Ringraziamo il Dott. Agnes Viale e il MSKCC Genomica Nucleo Laboratorio per l&#39;assistenza tecnica. Questo protocollo è stato sviluppato con il sostegno della Geoffrey Beene Cancer Research Center e dalla Fondazione Farmer famiglia.

1. DNA e Preparazione dei reagenti Nota: Questo protocollo descrive l&#39;elaborazione simultanea e l&#39;analisi di 24 campioni (ad esempio 12 / coppie tumorali normali) ma può essere adattato per lotti piccoli e più grandi. Campioni di DNA possono derivare da FFPE o tessuto fresco congelato, campioni citologici, o di sangue. Tipicamente, entrambi tumore e tessuto normale dello stesso paziente sarà profilata insieme per distinguere mutazioni somatiche da polimorfismi ereditati. Il protocollo inizia immediatamente dopo l&#39;estrazione del DNA. <ol><li> Aliquota 50-250 ng (250 ng consigliato) di DNA estratto per campione, diluito in 1x Tris-EDTA (pH 8.0) tampone ad un volume finale di 50 ml, in provette a fondo sferico separati Covaris. </li><li> Tosare il DNA sullo strumento Covaris E220 presso le seguenti impostazioni di taglio: 360 sec a 10 duty factor, 175 PIP, e 200 cicli per scoppiare. </li><li> Scongelare AMPure Beads XP (Tabella 2) a temperatura ambiente. Scongelare tutti i buffers ed enzimi sul ghiaccio prima del passaggio appropriato. </li></ol> 2. End Module Repair - Preparazione Biblioteca <ol><li> Preparare la master mix riparazione end in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 10 ml di 10x NEBNext End Repair Reaction Buffer (Tabella 2), 5 ml NEBNext End Repair Enzyme Mix (Tabella 2), 35 microlitri di nucleasi sterile libero H 2 O. </li><li> Aliquotare i 50 pl di ciascun DNA tosata in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 ml di riparazione parte master mix pronti a ogni reazione. Incubare in un termociclatore per 30 min a 20 ° C. </li></ol> 3. Messaggio di fine Repair Clean-up <ol><li> Aggiungere il volume 2x (200 ml) di AMPure Beads XP (Tabella 2) per ogni campione e pipettare delicatamente l&#39;intero volume su e giù per 10 volte con una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Posizionare sul supporto magnetico (Tabella 2 </strong&gt;) a temperatura ambiente per 15 minuti fino a quando appare il campione chiaro. </li><li> Rimuovere delicatamente e scartare chiara presa surnatante attenzione a non disturbare perline. Alcuni liquido può rimanere in pozzi. </li><li> Con tubi sul cavalletto, aggiungere lentamente 200 ml di preparato fresco 80% di etanolo per ogni campione e incubare piastra a temperatura ambiente per 30 sec. Con cautela, rimuovere l&#39;etanolo mediante pipetta. </li><li> Ripetere il passaggio 5, per un totale di 2 lavaggi etanolo. Assicurarsi che tutto l&#39;etanolo è stato rimosso. Togliere dal supporto magnetico e lasciare asciugare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Risospendere perle secchi con 44,5 ml sterile H 2 O. Delicatamente, pipetta intero volume su e giù per 10 volte mescolando accuratamente. Assicurare perle sono più attaccati al lato del bene. </li><li> Incubare microsfere in sospensione a temperatura ambiente per 2 min. Posto su supporto magnetico per 5 minuti fino a quando appare il campione chiaro. </li><li> Delicatamente trasferire 42 ml di surnatante trasparente contenente il campione di un nuovo pozzo. La procedura può essere tranquillamente fermato a questo step e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. </li></ol> 4. Preparazione Biblioteca - Modulo dA-tailing <ol><li> Preparare la master mix dA-tailing in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 5 microlitri di 10x NEBNext reazione dA-tailing Buffer (Tabella 2), 3 ml (3&#39;-5 &#39;exo-) Klenow Fragment (Tabella 2 ). </li><li> Aggiungere 8 ml di preparato master mix dA-tailing in ciascun pozzetto contenente 42 ml di DNA di fine riparato. Incubare in un termociclatore per 30 min a 37 ° C. </li><li> Eseguire un post dA-tailing clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 utilizzando il volume 2x (100 ml) di perline, ma risospendere in H 2 O sterile per un volume finale di 33,75 ml. La procedura può essere tranquillamente fermato a questo punto e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. &lt;/ Li&gt; </ol> 5. Preparazione Biblioteca - Adattatore legatura Module <ol><li> Preparare la master mix legatura in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 10 ml di 5x NEBNext rapida Ligation Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabella 2), 5 ml rapida T4 DNA ligasi (Tabella 2). </li><li> Aggiungere 15 ml di master mix legatura in ciascun pozzetto contenente il DNA dA-code. