Introduzione I microRNA sono emersi come importanti regolatori dell&#39;espressione genica che modulano l&#39;attività di molti importanti processi biologici. Con più di 700 miRNA umane individuate finora 1, non è sorprendente che le mutazioni e la regolazione impropria di miRNA sono stati collegati a una varietà di disturbi fisiologici come il cancro e malattie cardiache 2,3. Recenti studi hanno dimostrato che la maggior parte dei miRNA siti di regolamentazione vincolanti, sono in 3&#39;UTRs 4,5, e alcuni ricercatori hanno stimato che ci sono centinaia di obiettivi per miRNA nella cella 6. Data l&#39;importanza biologica dei miRNA, il gran numero di miRNA che esistono e il gran numero di obiettivi per ciascuno di essi, è fondamentale che i ricercatori sono in grado di identificare in maniera semplice bersagli dei miRNA endogeni, preferibilmente su piattaforme suscettibili di high-throughput studi. Mentre utilizzando strumenti di calcolo come miRBase, TargetScan e PicTar 1,6,7 è un potente mezzo per generare liste di putativi mRNA target per qualsiasi miRNA, le previsioni non sono ancora sufficientemente accurata per essere fatta valere solo 8. Pertanto, i ricercatori leva anche una serie di approcci sperimentali per identificare gli obiettivi de novo o per convalidare obiettivi previsti. Molte squadre hanno fatto affidamento su high-throughput misure di steady-state i livelli di mRNA o proteina per identificare i geni per i quali cambia espressione quando l&#39;attività miRNA è turbato 4,9,10. Tali cambiamenti sono senza dubbio biologicamente significative e rappresentano un primo passo importante, tuttavia misurando i cambiamenti nell&#39;espressione generale non distingue tra effetti diretti di una miRNA in una trascrizione e gli effetti indiretti o di segnalazione a valle. Altri potenti strumenti che forniscono la prova diretta miRNA-mRNA interazioni sono cromatina-immunoprecipitazione (ChIP) strategie che cross-link Argonaute proteine ​​(e quindi il complesso RISC) di miRNA e mRNA, pur individuando i partner interagiscono non immediatamente indicano gli effetti funzionali di un evento così vincolante 5,11. Così, 3&#39;UTR-reporter test che forniscono prove funzionali per effettuare un miRNA su un particolare UTR sono diventati una componente importante di uno studio approfondito miRNA. Tali cell-based dei dati di analisi insieme con le previsioni obiettivo computazionali o espressione e di proteomica dati dimostrano chiaramente che una 3&#39;UTR particolare è direttamente regolata dal miRNA di interesse. In un 3&#39;UTR-reporter test, il 3&#39;UTR di un gene di interesse si fonde alla fine di un gene reporter luciferasi. Se il 3&#39;UTR è un obiettivo di un miRNA, la stabilità trascrizione giornalista e / o la sua efficienza traduzione cambierà con variazione della concentrazione di miRNA funzionale. Quindi, a differenza di trascrizione di solo test basato, saggi reporter di aiutare a identificare gli effetti su entrambi mRNA stato stazionario e livelli di proteine. Reporter sistemi possono essere utilizzati anche per studiare gli effetti funzionali di mutagenizing un sito putativo miRNA vincolante in un 3&#39;UTR per confermare che è davvero necessario per la interaction8. E mentre studi su larga scala l&#39;utilizzo di matrici di espressione, le tecniche di proteomica, e ChIP Argonaute forniscono preziosi genome-wide dati per un piccolo numero di condizioni sperimentali, saggi di giornalista a base di cellule sono le più suscettibili di scaling up per lo studio dei microRNA-3 &#39; interazioni UTR in centinaia o migliaia di condizioni che dovessero rendersi necessarie per high-throughput screening di molecole di piccole dimensioni o altre librerie basate effettori. Molti scienziati hanno applicato la tecnologia di analisi giornalista allo studio dei miRNA-3&#39;UTR interazioni. Tuttavia, con l&#39;idea che i microRNA molte centinaia ogni bersaglio di diverse trascrizioni, è stato difficile per i ricercatori di utilizzare questo approccio potente su un high-throughput scala perché passi la clonazione, la validazione e l&#39;ottimizzazione per la creazione di migliaia