E &#39;molto importante indossare guanti privi di polvere durante la preparazione dello strato sottile. Pulizia della piastra del campione <ol><li> Utilizzare un acciaio inossidabile placcata in oro o campione MALDI. </li><li> Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe. Non strofinare o strofinare la superficie con il Kimwipe, per evitare di graffiare la superficie. </li><li> Lavare con H 2 O e strofinare delicatamente con un Kimwipe. </li><li> Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe. </li><li> Se necessario, ripetere MeOH / H 2 O / MeOH ciclo di pulizia, sempre che termina con MeOH. </li><li> Assicurarsi che non ci sono punti fantasma o residuo rimasto sul piatto. Se ci sono macchie fantasma, lavare la piastra con acqua deionizzata, mentre strofinando la superficie con la mano guantata (Non strofinare con Kimwipes). Ripetere la MeOH / H 2 O / MeOH ciclo di pulizia. </li><li> Utilizzare la piastra subito dopo il lavaggio. </li></ol> Preparazione della soluzione sottile strato di substrato <ol><li> Mescolare 1 parte di saturi 4-HCCA (2 parti ACN, 1 parte di acqua, e lo 0,1% finale TFA) e 3 parti di isopropanolo. Nota: Il sottile strato di soluzione di substrato è molto stabile, e può essere conservato a temperatura ambiente al buio per un anno. Può anche essere conservato a 4 ° C. </li></ol> Fare il substrato sottile strato <ol><li> Applicare 20-50μL della soluzione di substrato sottile strato di sinistra-centro del piatto, e si diffondono con il lato di un puntale. Raccogliere in una direzione. </li><li> Come si asciuga soluzione, il solvente evapora organico molto rapidamente, lasciando dietro di piccolissime gocce d&#39;acqua sulla superficie della piastra. A questo punto, avvolgere il dito indice con una strato di Kimwipe e inizialmente leggermente asciugare la superficie della piastra con esso. </li><li> Quando la superficie è liberato da goccioline d&#39;acqua, pulire l&#39;intera piastra con movimenti ampi uni-direzionale con un Kimwipe. Nota: Se la soluzione non si diffonde a sufficienza per tutta la superficie della piastra, aumentare la composizione ACN e ricreare lo strato sottile. Alcuni parametri che possono influenzare la diffusione della soluzione comprendono umidità e temperatura. Nota: con tavole d&#39;oro, lo strato di solito appare come un riflesso giallastro, a seconda della luce e angoli di visione. Con piastre in acciaio, ma solo il bordo dello strato è normalmente visibile. </li><li> Pulire i bordi del piatto con un Kimwipe fresca prima di inserirlo nel porta targa per evitare matrice di contaminare lo strumento. </li></ol> Preparazione della soluzione di matrice <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Saturi 4-HCCA</a> in FWI (3 parti di acido formico, 1 parte di acqua, 2 parti di isopropanolo) è consigliato per l&#39;analisi di entrambe le membrane e proteine ​​solubili. Potrebbe anche essere usato in casi particolari per l&#39;analisi di peptidi di grandi dimensioni molto idrofobiche (M&gt; 4000 U). Assicurarsi che la soluzione matrice utilizzata per individuare le proteine ​​non superi il 50% ~ contenuto organico, in quanto completamente sciogliere il substrato sottile strato, sconfiggendo i vantaggi del metodo. </li></ol> Prova del substrato sottile strato <ol><li> 0.5μL posto della soluzione di matrice sul piatto. Un precipitato biancastro apparirà l&#39;interfaccia tra lo strato sottile e la goccia. Quando questo strato copre la parte inferiore della goccia interamente, di solito entro 10-15 secondi, aspirare il liquido in eccesso con una linea a vuoto. Se passano più di 30 secondi per il precipitato di forma, è l&#39;indicazione che ci potrebbe essere un problema con il substrato sottile strato e / o la soluzione matrice. </li></ol> Esempio di applicazione <ol><li> La concentrazione di analita nella soluzione di partenza dovrebbe essere entro 10 e 1000μM. </li><li> Diluire la soluzione di analita in soluzione matrice ad una concentrazione di analiti finale tra 0,2 e 2μM. Per esempio, iniziare con 1ml di campione e di soluzione 9μl matrice. Nota: Assicurarsi che la matrice è vicino alla saturazione nella soluzione finale, altrimenti si ridisciogliere il substrato sottile strato. Nota: le concentrazioni Analita necessari per ottenere segnali decente sono altamente dipendenti dalla complessità della soluzione e la composizione (ad esempio, contaminanti) e ionizability analita. Nota: se un singolo passaggio di diluizione non produce buoni risultati, si dovrebbe cercare un altro passo di diluizione. Anche se contro-intuitivo, di soluzioni ad alta concentrazione di analiti raramente producono spettri bene. Nota: Le proteine ​​di membrana di solito richiedono grandi diluizioni. </li><li> 0.5μl posto del campione / matrice miscela sul piatto. Un precipitato biancastro si forma a livello di interfaccia tra lo strato sottile e la goccia. Questo precipitato è la cocrystallization della matrice e dell&#39;analita. Quando questo strato copre la parte inferiore della goccia interamente, USUalleato entro 10-15 secondi, aspirare il liquido in eccesso con una linea a vuoto. Se passano più di 30 secondi per il precipitato di forma, può essere un&#39;indicazione di una agenti contaminanti presenti, che impedisce la cristallizzazione, o il vostro analita è troppo concentrato. </li></ol> Calibrante applicazione <ol><li> Preparare il calibrante / matrice miscela in maniera simile, con una concentrazione finale calibrante tra 0,1 0.5μM. </li><li> 0.5μl Spot calibrante / matrice miscela sul piatto in prossimità dei punti di campionamento. Questa vicinanza fisica viene utilizzato in un pseudo-interno procedura di taratura, in cui si sposta il piatto dal dischetto campione al posto calibrante durante l&#39;acquisizione del campione, per aggiungere un paio di colpi di laser del calibranti allo spettro. Questo approccio garantisce una taratura più alta accuratezza di massa di calibrazione esterno. </li></ol> Lavaggio passo <ol><li> Lavare ogni posto con circa 2μL di un freddo ghiaccio soluzione acquosa 0,1% TFA. Aspirare il liquido in eccesso con una linea a vuoto. </li></ol> Acquisizione di spettri di massa <ol><li> Ora siete pronti ad acquisire spettri di massa. Se si utilizza la soluzione di matrice FWI, è necessario acquisire il tuo spettri il più presto possibile per prevenire modifiche irreversibili all&#39;analita come formylation. </li></ol>

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	<li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films.">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Robust,+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins.">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li></ol>

È fondamentale che tutti i reagenti sono di altissima qualità (ad esempio grado HPLC). Guanti privi di polvere (lattice o nitrile) In acciaio inox o placcata in oro campione MALDI Metanolo (MeOH) Acqua Kimwipes alfa-ciano-4-idrossicinnamici acido (4-HCCA) Trifluoroacetico acido (TFA) (concentrazione finale di 0,1% in H 2 O) Acetonitrile (ACN) L&#39;acido formico Isopropanolo

maldi sample preparation: the ultra thin layer method

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l&#39;analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser Spettrometria di Massa desorbimento ionizzazione (MALDI-MS) 1, 2. L&#39;ultra-sottile strato metodo comporta la produzione di un substrato di cristalli di matrice (alfa-ciano-4-acido idrossicinnamici) sulla piastra del campione, che serve come terreno per la semina successiva cristallizzazione di una matrice / analita miscela. I vantaggi del metodo ultra-sottile strato rispetto ad altri approcci deposizione del campione (ad esempio delle gocce essiccate) sono che offre (i) maggiore tolleranza alle impurità come i sali e detergenti, (ii) la migliore risoluzione, e (iii) maggiore uniformità spaziale. Questo metodo è particolarmente utile per la determinazione della massa accurata delle proteine. Il protocollo è stato inizialmente sviluppato ed ottimizzato per l&#39;analisi delle proteine ​​di membrana e utilizzato per analizzare con successo i canali ionici, trasportatori metabolita, e recettori, contenente tra 2 e 12 domini transmembrana 2. Dopo la pubblicazione originale, ma ha anche dimostrato di essere ugualmente utile per l&#39;analisi di proteine ​​solubili. Anzi, lo abbiamo usato per un gran numero di proteine ​​che hanno una vasta gamma di proprietà, compresi quelli con peso molecolare alto come 380 kDa 3. Oggi è il nostro metodo di scelta per l&#39;analisi molecolare di massa di tutte le proteine. La procedura descritta produce costantemente spettri di alta qualità, ed è sensibile, robusto e facile da implementare.

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l&#39;analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

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