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di 25 mM appropriato NEXTflex adattatore di codice a barre (Tabella 2) a ciascun pozzetto. Ogni campione deve ricevere una scheda con codice a barre separato. Incubare in un termociclatore per 15 min a 20 ° C. </li><li> Eseguire un adattatore di post legatura clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 utilizzando il volume 1x (50 ml) di perline, ma risospendere in H 2 O sterile fino ad un volume finale di 50 microlitri. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,8 per un secondo volume 1x (50 pl) clean-up, ma risospendere in sterile H 2 O ad unvolume finale di 23 microlitri. La procedura può essere tranquillamente fermato a questo punto e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. </li></ol> 6. Amplificazione Biblioteca <ol><li> Preparare la master mix KAPA HiFi in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 25 microlitri 2x KAPA HiFi HS RM (Tabella 2), 1 ml ciascuno di 100 micron Primer Primer 1 e 2 (Tabella 3). </li><li> Aggiungere 27 microlitri della master mix in ciascun pozzetto contenente il prodotto di ligazione. Impostare pipetta a 50 microlitri e delicatamente pipetta l&#39;intero volume su e giù 10x. </li><li> Collocare nel termociclatore per i seguenti cicli di PCR: denaturazione iniziale di 45 sec a 98 ° C, 10 cicli di 15 secondi a 98 ° C, 30 sec a 60 ° C, 30 sec a 72 ° C, e l&#39;estensione finale di 1 min a 72 ° C. </li><li> Eseguire un post di amplificazione clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 usandoVolume 1x (50 ml) di AMPure Beads XP, e risospendere in acqua sterile fino ad un volume finale di 30 microlitri. </li><li> Quantificare la concentrazione di ciascuna libreria utilizzando Qubit Ampia gamma Assay (Life Technologies, tabella 2) secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca ibridazione, lavaggio, e Amplificazione <ol><li> Scongelare bloccanti oligonucleotidi universali e indice (Tabella 3), SeqCap EZ Biblioteca, e componenti di acquisizione NimbleGen (COT DNA, tampone di ibridazione 2x, e l&#39;ibridazione dei componenti A, Tabella 2) su ghiaccio. Tutti i bloccanti oligonucleotidi sono memorizzati in azioni di lavoro di 1 mm. Il nostro SeqCap EZ Library è un pool di custom-designed di sonde di cattura che comprende tutti gli esoni codificanti proteine ​​di 279 geni del cancro-associata, anche se possono essere utilizzati altri disegni personalizzati e catalogo. </li><li> Preparare un pool di 1 mm bloccanti indice di oligonucleotidi corrispondenti all&#39;annuncio codice a barre specificosequenze aptor utilizzati nella preparazione biblioteca. Combina 1 ml di ogni blocker, e vortex. </li><li> In un nuovo sterile da 1,5 ml provetta, aggiungere 5 ml di 1mg/ml COT DNA, 2 ml di 1 mm bloccante universale e 2 microlitri della piscina 1 mm bloccanti indice di oligonucleotidi. </li><li> Pool 24 biblioteche codice a barre in una singola reazione. Aggiungere un totale di 1-3 mg di pool, biblioteca sequenza di codice a barre (preparato in precedenza) alla miscela di cattura. Per 24 campioni, si raccomanda 100 ng per campione. Quando il pool tumori e campioni normali abbinati, si consiglia l&#39;aggiunta più biblioteca tumore (ad esempio 100 ng per tumore e 50 ng per normale) in modo che essi sono in sequenza ad una maggiore profondità di copertura. </li><li> Chiudere tappo della valvola e fare 15-20 fori nella parte superiore del cappuccio con un 18-20 G o più piccolo. Velocità Vac il campione biblioteca / COT DNA / oligo amplificati in un vuoto concentratore DNA in alto calore (60 ° C). </li><li> Una volta