di test sono necessari per cercare nuovi composti che influenzano segnalazione glucocorticoide in vivo o per determinare gli effetti indesiderati dei composti sulla via di segnalazione glucocorticoide. Abbiamo stabilito un saggio zebrafish transgenico che permette la misurazione delle attività di segnalazione glucocorticoide in vivo e in tempo reale, l&#39;analisi GRIZLY (glucocorticoidi Responsive In vivo Zebrafish Luciferase attività). Il saggio basato luciferasi-rileva gli effetti sulla segnalazione glucocorticoide con elevata sensibilità e specificità, inclusi gli effetti di composti che necessitano di metabolizzazione o influenzano la produzione di glucocorticoidi endogeni. Presentiamo qui un protocollo dettagliato per lo svolgimento di schermi chimici con questa analisi. Descriviamo acquisizione dati, la normalizzazione, eanalisi, ponendo un focus sul controllo di qualità e la visualizzazione dei dati. Il saggio fornisce una semplice, risolta in tempo, e quantitativa lettura. Può essere utilizzato come una piattaforma stand-alone, ma è anche facilmente integrato in high-throughput screening dei flussi di lavoro. Esso permette inoltre per molte applicazioni al di là di screening chimico, come ad esempio il monitoraggio ambientale di interferenti endocrini o di ricerca stress.