di differenti 3&#39;UTR- vettori giornalista sono spesso dei costi proibitivi. Nel tentativo di fare piccole e grandi dimensioni 3&#39;UTR-reporter studi accessibile a qualunque ricercatore, abbiamo creato un genoma raccolta di 3&#39;UTRs umano clonato in pre-altamente ottimizzato sistema di analisi LightSwitch luciferasi. Il sistema include anche giornalista vettori di controllo convalidati, un insieme di oltre 700 costruzioni giornalista bersaglio miRNA sintetici da utilizzare come controlli positivi, e una serie di protocolli sperimentali standardizzati. Utilizzando il seguente protocollo, si può chiedere se un particolare 3&#39;UTR umano è un obiettivo del miRNA di interesse. Le fasi critiche in questo flusso di lavoro sono disegno sperimentale, trasfezione di costrutti reporter e imita miRNA, saggi di luciferasi giornalista, e l&#39;analisi dei dati. Per la progettazione sperimentale, è importante pensieroso selezionare una linea transfectable cellulare, costruisce giornalista sperimentale e di controllo, e mima miRNA e non-selezione dei controlli. Comune altamente transfectable adhlinee cellulari erenti come HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, e gli altri spesso funzionano bene con questo protocollo. Note importanti sul design sperimentale Il sistema di dosaggio LightSwitch luciferasi è un sistema giornalista completamente ottimizzato che include costruisce GoClone utilizzando il gene della luciferasi RenSP e reagenti LightSwitch luciferasi. Utilizzare tutti i componenti del sistema LightSwitch come raccomandato per ottenere risultati di test reporter. Co-trasfezione di oligo / plasmidi con Quadri costruisce giornalista GoClone riduce complessivamente i segnali luciferasi in modo non specifico modo. Pertanto, è importante eseguire le combinazioni di trasfezione seguenti: solo giornalista, reporter + non-targeting miRNA controllo e giornalista + miRNA specifici. Il nostro vettore empty_3UTR (promotore forte, non UTR) offre un altissimo livello di segnale luciferasi e serve come controllo positivo per l&#39;efficienza di trasfezione, e un sintetico obiettivo vettore miRNA giornalista può servire come controllo positivo per imitare l&#39;attività. Inoltre, si consiglia di utilizzare i comandi 3&#39;UTR GoClone pulizia e controlli casuali per separare con precisione la sequenza-specifica vs effetti non specifici. Studiare il protocollo e, quando possibile fare Master Mix per diminuire la variabilità dei dati a causa di errori di pipettamento o evaporazione. Questo protocollo utilizza DharmaFect reagenti di trasfezione Duo (Dharmacon). Giorno 1 SUGGERIMENTO IMPORTANTE: Scegli la tua linea cellulare con saggezza. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una linea cellulare che è noto per essere transfectable. Abbiamo anche trovato che la risposta misurabile di una 3 &#39;UTR giornalista ad un miRNA imitare è attenuato in linee cellulari con alti livelli endogeni di quel particolare miRNA. Se non si sa quanto miRNA la tua linea cellulare esprime, prova a bersaglio sintetico microRNA SGG, che misura indirettamente l&#39;abbondanza di un miRNA particolare in una cella, nonché informare l&#39;utente circa la gamma dinamica della propria analisi. 1. Semi di cellule per produrre confluenza ≥ 80% al momento della trasfezione. <ol><li> Celle di semi in una piastra a 96 pozzetti bianco TC in 100μl volume totale. </li><li> In parallelo, semi di un numero adeguato di cellule in una piastra chiaro a 96 pozzetti per la valutazione della confluenza. </li></ol> SUGGERIMENTO IMPORTANTE 1: Confluence è la chiave per ottenere buoni risultati in un esperimento imitare. Per knockdown ottimali, le cellule devono essere al 100% confluenti al momento della trasfezione. IMPORTANTE SUGGERIMENTO 2: Utilizzare le cellule passaggio basso per ottenere i migliori risultati. Le cellule che sono stati diversi passaggi troppe volte tendono a fornire dati di trasfezione rumorosi. 2 ° giorno Preparare costruisce GoClonereporter e miRNA, poi trasfezione nelle cellule confluenti. 