completamente asciutta giù, reidratare con 7,5 ml di 2x hybriditampone zazione e 3 ml di ibridazione componente A. Il tubo dovrebbe contenere le seguenti: 5 mg COT DNA, ug variabile biblioteca campione amplificato, 1000 pmol di Universal e Index Oligos, buffer di 7,5 microlitri 2x ibridazione, 3 componente microlitri di ibridazione A in un volume totale di 10,5 microlitri. </li><li> Coprire i fori del tappo con un piccolo pezzo di nastro laboratorio. Vortex il campione per 10 secondi e centrifugare alla massima velocità per 10 sec. </li><li> Incubare il campione a 95 ° C per 10 minuti per denaturare il DNA, seguita da centrifugazione a velocità massima per 10 secondi a temperatura ambiente. </li><li> In un nuovo 0.2 ml PCR tubo striscia, preparare 2,25 ml aliquota di SeqCap EZ sonde di cattura Biblioteca e 2,25 ml di sterile nucleasi libera H 2 O e aggiungere il contenuto di passo 7.7. Pipettare delicatamente l&#39;intero volume su e giù 10x. </li><li> Incubare in un termociclatore a 47 ° C per 48-96 ore. Impostare e mantenere la temperatura coperchio del termociclatore a 57 ° C. </li><li> Folbassi passaggi nel capitolo 6 della Guida dell&#39;utente SR NimbleGen SeqCap EX Biblioteca v3.0 (Tabella 2) per il lavaggio e recupero del DNA catturato. </li><li> Segue passaggi nel capitolo 7 del protocollo Roche NimbleGen per l&#39;amplificazione del DNA catturato con le seguenti modifiche: <ul type="disc"><li> Utilizzare 2x KAPA HiFi polimerasi (tabella 2) anziché Phusion-High Fidelity PCR Master Mix </li><li> Utilizzare 100 micron Primer 1 e 2 Primer elencati nella Tabella 3. </li><li> Eseguire le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 sec, 11 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec, e di estensione finale a 72 ° C per 5 min . Tenere a 4 ° C. </li></ul></li><li> Quantificare la concentrazione del DNA catturato amplificato utilizzando Qubit alta sensibilità del test (Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare la qualità del DNA catturato utilizzando Agilent BioChip analizzatore di DNA HS (Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore. <ul type="disc"><li> La resa PCR deve essere almeno 100 ng (range 100-1.000 ng). </li><li> La lunghezza media frammento deve essere compresa tra 150-400 coppie di basi. </li></ul></li></ol> 8. Illumina Hi-Seq Sequencing <ol><li> Diluire il DNA catturato amplificato a 2:00, e caricare il campione su una sola corsia di una cella di flusso Illumina HiSeq 2000. Sequenza accoppiato-end coppia di 75 di base legge secondo le istruzioni del produttore. Nella nostra esperienza, una corsia è sufficiente a produrre una copertura sequenza unica 500-700x per esempio tra 279 geni per un pool di 24 campioni. </li><li> Software Illumina (Real Time Analysis) ti permette di convertire immagini ad alta risoluzione per intensità di cluster di basare le chiamate e punteggi di qualità. Utilizzare Casava per demultiplex dati in base all&#39;identità di codici a barre e generare file FASTQ individuali per ogni campione. </li></ol> 9. Dati Anallisi <ol><li> Sequenze adattatore Trim dalla fine del 3 &#39;della sequenza di legge nei file FASTQ utilizzando Cutadapt ( <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). La lunghezza minima di sovrapposizione (-O) è 3 con un tasso di errore (-e) del 1%. La lunghezza minima di base per il mantenimento di Gemellaggio legge dopo il taglio è di 25. </li><li> Allineare sequenza di legge alle hg19 genoma umano di riferimento utilizzando lo strumento Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 12. Eseguire le operazioni di post-processing, tra cui la marcatura duplicato, sequenza locale riallineamento multipla, e la qualità di base il punteggio ricalibrazione usando l&#39;analisi del genoma Toolkit (GATK) secondo le migliori prassi standard ( <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = best practice</a> ) 13. Quando profilatura più campioni dello stesso paziente (es. tumore accoppiati e normali), sequenza locale riallineamento multipla dovrebbe essere prestazioniMED congiuntamente. L&#39;output di questi passaggi di