Questo lavoro è stato sostenuto dal National Human Genome Research Institute dei National Institutes of Health sotto Award Numero R01HG006785.

1 Progettazione Sequenza e Sintesi <ol><li> Inizia MPRA con la progettazione e la sintesi di sequenze da dosare per attività di regolamentazione. Per la compatibilità con la serie vettore pMPRA, progettare ogni sequenza utilizzando la seguente configurazione: 5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 &#39;, dove var indica la sequenza da dosare e tag denota uno o più tag di identificazione. </li><li> Le due regioni variabili (var e tag) sono separate da una coppia di KpnI (GGTACC) e XbaI (TCTAGA) siti di restrizione per facilitare la legatura direzionale di un frammento di gene reporter tra loro. Inoltre, due SFII (GGCCNNNNNGGCC) siti distinti saranno aggiunti mediante PCR per permettere la legatura direzionale nella spina dorsale pMPRA. Le regioni variabili non devono contenere ulteriori copie di qualsiasi di questi siti di restrizione. Se necessario, uno o più di questi enzimi di restrizione possono essere sostituiti, Fino a quando le sostituzioni 1) consentire il taglio efficiente vicino alle estremità di molecole di DNA, e 2) non tagliare altrove nella sequenza vettoriale. Vedi di discussione per ulteriori dettagli. </li><li> Ottenere i primer richiesti elencati nella tabella 1 da un fornitore commerciale. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> Tabella 1. sequenze di primer. [Indice] denota una sequenza indice 6-8 nt utilizzato per il sequenziamento multiplex. Ottenere almeno 8 primer TagSeq-P2 con indici differenti. Tuttodei primer deve essere purificata mediante HPLC o PAGE. <ol start="4"><li> Librerie oligonucleotide possono essere ottenuti da un fornitore o nucleo struttura commerciale, o generati utilizzando un programmabile basato microarray-oligonucleotide sintetizzatore come descritto dal produttore. Risospendere i prodotti OLS in 100 microlitri di buffer TE 0.1. </li><li> Eseguire le librerie oligonucleotidiche su un TBE-Urea 10% denaturazione gel di poliacrilamide. Caricare circa 1 pmol per corsia e macchia con macchia fluorescente ssDNA-sensibile per valutare la qualità (Figura 2A). </li><li> Se una band discreta corrispondente alle oligonucleotidi full-length può essere visualizzato (Figura 2A, corsie 1 e 2), asportare il corrispondente fetta gel di acrilammide ed eluire oligonucleotidi in 100 microlitri TE 0.1 notte a temperatura ambiente con agitazione. In caso contrario, procedere con l&#39;OLS sospensione crudo. </li><li> Amplifica e aggiungere le code SFII alla libreria oligonucleotide con emulsione PCR 9 </<html> sup&gt;. </li><li> Impostare 50 microlitri di miscele di reazione PCR come descritto nella Tabella 2. Poi si combinano con 300 ml di olio e miscela di tensioattivo dal DNA emulsione Micellula e kit di purificazione e vortex per 5 minuti a 4 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> Herculase II Fusion DNA polimerasi </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Tampone di reazione 5x Herculase II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mm ciascuno) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> BSA (20 mg / ml) </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_F Primer (25 micron) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R Primer (25 micron) </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Modello OLS (1-10 attomol) </td><td> varia </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; Tabella 2 Emulsion PCR mix di reazione (fase acquosa). <ol start="9"><li> Utilizzare la concentrazione che dà la resa massima di prodotti di amplificazione senza la comparsa di artefatti (vedi sezione 1.12). </li><li> Versare l&#39;emulsione risultante in provette per PCR ed eseguire 20 cicli di PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 sec a 95 ° C, 20 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C], 3 min a 95 ° C). </li><li> Piscina e rompere ogni 350 ml di emulsione reazione di PCR con l&#39;aggiunta di 1 ml di isobutanolo e brevemente vortex, e poi purificare il prodotto di amplificazione utilizzando una colonna di purificazione del DNA. </li><li> Eseguire una aliquota su un gel di agarosio al 2% o 4% per verificare privo di artefatti di amplificazione (Figura 2B). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> Figura 2 Preparazione di librerie di sintesi di oligonucleotidi. A) </sTrong&gt; Tre diverse biblioteche di sintesi di oligonucleotidi prime (OLS) eseguito su denaturazione del 10% TBE-urea gel di poliacrilammide. Bande corrispondenti a oligonucleotidi di lunghezza completa (*) possono essere visualizzati e asportati dalle librerie 1 e 2 Libreria 3 contiene contaminanti che interferiscono con la purificazione PAGE. Se questo è il caso, procedere direttamente al B amplificazione PCR.) Prodotti di aperto ed emulsione amplificazione PCR della stessa seduta biblioteca oligonucleotidi su un gel di agarosio. Amplificazione PCR di librerie di oligonucleotidi complessi crea frequentemente prodotti chimerici e altri artefatti che possono apparire come bande superiori e inferiori. Emulsione PCR può minimizzare questi manufatti. 2. Costruzione Biblioteca <ol><li> Preparare una spina dorsale plasmide linearizzato da digerire vettore pMPRA1 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore, eseguito su un gel di agarosio 1%, asportare la fascia dorsale (in questo caso, 2,5 kb) e purificarlo utilizzando una colonna di spin di gel-purificazione. </li><li> Digerirei prodotti di PCR emulsione dal punto 1.4 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore e purificano utilizzando le colonne di purificazione del DNA. </li><li> Per legare la libreria promotore tag nella spina dorsale vettore linearizzato, istituito reazioni contenenti 100 ng del prodotto della PCR digerito, 50 ng del vettore backbone linearizzato e DNA ligasi T4. Incubare per una notte a 16 ° C e poi il calore a 65 ° C per 20 minuti per inattivare la ligasi. </li><li> Trasforma E. coli con la reazione legatura. Per preservare la complessità biblioteca, mirano a ottenere almeno 10x più cfu che ci sono distinte combinazioni promotore-tag nella libreria progettata. </li><li> Quando il numero totale di tag è di circa 100.000, il cfu bersaglio può tipicamente essere ottenuto eseguendo 6-8 trasformazioni parallele per libreria. </li><li> Per ogni trasformazione, unire 50 ml electrocompetent E. coli con 2 ml di mix legatura su ghiaccio. Trasformazione mediante elettroporazione, recuperare le cellule in 800 microlitri SOCsupporto con agitazione a 37 ° C per 1 ora, e poi unire celle dalle trasformazioni parallele. </li><li> Per valutare l&#39;efficienza di trasformazione, piastra diluizioni seriali da un alinquot di cellule recuperate su piastre di agar LB con 50-100 mg / ml carbenicillina e incubare una notte a 37 ° C. Stimare cfu totale come (cfu osservato) × (fattore di diluizione) × (V - v) / v, dove V è il volume totale delle cellule recuperati e v è il volume dell&#39;aliquota prelevata per le diluizioni seriali. </li><li> Al tempo stesso, utilizzare il resto delle cellule recuperate per inoculare 200 ml di LB integrato con 100 mg / ml carbenicillina. Crescere le cellule a 37 ° C per una notte in un incubatore shaker e poi isolare il DNA plasmidico secondo procedure standard. </li><li> Digest un&#39;aliquota della biblioteca isolata plasmide con SFII a 50 ° C per 2 ore e correre su un gel di agarosio 1% per confermare la presenza di inserti. </li><li> Linearizzare la libreria plasmide da cUtting tra le varianti del promotore e tag utilizzando KpnI e XbaI. Per massimizzare l&#39;efficienza di digestione, eseguire digestioni di serie: </li><li> In primo luogo, digerire con KpnI a 37 ° C per 1 ora e purificare mediante biglie magnetiche. In secondo luogo, digerire con XbaI con l&#39;aggiunta di 1 U Gambero fosfatasi alcalina a 37 ° C per 2 ore, il calore inattivare a 65 ° C per 5 minuti, e poi purificare con biglie magnetiche. </li><li> Eseguire una aliquota su un gel di agarosio 1% per verificare completa linearizzazione. Se plasmide uncut è visibile, il frammento linearizzato va gel purificato. </li><li> Per generare una libreria MPRA adatto per trasfezione in cellule di mammifero, legare un ORF con KpnI / XbaI estremità compatibili nella biblioteca intermedio linearizzato. </li><li> Per preparare un luc2 ORF frammento