2. Preparare Costruisce <ol><li> Scongelare costruisce GoClone (DNA plasmide) a temperatura ambiente. Mescolare bene. </li><li> Centrifuga per rimuovere condensa dal tappo. </li></ol> 3. Preparare Micro RNA <ol><li> MicroRNA disgelo (imita specifiche e non-targeting controlli) a temperatura ambiente e centrifugare per rimuovere condensa dai tappi. </li><li> Diluire a una concentrazione di lavoro di 2 mM in acqua RNase-free. </li></ol> Oltre a una miRNA sperimentale imitare sempre una non-targeting controllo miRNA. Co-trasfezione un plasmide e di un piccolo RNA oligo porta ad abbassare il segnale di trasfezione il plasmide da solo. Includere uno o più controlli positivi. Considerare l&#39;utilizzo di una delle centinaia di vettori sintetici giornalista bersaglio miRNA nel catalogo della SGG. Includere uno o più controlli negativi o non specifici. SGG ha una serie di controlli tra cui UTRs 3 &#39;di geni housekeeping, frammenti casuali e / o il vuoto (senza inserire UTR) di controllo. L&#39;uso di uno o più di questi controlli a fianco una costruzione sperimentale vi permetterà di normalizzare eventuali effetti attribuibili alla sovraespressione del miRNA specifici o il controllo non-targeting non specifici. 4. Preparare trasfezioni <ol><li> Per ogni trasfezione combinare i seguenti reagenti per un singolo test: </li></ol> Miscela 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Individuale GoClone giornalista: </td><td> 3,33 microlitri </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> Varia * </td></tr><tr><td> Senza siero media: </td><td> a 10 L </td></tr></tbody></table> * Concentrazione efficace di miRNA può variare da 10 nM-100 nM. Consultare il produttore miRNA per la concentrazione adeguata. SUGGERIMENTO IMPORTANTE: non aggiungere troppo imitare. Una gamma ragionevole per simulare le concentrazioni di 10-50 nM è nella reazione finale 100uL. Eseguire almeno tre replicatrasfezioni te per ogni trattamento / combinazione UTR e comprendono il volume supplementare per consentire pipettaggio errore. Per esempio, moltiplicare i volumi di reazione solo del 3,5 per ottenere mix abbastanza trasfezione per 3 pozzi trasfezione replicare anche extra per pipettaggio errore o evaporazione. Per ogni giornalista, istituito replica per le seguenti: solo giornalista, reporter + non-targeting miRNA controllo e giornalista + miRNA specifici. Impostare trasfezioni per il microRNA targeting, allo stesso tempo quelli per un controllo non-targeting. <ol start="2"><li> Portare a DharmaFECT DUO (Dharmacon) miscela come segue per ogni trasfezione: </li></ol> Miscela 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 microlitri </td></tr><tr><td> I livelli di free media: </td><td> 9,85 microlitri </td></tr></tbody></table> La quantità di DharmaFECT Duo da aggiungere può essere linea cellulare dipendente. Gli importi sopra indicati sono adatti per le cellule HT1080. Consultare la documentazione del produttore per determinare l&#39;importo adeguato per la linea cellulare. Suggerimento: Fare una miscela di grandi dimensioni trasfezione moltiplicando i volumi sopra per il numero di giornalisti, il numero di repliche e il numero di miRNA da testare. Nel calcolare la quantità di miscela di trasfezione per preparare, essere sicuri di includere una piccola quantità in più per tenere conto di pipettaggio errori ed evaporazione. <ol start="3"><li> Lasciare il composto Duo DharmaFECT ad incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Dopo 5 minuti, aggiungere 10μL della miscela Duo DharmaFECT (Miscela 2) a ciascuna provetta preparato di 10uL plasmide e / o miRNA (miscela 1). Ogni tubo deve quindi contenere un volume di 20μL per trasfezione replicare. </li><li> Incubare ciascun impasto per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 20 minuti, aggiungere 80 ml di pre-riscaldato (37 ° C), antibiotico-media liberi, completa per replicare ad ogni provetta per un totale di 100μL per trasfezione replicare. Un profondo pozzo blocco può essere utilizzato per la preparazione di molte repliche e campioni simultaneamente. Miscelare la soluzione pipettando su e giù. </li><li> Rimuovere la piastra seminata dal termostato. Verificare che le cellule sono almeno l&#39;80% confluenti. </li><li> Con