post-processing è un file BAM separato per ogni campione, che contiene tutte le sequenze, la qualità e le informazioni di allineamento e può essere caricato direttamente nella Integrative Genomics Viewer (IGV) per la visualizzazione di letture e di varianti di sequenza 14. </li><li> Calcola metriche di performance sequenza utilizzando strumenti Picard ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). Metriche informativi includono tasso di allineamento, distribuzione dimensione del frammento, GC-content pregiudizi di copertura associato, on-target capture specificità, PCR duplicare frequenza, complessità biblioteca e media copertura del bersaglio. Valori rappresentativi sono indicati in Figura 1. Frequenze alleliche nei siti comune polimorfismo calcolati utilizzando DepthOfCoverage da GATK vengono utilizzati per monitorare la contaminazione da DNA estranei e per garantire che i campioni abbinati provenivano dagli stessi pazienti. I seguenti analisi computazionali dipendono dalla presenza di abbinatocampioni tumorali e normali per la rilevazione di alterazioni genetiche somatiche. I tumori senza precedenti possono anche essere analizzati utilizzando un campione di controllo normale separato, ma mutazioni più somatiche non possono essere facilmente distinti da varianti di sequenza ereditate. </li><li> Chiamare varianti somatiche singolo nucleotide (SNVs) per ogni coppia tumore-normale usando un chiamante mutazione somatica, come muTect 15, SomaticSniper 16, o Strelka 17. Usiamo muTect con criteri di filtro modificati, consentendo varianti con bassa (non zero) conta allele nel campione normale purché la frequenza allele è almeno 5 volte maggiore nel tumore. Varianti ricorrentemente chiamato in un pannello di DNA normali vengono rimossi come probabili manufatti sistematiche di sequenziamento o l&#39;allineamento. Ogni SNV passando filtri viene poi accuratamente esaminato utilizzando IGV. </li><li> Chiama indels somatiche per ogni coppia di tumore normale utilizzando algoritmi come SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, o SOAPindel 19 </sup&gt;. Usiamo SomaticIndelDetector con i seguenti criteri: almeno il 10% allele frequenza con almeno 3 sostenere legge, o almeno il 2% allele frequenza con almeno 10 sostegno letture. Permessi per indels con basso (non zero) conta allele nel campione normale purché la frequenza allele è almeno 5 volte maggiore nel tumore. Indels chiamati in un pannello di DNA normali vengono rimossi, come sopra. Ogni Indel passando filtri viene poi accuratamente esaminato utilizzando IGV. </li><li> Estrapolare copia dello stato numero dalla copertura sequenza in esoni bersaglio. Per ogni singolo campione, eseguire una normalizzazione Loess di copertura sequenza media per tutti gli esoni bersaglio, regressione sopra percentuale GC. Regolare i valori di copertura normalizzate sottraendo la misura Loess e aggiungendo la copertura mediana a livello di campione. Calcolare il rapporto di copertura in sequenza normalizzata in tutti gli esoni bersaglio per le coppie tumore normale. In assenza di un campione normale accoppiati e / o per diminuire il rumore, altri diploide per sessopossono essere utilizzati normali controlli che mancano varianti del numero di copie germinali. Determinare somatici utili e le perdite di numero di copia basato su aumenti o diminuzioni del rapporto di copertura. </li><li> Chiamare riarrangiamenti somatici tra geni tumorali in cui almeno un punto di interruzione genomico cade all&#39;interno o vicino a un intervallo mirato del genoma. Algoritmi suggeriti includono GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22, e Dranger 23. Intrachromosomal inversioni, delezioni e duplicazioni tandem possono essere distinti in base alla posizione relativa e l&#39;orientamento di sostenere legge in coppie discordanti. Tutti i riarrangiamenti candidati dovrebbero essere rivisti manualmente con IGV. Si consiglia di validazione sperimentale mediante PCR e sequenziamento Sanger di tutti i punti di interruzione riarrangiamento putativi. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