compatibile da pMPRAdonor1, digerire il plasmide con KpnI e XbaI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 1%. Accise il frammento ORF (1,7 kb in questo caso) e la purificazione mediante colonna di gel di depurazione centrifuga. </li><li> Clonare il frammento ORF nella libreria intermedio linearizzato come descritto nei passaggi 2,3-2,8. </li><li> Digest un&#39;aliquota (corrispondente a 1-2 mg) della biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio all&#39;1%. Se la libreria digerito viene eseguito come una singola banda, passare alla sezione 3 Se si osservano bande addizionali (tipicamente corrispondente al riporto di costrutti intermedi), la libreria può essere ulteriormente purificato come segue: </li><li> Digest 3-5 mg di biblioteca contaminato con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 0,8% per una notte a 4 ° C. </li><li> Accise banda libreria corretta, purificare il DNA usando una colonna di spin purificazione gel ed eseguire auto-ligazione con alta concentrazione di T4 DNA ligasi a 37 ° C per 1 ora. Quindi ripetere la trasformazione e la biblioteca ultima estrazione del DNA come descritto al punto 2.8. </li></ol> 3 Transfection, Perturbazione, e RNA Isolation <ol><li> Per ogni trasfezione indipendente, la cultura il numero di cellule (come determinato dalla complessità biblioteca MPRA, vedi Discussione) in mezzo appropriato. Ad esempio, la cultura HEK293T / 17 cellule in DMEM supplementato con 10% FBS e L-glutammina / penicillina / streptomicina. Cellule di coltura per almeno due transfezioni indipendenti per ogni libreria e condizione sperimentale. </li><li> Trasfezione le cellule in coltura con plasmidi MPRA. Il metodo e le condizioni di trasfezione devono essere ottimizzati per ogni tipo cellulare. Per ogni campione transfettate, mantenere una aliquota (50-100 ng) di DNA plasmide come controllo abbinato. </li><li> Ad esempio, transfettare 0,5 x 10 7 HEK293T / 17 cellule cresciute al ~ 50% di confluenza in un piatto di cultura 10 centimetri con 10 mg DNA plasmidico in 1 ml di Opti-MEM ho ridotto siero Media utilizzando 30 microlitri Lipofectamine LTX e 10 ml più reagente. Rimuovere la miscela di trasfezione dopo 5 ore e permettere l&#39;cellule di recuperare per 24-48 ore. </li><li> Facoltativamente, eseguire qualsiasi perturbazione necessaria ad attivare sequenze regolatrici contestuali o segnale-dipendente nella libreria progettata. </li><li> Raccogliere le cellule e isolare poli (A) + mRNA utilizzando colonne di cellulosa oligo (dT) standard o perline usando le istruzioni del loro produttore. </li><li> Assicurarsi che la capacità massima di legame delle colonne o perline superare l&#39;importo totale di mRNA previsto dalle cellule raccolte. Ad esempio, il rendimento atteso dalla sezione 3.3 è di circa 0,5-2,5 mg mRNA. </li></ol> 4. Tag-Seq <ol><li> Per eliminare i residui di vettore DNA dai lisati cellulari trasfettate, trattare ogni campione di mRNA 20 microlitri con 1 ml Turbo DNasi (2 U) e 2,3 microlitri di buffer 10x Turbo DNasi a 37 ° C per 1 ora, aggiungere 2,4 microlitri DNasi Turbo Inattivazione reagente a RT per 5 min con miscelazione, centrifugare a 10.000 g per 90 secondi, e poi trasferire la soluzione in una nuova provetta. </li><li> Verificare<html> purezza eseguendo PCR come descritto nel capitolo 4.6 da 60-100 ng di ciascun campione di mRNA, e quindi eseguendo i prodotti su un gel di agarosio. Se ampliconi specifici sono visibili (0,25 kb se si utilizza pMPRA1 con luc2), colonna purificare l&#39;mRNA trattata e poi ripetere il trattamento DNasi. </li><li> Per generare librerie di sequenziamento Tag-Seq, convertire giornalista mRNA in cDNA e aggiungere schede di sequenziamento mediante PCR. </li><li> Impostare miscele di primer mRNA / RT come descritto nella Tabella 3. Incubare a 65 ° C per 5 minuti, poi disporli sul ghiaccio. In parallelo, impostare reazioni di sintesi di cDNA, come descritto nella Tabella 4. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> campione di mRNA (400-700 ng totale) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Oligo-0DT (50 micron) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mm ciascuno) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;&gt; Tabella 3 RNA / trascrizione inversa miscela di primer per la sintesi del DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> 10x SuperScript III RT Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mm) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0.1 M) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOut (40 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SuperScript III (200 U / ml) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 4 cDNA mix di reazione di sintesi. <ol start="5"><li> Unire delicatamente mRNA / RT Primer mescola con miscele di sintesi cDNA. Incubare a 50 ° C per 50 min, 85 ° C per 5 minuti e poi posto su ghiaccio. Infine, incubare con 2 U di ribonucleasi H a 37 ° C per 20 min. </li><li> Impostare reazioni PCR, come descritto nella Tabella 5 con 4-6 microlitricDNA miscela di reazione o 50 ng plasmide giornalista come modelli. Quindi eseguire amplificazione PCR (95 ° C per 2 min, 26 x [95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec], 72 ° C per 3 min). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> 1x Volume (ml) </td></tr><tr><td> 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix </td><td> 25 </td></tr><tr><td> TagSeq_P1 Primer (25 micron) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> TagSeq_P2 Primer (25 micron) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Template (mRNA, cDNA mix o plasmide DNA) </td><td> varia </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> Tabella 5 Tag-Seq Miscela di reazione PCR. <ol start="7"><li> Eseguire i prodotti di PCR attraverso un gel di agarosio al 2%, bande di accisa corrispondenti alle ampliconi libreria di tag-Seq (0,25 kb se si utilizzapMPRA1 con luc2) e purificare queste utilizzano colonne di spin purificazione gel. </li><li> Piscina, denaturare e sequenziare i ampliconi Tag-Seq purificate direttamente con uno strumento di sequenziamento Illumina. </li><li> Filtro di bassa qualità si legge eliminando tutto ciò che a) contenere uno o più posizione con una qualità Phred punteggio inferiore a 30 all&#39;interno del tag in sequenza o b) non corrisponde esattamente un tag progettato. Contare il numero di volte che ogni tag rimanente appare in ogni libreria. Normalizzare i conteggi tag di TPM (tag per milione tag sequenziati) e quindi calcolare il rapporto tra i conteggi tag mRNA derivati ​​over-plasmide derivato tag conteggi per ogni coppia di librerie di sequenziamento. Se più tag diversi sono stati collegati per ogni variante di sequenza, utilizzare i loro rapporti mediani per l&#39;analisi a valle. </li></ol>

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	<li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence.">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li><li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay.">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li><li>Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe&#8217;er, D., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+DNA+regulatory+elements+by+synthetic+saturation+mutagenesis.">High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis.</a> Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).</li><li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo.">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li><li>Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Bory&#324;, &. #. 3. 2. 1. ;. M., Rath, M., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantitative+enhancer+activity+maps+identified+by+STARR-seq.">Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq.</a> Science (New York, N. Y.). 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li><li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay.">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li><li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks.">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li><li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants.">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li><li>Sch&#252;tze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li><li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome.">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency. 