attenzione pipetta fuori i media da ogni pozzetto. </li><li> Aggiungere 100μL della miscela di trasfezione (20 ul DNA / reagente mix + 80uL media) in ciascun pozzetto. </li><li> Piastra posto in incubatrice durante la notte. </li></ol> Non troppo incubare. La maggior parte imita produrrà risultati significativi sulla buona fede obiettivi entro 24 ore. Il livello di repressione misurabile in 48 ore può essere maggiore, ma così il bene alla variabilità bene. Mimic esperimenti sono più facili esperimenti inibitore. Mentre la maggior parte imita in modo significativo reprimere i veri bersagli entro 24 ore, significative de-repressione attribuibili al inibitore può richiedere fino a 48 ore per essere misurabili e sarà quasi sempre meno pronunciata che l&#39;effetto della mimica. 3 ° giorno Nota: saggi di luciferasi può essere effettuata immediatamente o le piastre possono essere congelati a -80 ° C (congelamento generalmente aumenta la lisi cellulare e il segnale luciferasi). Congelare e scongelare le cellule prima del dosaggio per i migliori risultati. RICORDATEVI di lasciare congelata scongelare le cellule a temperatura ambiente prima di aggiungere reagenti saggio LightSwitch. 5. Misurare l&#39;attività luciferasi con AssayReagents LightSwitch <ol><li> Rimuovere la piastra da incubatore e portare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare reagenti LightSwitch (per kit LS010, protocolli di dimensioni altro kit si possono trovare online): <ol><li> Substrato ricostituire 100X con l&#39;aggiunta di 100μL di substrato solvente al tubo del substrato saggio liofilizzato. Esporre alla luce e minimizzare i tempi a temperatura ambiente. Substrato 100X possono essere conservati a-20C per 2-3 settimane. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare substrato appena ricostituito. </li><li> Preparare la soluzione di analisi sgelando bottiglia 10 ml di tampone del saggio in bagno d&#39;acqua a temperatura ambiente ed aggiungere 100μL di substrato 100X ricostituito prima dell&#39;uso. Mescolare bene. </li></ol></li><li> Utilizzare un pipettatore multicanale per aggiungere 100μL Soluzione Assay LightSwitch (buffer + substrato) direttamente al bene ciascun campione (contenente 100uL cellule + media) in un piatto bianco da 96 pozzetti. Se le cellule sono state coltivate in un altro piatto o formato fiasco, campioni trasferimento per un piatto bianco da 96 pozzetti in 100μL volume totale (media o PBS). </li><li> Piastra di copertura, al riparo dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Se dosaggio più di un piatto, barcollare aggiunta di una soluzione di analisi in modo che ogni piatto incuba per 30 minuti prima della lettura. </li><li> Leggi ogni bene per 2 secondi in un piatto Luminometer (SpectraMax L o equivalente). </li><li> Calcolare la knockdown calcolando il rapporto luciferasi segnale per ogni costrutto per miRNA specifici sulla non-targeting di controllo (luminescenza = miRNA specifici / non-targeting di controllo). Utilizzare i dati di pulizie, casuale, e costruisce vuoto per controllare di non UTR effetti un trattamento specifico. </li></ol> Rappresentante Risultati Obiettivi 3&#39;UTR in presenza di un miRNA targeting spettacolo knockdown luciferasi. L&#39;atterramento di 3&#39;UTR-luciferasi attività da giornalista let-7 è stata misurata in cellule HT1080 da co-trasfezione 100 ng di ogni giornalista costruire con 20Nm let-7a controllo imitare o non-targeting, incubando per 24 ore, poi leggendo il giornalista luminescenti segnale utilizzando reagenti luciferasi LightSwitch. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. 3&#39;UTRs PUNC e ARID3B umani sono obiettivi del let-7 microRNA. Segnali provenienti dai cronisti 3&#39;UTR umani a PUNC e ARID3B geni sono significativamente abbattute in presenza di let-7 microRNA imitano mentre i segnali per le pulizie e la sequenza casuale UTRs non lo sono.

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Gli autori sono dipendenti di Genomica Quadri che fanno strumenti e reagenti che appaiono in questo articolo. La produzione di questo articolo è stato sponsorizzato da Genomics di comando.

