Gli autori vorrebbero riconoscere Genome Canada e Genome British Columbia per il finanziamento della piattaforma e supporto. Ringraziamo anche il Dott. Carol E. Parker per la revisione critica del manoscritto assistenza e la modifica. CHL grazie anche British Columbia Proteomica di rete per il supporto.

1. Tissue Sezioni <ol><li> Flash-congelare i campioni di emissione, una volta raccolte, utilizzando azoto liquido, li spediremo in ghiaccio secco (se richiesto spedizione), e conservarli a -80 ° C fino al sezionamento dei tessuti. (Se si usano campioni commerciali, garantiscono che i campioni sono preparati in questo modo.) </li><li> Tagliare gli organi a una dimensione gestibile per adattarsi al bersaglio MALDI. Tagliare le parti indesiderate dell&#39;organo. Per questo studio qui descritto, lenti di vitello erano decapsulated utilizzando una procedura precedentemente descritta 35 prima sezionamento tessuto. </li><li> Togliere interi organi da -80 ° C freezer e fissarli su una fase di taglio tessuto criogenico. Per fissare un obiettivo di vitello, mettere una o due gocce d&#39;acqua sul palco tessuto taglio di un criostato. Introdurre rapidamente la lente in acqua prima che si solidifica. In alternativa, la temperatura ottimale di taglio (OCT) composti possono anche essere utilizzati per fissare un tessuto sulla fase di taglio. Se si utilizzano i composti ottobre, un miniMal quantità OCT deve essere applicato e si deve prestare attenzione a garantire che le sezioni di tessuto taglio non saranno contaminati con composti dei PTOM che possono interferire con ionizzazione e rilevazione degli analiti 5,36,37. </li><li> Lasciare la temperatura all&#39;interno del criostato equilibrare a -18 ° C. Temperature più fredde o più calde possono essere utilizzati per i tessuti più morbidi o duri, rispettivamente. Poi tagliare il tessuto equatoriale in 20 micron fette spesse. Utilizzare 10-15 micron fette spesse per la maggior parte dei tessuti, tuttavia, a causa della natura fragile del tessuto lente bovina, sono stati usati 20 micron fette spesse. Per tessuto lente bovina, scartare le prime sezioni di tessuto e utilizzare solo le fette che sono vicini o al piano equatoriale. </li><li> Se una lente tessuto oculare viene esposta, utilizzare 1,5 ml di acido formico (98% in purezza, grado LC-MS) per prewet la superficie di un ossido di indio e stagno (ITO) rivestite vetrino. </li><li> Trasferire accuratamente le sezioni di tessuto alla superficie del ITO-covetro ated vetrino microscopico all&#39;interno del criostato. La sezione di tessuto rapidamente disgelo e diventerà saldamente apposte sulla superficie di scorrimento. Solitamente, sezioni di tessuto multipli possono essere montati su uno stesso vetrino ITO rivestite in questo modo. </li><li> Liofilizzare il vetrino per 15 minuti prima dell&#39;applicazione matrice MALDI. </li><li> Per le prove matrice, sciogliere le singole matrici in opportuni solventi. Individuare manualmente 1 ml di ciascuna soluzione di matrice sulla sezione di tessuto. Inoltre, individuare uno standard di calibrazione piccola molecola sul tessuto per la verifica della sensibilità MALDI. </li><li> Aggiungere tre marchi insegnamento al vetrino ITO ricoperto da scrivere sulla superficie non conduttiva del vetrino ITO rivestite con una penna correzione fluido. Prendete un&#39;immagine ottica della diapositiva tessuto utilizzando uno scanner piano e salvarla in un formato appropriato come tiff o jpg. </li></ol> 2. Matrix Coating 2.1. Automated Matrix Coating <ol><li> Apsoluzioni matrice strato, che contengono acetonitrile o acetonitrile / acqua miscelata come solventi, automaticamente verso le superfici delle sezioni di tessuto utilizzando un Bruker ImagePrep o una simile spruzzatore matrice elettronico. </li><li> Coprire i bordi della superficie frontale del vetrino ITO rivestite con nastro in modo che la matrice non rivestire i bordi della diapositiva. Questo assicura che i marchi insegnamento sulla superficie opposta possono essere usate per l&#39;allineamento scorrevole tessuto. Non coprire i bordi del vetrino con matrice in cui sono utilizzati come punti di contatto per mantenere la conducibilità elettrica della slitta ITO rivestite. </li><li> Rivestire il vetrino utilizzando venti cicli di rivestimento matrice (2-sec spruzzo, 30 sec incubazione, e 60 sec tempo di asciugatura per ogni ciclo). </li></ol> 2.2. Manuale Matrix Coating <ol><li> Se solventi organici (ad esempio cloroformio ed acetato di etile) che sono compatibili con i materiali di produzione del polverizzatore matrice elettronico sono requirosso, utilizzare un aerografo spruzzatore pneumatico assistita per applicare la matrice. Aggiungere la soluzione di matrice preparata al serbatoio del solvente della pistola aerografo e applicare una leggera corrente di azoto pressurizzato per innescare lo spray. </li><li> Coprire i bordi della superficie frontale dei vetrini ITO rivestite con nastro in modo che la matrice non rivestire i bordi della diapositiva. Questo assicura che i marchi insegnamento sulla superficie opposta possono essere usate per l&#39;allineamento scorrevole tessuto. Non coprire i bordi del vetrino con matrice in cui sono utilizzati come punti di contatto per mantenere la conducibilità elettrica della slitta ITO rivestite. </li><li> Dopo che sono stati osservati spray stabili e sottili, spruzzare manualmente la matrice in modo che esso completamente ricopre la sezione di tessuto. Applicare la quantità minima di soluzione di matrice richiesta di bagnare appena la superficie durante ogni ciclo per evitare possibili delocalizzazione analita. In generale, utilizzare circa 10 cicli di spruzzo matrice per rivestire una sezione di tessuto, il numero di cicli èdipendenti dal tipo di tessuto e composizione della matrice. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> Preparare una soluzione di massa diluendo il &quot;ES sintonia Mix&quot; soluzione standard di un fattore 1:200 a 60:40 isopropanolo: acqua (contenente 0,1% di acido formico nella miscela finale). </li><li> Introdurre 2 ml / min della soluzione diluita &quot;ES sintonia Mix&quot; in dual-mode ionizzazione elettrospray (ESI) / sorgente di ioni MALDI sulla massa spettrometro FTICR, dal lato ESI. </li><li> Usare lo strumento FTICR in modalità ESI positiva-ione, con rilevamento a banda larga e una dimensione di acquisizione dati di 1,024 kb / sec. I parametri tipici ESI sono capillare tensione elettrospray, 3.900 V; spruzzare tensione scudo, 3.600 V; gas nebulizzatore (N 2) flusso, 2 L / min; gas secco (N 2) flusso e temperatura, 4 L / min e 200 ° C; skimmer 1 tensione, 15 V, il tempo di volo (TOF), 0.009 sec; gas di collisione (Ar) il flusso, 0,4 L / s; sorgente di tempo di accumulo di ioni, 0.1 sec;e la cella di collisione tempo di accumulo di ioni, 0,2 sec. Regolare i parametri di funzionamento FTICR al fine di massimizzare la sensibilità analitica nell&#39;intervallo massa da m / z 200 a 1.400, pur mantenendo una buona dominio del tempo libero-induzione decadimento (FID) segnali. In genere, i parametri di funzionamento ICR sono tensione sidekick, 8 V; Sidekick tensione