The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.
A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted CD). In practice, CD is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than CD. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then CD should be no more than ~200,000. Note that CD is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple &#8220;promoter bashing&#8221; experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test. 
If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements. 
Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.
It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

A correction to the author list has been made for article <a href="http://www.jove.com/video/51719">Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells</a>.

Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Saggi Reporter Massively Parallel (MPRA) consentono la misurazione multiplex delle attività di regolamentazione trascrizionali di migliaia a centinaia di migliaia di sequenze di DNA 1- 7. Nella sua implementazione più comune, multiplazione è ottenuta accoppiando ogni sequenza di interesse ad un gene reporter sintetico che contiene un tag di sequenza che identifica a valle di un open reading frame (ORF; la figura 1). A seguito di trasfezione, l&#39;isolamento di RNA e profondo sequenziamento dei fini del 3 &#39;dei trascritti del gene reporter, le relative attività delle sequenze accoppiati possono essere dedotte dalla relativa abbondanza di loro tag di identificazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> Figura 1 Panoramica di MPRA. Una libreria di MPRA giornalista costruisce è costruito accoppiando putative sequenze di regolamentazione sinteticogeni reporter che consistono di un &quot;inerte&quot; ORF (come GFP o luciferasi) seguito da una sequenza di tag di identificazione. La biblioteca è transfettato in massa in una popolazione di cellule in coltura e trascritto mRNA giornalista viene successivamente recuperata. Sequenziamento profondo viene utilizzato per contare il numero di occorrenze di ogni tag tra i mRNA giornalista e plasmidi trasfettate. Il rapporto tra mRNA risiedono su conti plasmid possono essere usate per dedurre l&#39;attività della corrispondente sequenza regolatrice. Adattato con il permesso di Melnikov, et al 2. MPRA può essere adattato a una vasta gamma di disegni sperimentali, di cui 1) la mutagenesi completa dei geni dell&#39;individuo elementi regolatori, 2) la scansione di elementi regolatori nuovi attraverso un luogo di interesse, 3) testare l&#39;effetto della variazione genetica naturale in un insieme di putative promotori, enhancer o silenziatori, e 4) ingegneria semi-razionale di elementi regolatori sintetici. Libraries di varianti di sequenza possono essere generati utilizzando una varietà di metodi, tra cui la sintesi biblioteca oligonucleotidi (OLS) su microarray programmabili 2,3,6,7, assemblaggio di oligonucleotidi degenerati 1,4, legatura combinatoria 8 e frammentazione del DNA genomico 5. Questo protocollo descrive la costruzione di una libreria di promotore varianti con OLS e vettori pMPRA1 e pMPRAdonor1 (Addgene ID 49349 e 49352, rispettivamente; http://www.addgene.org), trasfezione transiente di questa biblioteca in cellule di mammifero in coltura e la successiva quantificazione delle attività di promotore di sequenziamento profondo dei relativi tag (Tag-Seq). Le versioni precedenti di questo protocollo sono stati utilizzati nella ricerca riportata nel Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) e in Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="954">
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:359px;">Oligonucleotide library synthesis</td>
			<td style="width:201px;">Agilent, CustomArray or other OLS vendors</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
			<td style="width:275px;">If using OLS construction method</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:359px;">pMPRA1</td>
			<td style="width:201px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">49349</td>
			<td>MPRA plasmid backbone</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">pMPRAdonor1</td>
			<td style="width:201px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">49352</td>
			<td>luc2 ORF donor plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)</td>
			<td style="width:201px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>OLS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:359px;">Novex TBE-Urea Gels, 10%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">EC6875BOX</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Novex TBA-Urea Sample Buffer</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC6876</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S-11494</td>
			<td>PAGE purification of OLS products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Micellula DNA Emulsion &#38; Purification Kit</td>
			<td style="width:201px;">EURx/CHIMERx</td>
			<td style="width:119px;">3600-01</td>