Abbiamo creato un genoma raccolta di pre-umano clonato 3&#39;UTR-reporter costrutti per consentire lo studio di miRNA-3&#39;UTR interazioni nelle cellule viventi. Qui abbiamo dimostrato un metodo riproducibile e high-throughput per la co-trasfezione imita miRNA con 3&#39;UTR-reporter con un sistema luciferasi reporter. Questo metodo si basa sui ricercatori utilizzando un altamente transfectable linea cellulare e conturbante attività miRNA con una tecnica iperespressione. I ricercatori che utilizzano linee cellulari mal transfectable consigliamo di utilizzare il nostro compagno lentivirali 3&#39;UTR-reporter collezione creata in collaborazione con Sigma (Missione 3&#39;UTR GoClones Lenti). Trattando le cellule con miRNA imita i risultati in una sovraespressione di tipo esperimento, e con qualsiasi di questi studi, i ricercatori devono tener conto che questo può o non può rappresentare effettive condizioni fisiologiche. Per rispondere alle preoccupazioni iperespressione, i ricercatori possono usare inibitori miRNA oltre a imita per studiare l&#39;interazione con due diversi tipi di perturbazione 12-14. Una volta che gli obiettivi probabili miRNA vengono identificati, i ricercatori potrebbero voler mutagenize i siti di miRNA putativo vincolante per stabilire se i siti sono necessarie per l&#39;interazione funzionale. Essi possono anche voglia di scalare fino a centinaia di test differenti UTRs potenziale bersaglio (Boutz). Inoltre, se i ricercatori sono interessati se il miRNA sta influenzando la stabilità trascrizione o l&#39;efficienza della traduzione, i dati giornalista luciferasi può essere paragonato a misure di steady-state i livelli di trascrizione. Ogni cambiamento nel segnale luciferasi che non è associato con un cambiamento proporzionale dei livelli di trascrizione punterà a un effetto sulla efficienza della traduzione. Infine, i ricercatori possono usare i vettori reporter di creare una curva dose-risposta per confrontare la sensibilità relativa di UTRs diverse variazioni di concentrazione miRNA 14.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Bianco Tessuto piastre di coltura (96 pozzetti fondo solido) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Chiaro Tissue piastre di coltura (96 pozzetti) con coperchio </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch reagente saggio luciferasi </td><td> Quadri </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Foglio Piastra nastro di tenuta </td><td> E &amp; K scientifico </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Traspirante Piastra nastro di tenuta </td><td> E &amp; K scientifico </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Piastra luminometro </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell&#39;espressione genica e svolgono un ruolo in molti processi biologici. Più di 700 miRNA umani sono stati identificati fino ad ora con ciascuno che fino a centinaia di mRNA bersaglio unico. Strumenti di calcolo, saggi di espressione e la proteomica, e cromatina-immunoprecipitazione tecniche basate fornire indizi importanti per l&#39;identificazione mRNA che sono bersagli diretti di un miRNA particolare. Inoltre, 3&#39;UTR-reporter saggi sono diventati una componente importante di approfonditi studi bersaglio miRNA in quanto forniscono le prove funzionali e quantificare gli effetti di specifici miRNA-3&#39;UTR interazioni in una cella sistema basato su. Per consentire più ai ricercatori di sfruttare 3&#39;UTR-reporter saggi e di sostenere lo scale-up di tali analisi di high-throughput livelli, abbiamo creato un genoma collezione di giornalisti 3&#39;UTR umano luciferasi nel altamente ottimizzato luciferasi LightSwitch test di sistema. Il sistema include anche sintetico miRNA costruisce obiettivo giornalista per l&#39;uso come controlli positivi, diversi costrutti endogeni giornalista 3&#39;UTR, e una serie di protocolli sperimentali standardizzati. Qui si descrive un metodo per co-trasfezione di singoli 3&#39;UTR-reporter costruisce insieme a una mimica miRNA che sia efficiente, riproducibile, e suscettibili di high-throughput analisi.

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Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell&#39;espressione genica e hanno dimostrato di giocare un ruolo in numerosi processi biologici. Per capire meglio miRNA-UTR interazioni, abbiamo creato un genoma collezione di 3 giornalisti UTR luciferasi in coppia con un nuovo gene luciferasi e dosaggio reagenti, il sistema LightSwitch.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

36.0K Views.  SwitchGear Genomics. I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica e hanno dimostrato di giocare un ruolo in numerosi processi biologici. Per capire meglio miRNA-UTR interazioni, abbiamo creato un genoma collezione di 3 giornalisti UTR luciferasi in coppia con un nuovo gene luciferasi e dosaggio reagenti, il sistema LightSwitch.

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studiare Biogenesi della membrana con una luciferasi saggio basato su Reporter Gene

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Ricerca

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenica saggio: cellule aderenti

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Una procedura di screening chimico per glucocorticoidi segnalazione con un reporter del sistema Zebrafish Larva Luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Un test funzionale per Gap giunzionale esame; Elettroporazione di cellule aderenti su indio-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.