di offset, 8 V; eccitazione amplificazione di 10; dell&#39;eccitazione tempo di impulso, 0,01-,015 sec; davanti tensione di placca trappola, 1,5 V; trappola di nuovo tensione di placca, 1,6 V e analizzatore tensione ingresso, -4 V. Dopo una serie di parametri di funzionamento FTICR è stata determinata, acquisire spettri di massa ESI e calibrare lo strumento utilizzando masse di riferimento delle mescole standard nella soluzione &quot;ES sintonia Mix&quot;. </li><li> Per sintonizzare lo strumento per il funzionamento MALDI, sciogliere diverse aliquote 1 pl di una terfenadina mista e soluzione standard reserpina nella soluzione matrice ad una concentrazione di 1 mM ciascuno e individuare queste soluzioni direttamente su uno dei tissue sezioni (cioè una sezione di tessuto test) che è stato montato su un vetrino ITO rivestite. Posizionare il vetrino ITO rivestite in un adattatore per slitta tessuto (cioè un particolare obiettivo MALDI) e caricare l&#39;adattatore dal lato MALDI nella duplice sorgente ionica ESI / MALDI. Ottimizzare i parametri operativi MALDI appropriati per la potenza del laser e il numero di colpi laser per accumulo segnale MALDI per ogni scansione massa, ecc parametri di funzionamento MALDI tipici sono: colpi laser, 50, e una tensione MALDI piatto di 300 V. </li><li> Dopo la messa a punto, calibrazione, e ottimizzando lo strumento per esperimenti MALDI-MSI, allineare la posizione fisica di una sezione di tessuto per essere ripreso con la sua immagine ottica registrata all&#39;interno del software di imaging. Utilizzare i tre marchi &quot;correzione-fluido&quot;, precedentemente messi sul lato opposto della superficie di scorrimento ITO rivestite (passo 1,9), per questo allineamento utilizzando un metodo di triangolazione tre punti. </li><li> Eseguire un ESI simultanea e MALOperazione di DI in modo che ogni spettro di massa contiene i picchi di massa di riferimento della soluzione &quot;ES sintonia Mix&quot; per il post-acquisizione calibrazione massa interna. Ciò comporterà la misura della massa più accurata durante MALDI MS. Per fare questo, prima attenuare il segnale ESI diminuendo la tensione capillare finché i segnali MALDI dominano spettri mentre i segnali calibranti ESI sono ancora abbastanza elevata per la calibratura massa interna. </li><li> Successivamente, impostare un metodo rastering automatizzato per irraggiamento laser. Definire le regioni di tessuto per essere ripreso e impostare la dimensione del passo raster laser appropriato. Si noti che le dimensioni di passo più piccolo raster forniscono immagini di risoluzione dei tessuti superiori, ma richiedono un tempo significativamente più lungo di massa spettrale acquisizione e più spazio di archiviazione dei dati. Il numero di pixel dell&#39;immagine dipende dal passo raster laser da impostare e le dimensioni del tessuto. Per una tipica lente bovino che ha una dimensione 1 cm2 tessuto, un tessuto immagine è solitamente composto di ca. </em&gt; 5.000 pixel, se viene utilizzato un passo raster laser di 200 micron su uno strumento FTICR. Utilizzare una analisi &quot;posto a caso&quot;, perché ciò impedisce polarizzazione basata sulla posizione a causa dell&#39;attenuazione del segnale graduale durante l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Calibrare gli spettri di massa MALDI utilizzando calibrazione interna per il confronto iniziale e selezionare i picchi di MS / MS. De-isotopi e scegliere le cime monoisotopico come precedentemente descritto, utilizzando uno script VBA personalizzato 38. </li><li> Esportare il conseguente liste di picco monoisotopico e inserire i valori m / z misurate nel METLIN 39 e / o le HMDB 40 database metaboloma per corrispondenza di massa con le voci di libreria. Si consideri la (M + H) +, (M + Na) + e (M + K) + ioni durante le ricerche di database, con un errore massa ammissibile di ± 1 ppm. </li><li> Generare immagini MALDI per tutte le entità lipidi rilevati su tutta la sezione di tessuto con imagsoftware e-analysis, con ampiezza di filtro massa di 1 ppm all&#39;apice del picco. </li><li> Una volta che le immagini sono state generate per tutti i valori m / z che corrispondono voci del database, generare immagini per tutte le altre vette, nonché a cercare modelli di distribuzione unici che possono essere studiati più tardi. </li></ol> 5. La conferma delle identità dei lipidi Imaged <ol><li> Confermare l&#39;identità dei lipidi alti abbondanza, che hanno caratteristiche frammenti di ioni che possono essere rilevati utilizzando lo strumento FTICR (ad es 184,073 per fosfolipidi), da MALDI-MS/MS. Eseguire MALDI-MS/MS utilizzando collisione indotta dissociazione (CID) direttamente sul tessuto. </li><li> Per tali specie lipidiche che non può essere confermata direttamente MALDI-MS/MS, utilizzare un sistema UPLC accoppiato ad uno spettrometro di massa q-TOF 34. <ol><li> Sezionare manualmente aliquote contenenti ~ 10 mg di tessuto dalla zona in cui le specie di interesse è stato localizzato. Posizionare questi aliquote di tessuto in 2provette per centrifuga ml. </li><li> Omogeneizzare ciascuna aliquota tessuto in 250 ml di acqua, utilizzando un mulino miscelatore con due cinque millimetri sfere metalliche in acciaio inox. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di cloroformio-metanolo (1:3, v / v) e miscelare i tubi. Successivamente, centrifugare le provette con una microcentrifuga a 12.000 xg per 10 min. </li><li> Raccogliere il surnatante e asciugarle in un concentratore di velocità rotativo vuoto. </li><li> Sciogliere i residui in 100 ml di isopropanolo 30:70: acqua. Iniettare una aliquota di 10 microlitri nella colonna UPLC per la separazione con gradiente di eluizione. </li><li> Utilizzare le condizioni cromatografiche per on-line LC-MS/MS lipidi, che sono stati pubblicati in precedenza 34. </li><li> Generare una corrente di ioni estratto (XIC) cromatogrammi utilizzando i valori teorici m / z, con una finestra di ± 50 ppm intorno masse teoriche. </li><li> Se composti autentici per tali lipidi sono disponibili, corrispondere i tempi di ritenzione dei composti autentici con quelle del corrispondentecorrispondente picchi XIC dai campioni di tessuto. Se i composti sono uguali, i tempi di ritenzione e spettri MS / MS devono corrispondere. </li></ol></li><li> Se un composto autentico non è disponibile, utilizzare il modello di frammentazione del lipide rilevato per abbinare uno spettro standard di MS / MS da un database metabolome come METLIN o HMDB. Utilizzare interpretazione spettrale massa de novo di determinare una possibile struttura per il lipide. </li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Le considerazioni più importanti per il successo MALDI MSI sono: 1) la preparazione dei tessuti; 2) scelta della matrice; 3) l&#39;applicazione della matrice e 4) l&#39;interpretazione dei dati e l&#39;analisi. Quando il campione e la matrice sono opportunamente preparate, l&#39;acquisizione dati MS è automatizzato. L&#39;analisi dei dati da questo tipo di esperimento è piuttosto costosa. Preparazione dei tessuti adeguato è fondamentale per il successo delle sperimentazioni MALDI MSI. La...