Il dottor Berger ha ricevuto compensi per consulenze e finanziamenti per la ricerca da Medicine Foundation, una società di diagnostica del cancro.

Il nostro test IMPACT produce un alto tasso di allineamento, alto tasso on-target, elevata copertura di destinazione, e ad alta sensibilità per le mutazioni rilevamento, indels, e numero di esemplari alterazioni. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro test IMPACT alla sequenza di DNA sia fresco congelato e archiviato campioni FFPE di ingresso DNA bassa. Eseguendo mirata esone sequenziamento dei geni del cancro-associata chiave, si può ottenere una copertura sequenza molto profondo per gli esoni di questi geni più...

L&#39;identificazione di &quot;driver&quot; tumorali eventi genetici in oncogeni chiave e geni oncosoppressori gioca un ruolo essenziale nella diagnosi e nel trattamento di molti tumori 1. Attività di ricerca su larga scala che utilizzano massicciamente parallelo sequenziamento &quot;next-generation&quot; hanno permesso l&#39;identificazione di molti di questi geni del cancro-associata negli ultimi anni 2. Tuttavia, queste piattaforme di sequenziamento in genere richiedono grandi quantità di DNA isolate da tessuti freschi congelati, ponendo così una limitazione importante nella caratterizzazione e l&#39;analisi di mutazioni del DNA dai tessuti conservati, come la paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni tumorali. Miglioramento sforzi per caratterizzare in modo efficiente e affidabile informazioni genomiche &quot;fruibili&quot; da campioni tumorali FFPE consentiranno l&#39;analisi retrospettiva di campioni precedentemente sopraelevate e ulteriormente incoraggiare approcci individualizzati alla gestione del cancro. Tradizionalmente, d molecolarelaboratori iagnostic hanno fatto affidamento su termini di tempo, metodologie a basso rendimento come il sequenziamento Sanger e real-time PCR per la mutazione del DNA profiling. Più di recente, i metodi più elevato throughput utilizzando PCR multiplex o spettrometria di massa genotipizzazione sono stati sviluppati per studiare le mutazioni somatiche ricorrenti nei geni chiave del cancro 3-5. Questi approcci, tuttavia, sono limitati dal fatto che solo &quot;hotspot&quot; mutazioni predesignated vengono dosati, che li rende inadatti per la rilevazione delle mutazioni inattivanti nei geni oncosoppressori. Sequenziamento massivamente parallelo offre diversi vantaggi rispetto a queste strategie, tra cui la possibilità di interrogare interi esoni per le mutazioni sia comuni che rare, la capacità di rivelare ulteriori classi di alterazioni genomiche quali utili e perdite del numero di copie, e una maggiore sensibilità di rilevazione in campioni eterogenei 6, 7 . Intero sequenziamento del genoma rappresenta l&#39;approccio più completo per la scoperta mutazione, anche se è relativoly costoso e comporta grandi esigenze computazionali per l&#39;analisi e l&#39;archiviazione dei dati. Per le applicazioni cliniche, dove solo una piccola frazione del genoma può essere di interesse clinico, due particolari innovazioni nella tecnologia di sequenziamento sono stati trasformativa. In primo luogo, attraverso la cattura esone basato sull&#39;ibridazione, si può isolare DNA corrispondente ai geni cancro-associate chiave per mirata mutazione profiling 8,. In secondo luogo, attraverso la legatura di codici a barre molecolare (cioè sequenze di DNA 6-8 nucleotidi di lunghezza), si possono riunire centinaia di campioni per analisi di sequenziamento e di sfruttare appieno la crescente capacità degli strumenti di sequenziamento massivamente parallelo 10. Quando combinati, queste innovazioni consentono di tumori ad essere sagomate per i costi più bassi e in un throughput più elevato, con minori requisiti di calcolo 11. Inoltre, ridistribuendo copertura della sequenza soltanto a quei geni più critici per la particolare applicazione, si può Achieve maggiore profondità di sequenziamento per la sensibilità di rilevazione più elevato per gli eventi a bassa frequenza allele. Qui descriviamo il nostro impatto saggio (Integrated Mutazione Profiling di obiettivi Actionable Cancro), che utilizza la cattura esone su piscine Biblioteca sequenza di codici a barre mediante ibridazione con oligonucleotidi personalizzate per catturare tutti gli esoni codificanti proteine ​​e selezionare introni di 279 geni del cancro-associata chiave (Tabella 1 ). Questa strategia consente l&#39;identificazione di mutazioni, indels, numero di copie alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono questi 279 geni. Il nostro metodo è compatibile con il DNA isolato sia fresco tessuto congelato e FFPE nonché aspirati con ago sottile e altri campioni citologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