In una pubblicazione precedente 18, abbiamo proiettato una libreria di 640 farmaci approvati dalla FDA in una schermata pilota per valutare le prestazioni del dosaggio GRIZLY. Questa biblioteca conteneva 12 bona fide GC, consentendo in tal modo di determinare le misure di qualità per la sensibilità e la specificità del test. La Figura 2 mostra esempi tipici di analisi dei dati grezzi e la normalizzazione preso da questa schermata. Un tipico risultato di un controllo desametasone bene è illustrato nella figura 2a, che illustra l&#39;informazione temporale indicata dai dati. Un picco in bioluminescenza che avviene a circa 12 ore dopo il trattamento diminuisce lentamente sopra il seguente 36 ore di misurazione. Figura 2a &#39;evidenzia l&#39;approssimazione del valore AUC utilizzando il metodo trapezoidale. Questo calcolo avviene per tutti i pozzetti e ogni ripetizione tecnica. Il risultato della trasformazione logaritmica è mostrata nelle figure 2b &lt;/ Strong&gt; e b &#39;. Qui la media dei controlli positivi tracciati in un normale trama QQ. Log trasformazione porta ad una maggiore ravvicinamento dei punti dati ai valori teorici normalmente distribuiti indicate dalle diagonali rosse. Una trasformazione per ottenere normalità dei dati aumenta la potenza statistica delle analisi successive. Infine, figure 2c e 2c &#39;mostrano l&#39;effetto della robusta Z-score normalizzazione sulla variabilità piastra-to-plate: I diversi valori basali ottenuti con diversi piatti (Figura 2c) sono normalizzati nel robusta trama Z-score in figura 2c&#39;. I valori di Z-score robusti possono essere usate per identificare gli errori sistematici nei dati visualizzando la distribuzione dei risultati attraverso le piastre. Figura 3a mostra un esempio di una mappa termica di un piatto biblioteca, in cui il robusto Z-score valUES vengono tracciate color-coded nelle posizioni pure. Un identifica facilmente colonna 12 con i controlli positivi in ​​piastra. Composti biblioteca segnare positivi sono visti in F8 bene e, anche se debole, E2. Figura 3b mostra una piastra in cui è presente un errore sistematico. Si osserva una serie di composti con valori decrescenti Z-score nelle righe A ed E su più colonne. Nessuno dei composti in questi pozzetti è stato testato positivo nel re-test. Poiché i pozzetti con questa diminuzione dell&#39;attività prova GRIZLY sono collocati lungo il percorso del robot pipettaggio assume quando si dispensa le piastre di libreria, questo modello è indicativo di riporto di un composto positiva durante il processo di pipettaggio automatizzato. Il robusto Z-score normalizzazione unitamente alla presenza di GC conosciuti nella biblioteca inoltre ha permesso di calcolare un ricevitore caratteristica (ROC) curva operativa per lo schermo 18. Figura 3C mostra un grafico della stimaaccoppiato vero tasso positivo contro il tasso di falsi positivi stimato per diversi valori di cut-off robusti Z-score. Il vero tasso positivo stimato è definita come la percentuale di veri risultati positivi (qui, i glucocorticoidi noti presenti in biblioteca) che si trovano in un robusto determinato Z-score valore di cut-off. Il corrispondente tasso di falsi positivi stimato indica la percentuale di composti non positive colpito di questo valore di cut-off. L&#39;AUC di questa curva è 0,95, indicando una elevata sensibilità e specificità dello schermo e eccellenti prestazioni dell&#39;analisi. La curva AUC è stato utilizzato anche per stimare il valore di cut-off ottimale per l&#39;identificazione hit di calcolo dell&#39;indice Youden per i diversi punteggi Z robuste. Abbiamo identificato il robusto Z-score di 1.49 ad avere il più alto indice Youden. Questo valore cut-off è indicata in Figura 2c &#39;come una linea nera che separa i colpi dalla maggior parte dei composti. Nel nostro schermo18, siamo stati in grado di identificare GC quasi tutte le note presenti in biblioteca. Solo non sono stati individuati tre dei 12 CV in buona fede. Nel caso di acetato di melengestrolo, questo era un falso risultato negativo, poiché questo composto è risultato positivo nella ri-prova a una concentrazione superiore a quella utilizzata nella libreria. Gli altri due GC erano negativi anche nella ri-prova. Corticosterone è il principale GC nei roditori, ma non nei pesci o esseri umani 1, mentre il prednisone profarmaco potrebbe non essere metabolizzato bene dal sistema larvale. È interessante notare, inoltre due farmaci non annotati come GC sono stati identificati nello schermo, di cui non si poteva essere confermate nel re-test (spironolattone, un antagonista del recettore dei mineralcorticoidi). L&#39;altro composto, pregnenolone, è un precursore nella biosintesi di steroidi, che viene convertito in cortisolo da parte della ghiandola surrenale. Infatti, il trattamento con pregnenolone stimolato la produzione di cortisolo nelle larve 18. Tutti questi risultati confermano l&#39;elevata performance del dosaggio: solo un falso negativo e un composto falso positivo sono stati tra i risultati dello schermo primario e 10 dei 11 composti confermati con segnalazione GC stimolare l&#39;attività sono stati già individuati nella schermata principale. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig1.jpg" /> Figura 1. Principio generale del dosaggio e del flusso di lavoro della procedura di screening. A) Schema del saggio GRIZLY costrutto reporter. Luciferasi (giallo) espressione è controllata da un promotore minimo (P min, arancione) e quattro elementi concatemerized GRE ((GRE) 4, bianco), che sono vincolati da ligando-attivati ​​GR omodimeri (GR, blu). Scatole rosse indicano i siti transposase Tol2 che facilitano l&#39;integrazione del costrutto nel genoma. La scatola rosa rappresenta un sito di poliadenilazione (pA). Larve transgenici portatori questo contestostruct sono collocati in opachi piastre da 96 pozzetti microtiter per le misure di bioluminescenza. b) Schema della reazione luciferasi. Luciferasi catalizza l&#39;ossidazione della luciferina a oxyluciferin, che porta ad emissione di luce (hv). La reazione richiede anche ATP e Mg 2 +, che è fornito dalle larve. PP i, pirofosfato. C) Workflow dello schermo. Lavoro archivi diluizioni sono preparate da un farmaco approvato dalla biblioteca di droga in piastre da 96 pozzetti, una colonna contenente un negativo entro piastra di controllo (solo DMSO, verde) e una colonna contenente un controllo positivo (desametasone, rosso) (Design Library). GRE: Luc larve sono distribuiti in piastre da 96 pozzetti (5-11 replicati) e trattato con i composti della biblioteca (Drug Application). Bioluminescenza tracce sono registrati con un lettore di bioluminescenza per due giorni (raccolta dei dati). Bioluminescenza tracce sono integrati (calcoli AUC), log-trasformati e robusto Z-score normalizzati (Normalizione). Dati normalizzati vengono utilizzati per determinare i parametri di qualità e per l&#39;identificazione hit (analisi dei dati). Colpi scelti sono sottoposti nuovamente al test per l&#39;attività dose-dipendente nel saggio (retest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi dei dati illustrato con i dati di uno schermo di un approvati dalla FDA libreria del medicamento. a) traccia rappresentativa da un controllo positivo. a &#39;) L&#39;area sotto la curva (AUC) è approssimata con la regola trapezoidale. I trapezi usati per il calcolo sono riportati in diverse tonalità di rosso. B) Normal QQ plot dei valori grezzi AUC dei pozzetti di controllo positivi (asse y) vs una popolazione normale (asse x di serie) prima trasformazione logaritmica. B &#39; )<html> Normal QQ plot dei valori di AUC dopo trasformazione logaritmica. Una distribuzione normale è indicata dalla linearità dei log trasformato punti dati. C) Appezzamento di log trasformato dati grezzi per tutti i composti testati nella schermata. Blu, bona fide glucocorticoidi,. Grigio, tutti gli altri composti c &#39;) Terreno di dati schermo dopo robusto Z-score normalizzazione. Errori sistematici come le variazioni inter-piastra sono stati rimossi dai dati. Le linee rosse indicano la media ± SEM di positivi controlli all&#39;interno della piastra. Linea nera: colpire valore di cut-off di identificazione come determinato dalla ottimizzazione Youden-Index (Figura 3). Riprodotto con il permesso dal 14 maggio 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 0439fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Risultati dello schermo. a) Heatmap dei risultati dello schermo. Robusti valori Z-score di composti biblioteche sono riportati nelle rispettive posizioni pure. I controlli positivi nella colonna 12, nonché due composti hit positivi in pozzi F8 e E2 sono visibili. B) Heatmap di una placca con riporto di un composto positiva durante la preparazione biblioteca con un robot pipettaggio. Un gradiente di attività è visibile lungo il percorso pipettaggio presa dal robot. C) Ricevitore caratteristica ROC) curva (operante per lo schermo. I veri tassi stimati positivi (sinistra asse y) e tassi di falsi positivi (asse x) sono tracciate per valori crescenti di cut-off robusti Z-score (codice colore, a destra dell&#39;asse y). Il valore AUC della curva risultante è vicino a 1, indicando buone prestazioni dell&#39;analisi. Riprodotto con il permesso 14, 2012 ACS. D) tavolo mostrando composti attivi (yellow) o inattivo (blu) nella schermata principale (prim.) o nel ripetere il test. glucocorticoidi Bona fide non sono sempre stati riesaminati (bianco). Ridisegnato con il permesso 14, 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> Impostazioni generali: </td></tr><tr><td colspan="4"> Passo 1.1 </td></tr><tr><td> Procedura </td><td> Tipo: </td><td colspan="2"> unico liquido </td></tr><tr><td></td><td> Modalità: </td><td colspan="2"> spegnere </td></tr><tr><td></td><td> dispensa per aspirare: </td><td colspan="2"> 1 </td></tr><tr><td></td><td> ottimizzare la velocità: </td><td colspan="2"> Sì </td></tr><tr><td></td><td> traferri sistema: </td><td colspan="2"> 10 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> Trasporto: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td> Flush / Wash </td><td colspan="3" width="426"> No </td></tr><tr><td> Aspirare </td><td> Tipo di impostazione </td><td> Valore </td><td> Osservazioni </td></tr><tr><td></td><td> Posizione </td><td> B7, B10, B13, B16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirare vol. </td><td> 10 microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocità </td><td> 200 microlitri / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Monitoraggio Liquid </td><td> 60% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirare Altezza </td><td> Predefinito Labware </td><td> 22.28 </td></tr><tr><td> Dispensare </td><td> Tipo di impostazione </td><td> Valore </td><td> Osservazioni </td></tr><tr><td></td><td> Posizioni </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispensare vol. </td><td> 10 microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocità </td><td> 200 microlitri / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Monitoraggio Liquid </td><td> 100 microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispensare Altezza </td><td> Predefinito Labware </td><td> 17.01 </td></tr><tr><td colspan="4"> Passo 1.2 </td></tr><tr><td> Procedura </td><td> Tipo: </td><td colspan="2"> reagente </td></tr><tr><td></td><td> Modalità: </td><td colspan="2"> di scarto </td></tr><tr><td></td><td> dispensa per aspirare: </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td></td><td> ottimizzare la velocità: </td><td colspan="2"> Sì </td></tr><tr><td></td><td> traferri sistema: </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 15 ml </td></tr><tr><td></td><td> Trasporto: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Flush / Wash </td><td colspan="2"> No </td></tr><tr><td> Aspirare </td><td> Tipo di impostazione </td><td> Valore </td><td> Osservazioni </td></tr><tr><td></td><td> Posizione </td><td> A4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirare vol. </td><td> 3 x 490 ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Traferri </td><td> 15 e 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocità </td><td> 200 microlitri / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Monitoraggio Liquid </td><td> 400% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirare Altezza </td><td> Superficie del liquido </td><td></td></tr><tr><td> Dispensare </td><td> Tipo di s<html> Etting </td><td> Valore </td><td> Osservazioni </td></tr><tr><td></td><td> Posizione </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispensare vol. </td><td> 490 microlitri </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Traferri </td><td> 15 e 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Velocità </td><td> 200 microlitri / sec </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Monitoraggio Liquid </td><td> 100% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dispensare Altezza </td><td> Predefinito Labware </td><td> 17.01 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Impostazioni per Multiprobe II. Il protocollo nella tabella 1 descrive la preparazione di 4 piatti (ogni 96 pozzetti). Le piastre sono situate adattatori piastra nella zona di lavoro in posizioni specificato dal robot (es. B7, B10, B13, B16). <html> 1 &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="4"> Impostazioni generali: </td></tr><tr><td colspan="2"> Numero di ripetizioni di analisi </td><td colspan="2"> dipende dalla lunghezza della corsa </td></tr><tr><td colspan="2"> Numero di piastre </td><td colspan="2"> illimitato </td></tr><tr><td colspan="2"> Controllo della temperatura </td><td colspan="2"> 28 ° C </td></tr><tr><td colspan="2"> Protocollo </td><td colspan="2"> Calcoli </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> US Lum 96 (cps) leggi </td></tr><tr><td></td><td> Tempo di misura </td><td> 2,5 sec </td><td rowspan="3"> Correzione Crosstalk </td></tr><tr><td></td><td> Distanza tra piastra e rivelatore </td><td> 0 millimetri </td></tr><tr><td></td><td> Glow (CT2) fattore di correzione </td><td> 0% </td></tr></tbody></table>contenuto &quot;&gt; Tabella 2. impostazioni Envision utilizzate per lo schermo.

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A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System | Biology  | Video

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Descriviamo la procedura e analisi dei dati di un sistema di screening chimico per la segnalazione ormone dello stress glucocorticoide con larve di zebrafish: il Responsive dosaggio glucocorticoidi In vivo Zebrafish Luciferase attività (GRIZLY). Il test con sensibilità e in particolare rileva gli effetti sulla segnalazione glucocorticoide da composti che necessitano di metabolizzazione o influenzano la produzione di glucocorticoidi endogeni.

Una procedura di screening chimico per glucocorticoidi segnalazione con un reporter del sistema Zebrafish Larva Luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

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11.8K Views.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus North.  Descriviamo la procedura e analisi dei dati di un sistema di screening chimico per la segnalazione ormone dello stress glucocorticoide con larve di zebrafish: il Responsive dosaggio glucocorticoidi In vivo Zebrafish Luciferase attività (GRIZLY). Il test con sensibilità e in particolare rileva gli effetti sulla segnalazione glucocorticoide da composti che necessitano di metabolizzazione o influenzano la produzione di glucocorticoidi endogeni. 

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Ricerca

Biologia

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA Catalyst come reporter per lo screening dei farmaci contro l&#39;RNA Editing in tripanosomi

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...