Spettrometria di massa di imaging (MSI) è una tecnica analitica per la determinazione della localizzazione e distribuzione pattern spaziali di composti sulla superficie di una sezione di tessuto 1,2. Matrix desorbimento laser assistita / ionizzazione (MALDI) MSI per l&#39;analisi di peptidi e proteine ​​è stato usato per più di un decennio e ci sono stati grandi miglioramenti nei metodi di preparazione del campione, sensibilità di rilevamento, risoluzione spaziale, riproducibilità ed elaborazione dati 3,4. Combinando le informazioni risultanti dalle sezioni istologicamente colorate ed esperimenti MSI, patologi sono in grado di correlare le distribuzioni di composti specifici con le caratteristiche fisiopatologicamente interessanti 5. I modelli di distribuzione di piccole molecole, tra cui farmaci esogeni 6,7 e loro metaboliti 8-10 sono stati interrogati tramite MALDI-MS tissutale 11. I lipidi sono forse il cla più ampiamente studiatass di composti con immagini MALDI, sia nelle SM 12-17 e MS / MS 18 modalità. L&#39;uso di MALDI MSI per l&#39;imaging piccola molecola è stata limitata da diversi fattori: 1) matrici MALDI sono essi stessi piccole molecole (tipicamente m / z &lt;500), che generano segnali di ioni abbondanti. Questi segnali abbondanti possono sopprimere la ionizzazione di analiti piccole molecole e interferire con la loro rilevazione 19,20. Rivestimento senza solventi matrice 21, matrice sublimazione 22, e la matrice preverniciato MALDI MS 23, tra gli altri, sono stati sviluppati per migliorare l&#39;MSI di piccole molecole. Le nuove matrici che possono migliorare l&#39;analisi di composti a basso MW sono di grande interesse per la piccola molecola MSI. Queste matrici dovrebbero fornire maggiori segnali di analiti con i segnali a matrice diminuito. Nella modalità positiva di litio, 2,5-diidrossibenzoico acido (DHB) e α-ciano-4-idrossicinnamico acido (CHCA) sono le due matrici MALDI MS comunemente utilizzati per MSI 24 </sup&gt;. La matrice ideale sarebbe formare piccoli cristalli, in modo da preservare la localizzazione spaziale degli analiti. DHB tende a formare cristalli più grandi, quindi applicando la matrice mediante sublimazione è stata sviluppata per superare parzialmente questo problema, e ha permesso l&#39;uso di questa matrice per l&#39;imaging sensibile dei fosfolipidi 22,25. 9-Aminoacridine è stato usato per MSI di analiti protici in modalità positiva di litio e 26 nucleotidi e fosfolipidi nella modalità 26-29 di ioni negativi. 2-mercaptobenzotiazolo è stato trovato che invia rilevamento MALDI efficiente di lipidi 30, ed è stato utilizzato per l&#39;imaging di cervello di topo gangliosidi 31. La risoluzione ultra della trasformata di Fourier ioni ciclotrone risonanza (FTICR) spettrometri di massa possono in qualche modo alleviare questo problema, risolvendo i segnali di analiti dai segnali matrice 32. Un altro vantaggio dell&#39;uso di FTICR-MS è che le intensità dei cluster matrice metastabili sono riduzioneed 33, che riduce anche queste interferenze 27. L&#39;uso di ditranolo (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) come matrice MALDI per imaging dei tessuti è stato precedentemente riportato 34. In questo lavoro attuale, un protocollo dettagliato è fornito per l&#39;uso del DT per il MSI di lipidi endogeni sulle superfici delle sezioni di tessuto lente bovina, in modalità positiva di litio.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