Gli sforzi per individuare e indagare principali mutazioni oncogene si sono rivelate preziose per facilitare il trattamento appropriato per i pazienti oncologici. L&#39;istituzione di high-throughput, massicciamente parallelo sequenziamento &quot;next-generation&quot; ha favorito la scoperta di molte di queste mutazioni. Per migliorare l&#39;utilità clinica e traslazionale di questa tecnologia, piattaforme devono essere ad alta produttività, conveniente e compatibile con paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni di tessuto che possono produrre piccole quantità di DNA degradato o danneggiato. Qui, descriviamo la preparazione di librerie di DNA barcode e multiplex seguite da base di ibridazione-cattura di esoni mirati per la rilevazione delle mutazioni tumorali associate a tumori freschi congelati e FFPE di sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l&#39;identificazione di mutazioni di sequenza, copia numero di alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono tutti i geni target. Mirato esone sequenziamento offre tegli beneficia di throughput elevato, a basso costo, e la copertura sequenza profondo, conferendo ad alta sensibilità per la rilevazione di mutazioni a bassa frequenza.

Una piscina di 24 biblioteche sequenza codice a barre (12 paia tumore-normale) è stato catturato utilizzando sonde corrispondenti a tutti gli esoni codificanti proteine ​​di 279 geni del cancro e sequenziato da 2 x 75 bp legge su una sola corsia di una cella di flusso HiSeq 2000. Tumore e biblioteche normali sono stati raggruppati in un rapporto 2:1. Metriche di performance Esempio per una piscina di surgelati campioni di DNA del tumore sono mostrati in figura 1, tra cui il tasso di allineamento, d...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing &quot;prossima generazione&quot;. Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.

Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Views.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza. ...

Video: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l&#39;HIV

Ricerca

Biologia

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.