			<td>Library amplification by emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:201px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600675</td>
			<td>Polymerase for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SfiI</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0123S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">XbaI</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0145S</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)</td>
			<td style="width:201px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202T</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C4040-50</td>
			<td>Library cloning with pMPRA vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">LB agar and liquid media with carbenicllin</td>
			<td style="width:201px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Growth media for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">E-Gel EX Gels 1%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G4010-01</td>
			<td>Library verification and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">E-Gel EX Gels, 2%</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G4010-02</td>
			<td>Library verification and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MinElute Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:201px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28604</td>
			<td>Library and backbone purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:201px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12362</td>
			<td>Library DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cell culture media</td>
			<td style="width:201px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Experiment-specific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Transfection reagents</td>
			<td style="width:201px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Experiment-specific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MicroPoly(A)Purist Kit</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1919</td>
			<td>mRNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td>Plasmid DNA removal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080-051</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix</td>
			<td style="width:201px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600850</td>
			<td>Polymerase for Tag-Seq PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Primers (see text)</td>
			<td style="width:201px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom</td>
			<td>PAGE purify Tag-Seq primers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

massively parallel reporter assays in cultured mammalian cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

MPRA facilita ad alta risoluzione, dissezione quantitativa delle relazioni sequenza-attività di elementi di regolazione trascrizionale. Un esperimento MPRA prescelto sarà tipicamente misurazioni risulteranno altamente riproducibili per la maggior parte delle sequenze nella libreria transfettate (Figura 3A). Se scarsa riproducibilità si osserva (Figura 3B), ciò è indicativo di una concentrazione troppo bassa di mRNA del reporter nei campioni di RNA recuperati, a causa sia 1) bassa attività assoluto tra le sequenze dosati, o 2) bassa efficienza di trasfezione. La Figura 4 mostra un rappresentante &quot;informazione impronta&quot; 1,2 generato analizzando ~ 37.000 varianti casuali di una sequenza di 145 bp a monte del gene IFNB umano in cellule HEK293 con o senza esposizione al virus Sendai. Il promotore TATA-box e noto esaltatore prossimale 10 possono essere chiaramente identificati come regi ricco di informazionions in maniera virus-dipendente. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> Figura 3 Tag-Seq riproducibilità. Diagrammi a dispersione mostrano esempi di dati Tag-Seq da due transfezioni replicati indipendenti con alta (A) e bassa (B) riproducibilità. Il secondo grafico mostra molti tag outlier con elevato numero di mRNA in una sola delle due repliche. Tali manufatti in genere indicano che le concentrazioni di mRNA giornalista erano troppo bassi per PCR quantitativa, sia a causa di bassa attività assoluti tra i costrutti reporter, o bassa efficienza di trasfezione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> Figura 4. Informazioni footprinting del sito di inizio della trascrizione IFNB umana e potenziatore prossimale. </strong&gt; Circa 37.000 varianti casuali di 145 nucleotidi (nt) regione a monte del gene IFNB umana sono stati analizzati utilizzando MPRA in cellule HEK293 con (A) e senza (B) esposizione al virus Sendai. Le barre blu indicano la reciproca informazione tra l&#39;uscita giornalista e il nucleotide in ogni posizione. Il potenziatore prossimale e TATA-box si distinguono come regioni ad alto contenuto informativo su infezione virale.

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Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

massively-parallel-reporter-assays-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K Views.  Broad Institute. The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.