Spettrometria di massa di imaging (MSI) determina la localizzazione e distribuzione pattern spaziali di composti sulla superficie di una sezione di tessuto, principalmente utilizzando MALDI (matrice desorbimento laser assistita / ionizzazione) basati tecniche analitiche. Sono necessarie nuove matrici per piccola molecola MSI, che possono migliorare l&#39;analisi di basso peso molecolare (MW) composti,. Queste matrici dovrebbero fornire maggiori segnali di analiti riducendo segnali di fondo MALDI. Inoltre, l&#39;uso di strumenti ad altissima risoluzione, come trasformata di Fourier ciclotrone ionico (FTICR) spettrometri di massa, ha la capacità di risolvere segnali analita da segnali a matrice, e questo può parzialmente superare molti problemi associati con lo sfondo proveniente dalla MALDI matrice. La riduzione delle intensità dei cluster matrice metastabili di FTICR MS può anche contribuire a superare alcuni dei disturbi associati con picchi matrice su altri strumenti. Ad alta risoluzionestrumenti quali gli spettrometri di massa FTICR sono vantaggiosi in quanto possono produrre modelli di distribuzione di molti composti contemporaneamente pur fornendo fiducia in identificazioni chimici. Dithranol (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) è stato precedentemente segnalato come una matrice MALDI per imaging dei tessuti. In questo lavoro, un protocollo per l&#39;uso di DT per MALDI imaging lipidi endogeni dalle superfici di sezioni di tessuto di mammifero, da positivo ioni MALDI-MS, su un ibrido quadrupolo altissima risoluzione sono stati inseriti strumento FTICR.

<html> I campioni di tessuto che sono sezionate e montate disgelo sui vetrini ITO rivestite devono essere intatti, senza strappi visibile. Per molti tessuti, montaggio su un vetrino ITO rivestito disgelo tessuto diretta è accettabile. Per alcuni tessuti specifici come obiettivo bovini, ampia lacerazione del tessuto è spesso visto durante il montaggio disgelo diretta viene utilizzato (Figura 1a). Prerivestimento del vetrino ITO con etanolo o acido formico (Figura 1b) aiuta a mantenere l...

Watch this Scientific Journal Video about Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer at JoVE.com

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) è stato precedentemente segnalato come una matrice MALDI per l&#39;imaging tessuto di piccole molecole; protocolli per l&#39;uso di DT per l&#39;imaging MALDI di lipidi endogeni sul superficie di sezioni di tessuto di positivo-ion MALDI-MS su uno strumento quadrupolo-FTICR altissima risoluzione sono forniti qui.

Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  University of Victoria.  Dithranol (DT; 1,8-diidrossi-9 ,10-dihydroanthracen-9-one) è stato precedentemente segnalato come una matrice MALDI per l'imaging tessuto di piccole molecole; protocolli per l'uso di DT per l'imaging MALDI di lipidi endogeni sul superficie di sezioni di tessuto di positivo-ion MALDI-MS su uno strumento quadrupolo-FTICR altissima risoluzione sono forniti qui. 

Video: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantificare miscelazione con risonanza magnetica

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

Calibrazione e utilizzo delle prestazioni del microcoil MRM dimostrato sulle radici della trogola Medicago a 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Caricamento criogenico del campione in uno spettrometro a risonanza magnetica nucleare ad angolo magico che preserva la vitalità cellulare

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

Preparazione del campione per l'analisi rapida dei lipidi nel cervello della Drosophila utilizzando la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice