Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla BBSRC (BB/1006478/1). PRR è il destinatario di un Royal Society University Research Fellowship.

1. Considerazioni strategiche <ol><li> La scelta di semi-cristalli utilizzato per esperimenti microseeding varierà a seconda dell&#39;obiettivo dell&#39;esperimento. All&#39;inizio di un progetto è utile per trovare diversi colpi di cristallizzazione che possono fornire punti di partenza alternativi per l&#39;ottimizzazione di cristallo. RMM riduce notevolmente la necessità di ottimizzazione cristallo perché i cristalli di buona qualità hanno maggiori probabilità di crescere nella zona metastabile del diagramma di fase, cioè nella regione in cui segue perturbazione o nucleazione il sistema ritorna all&#39;equilibrio. È pertanto consigliabile utilizzare RMM ordinariamente non appena si ottengono i primi cristalli (o, più precisamente, non appena i primi cristalli smettere di crescere). </li><li> Per il primo giro di RMM, uno stock di semi dovrebbe essere fatto con tanto materiale cristallino possibile. Se solo un bene è disponibile che contiene cristalli, o se i cristalli sono piccoli, può essere utile per impostare più ripetizioni delhit originale (senza seeding) per aumentare l&#39;offerta di cristalli. Se, tuttavia, diversi risultati si ottengono diversi, cristalli di semi possono essere raccolte da diverse condizioni e mescolati insieme. </li><li> Per evitare la separazione di fase, cristalli cresciuti in condizioni ad alto sale devono essere raccolte separatamente da cristalli cresciuti in condizioni di alta PEG. Se i cristalli di diversi pozzi sono mescolati, una soluzione serbatoio che è meno probabile che invia cristalli di sale dovrebbe essere selezionato per sospensione sementi. Ad esempio, elevate concentrazioni di fosfato, solfato, calcio e magnesio dovrebbero essere evitati. </li><li> Successivamente in un progetto, può essere importante cercare cristalli con pile unitarie differenti al fine di migliorare la diffrazione, evitare cristalli gemellate, ed ottenere cristalli che sono adatti per ligandi di legame. In questa fase solo i cristalli più adatti (ad esempio quelli che diffrangono meglio) dovrebbe essere usato per fare il brodo seme. A volte ripetuti cicli di microseeding sono tenuti, dove solo la &quot;migliore&quot;I cristalli sono usati per fare il brodo seme per il successivo round. Se possibile, un&quot; precipitante neutrale &quot;, come PEG 3000 deve essere utilizzato per sospendere i cristalli di semi di favorire i contatti cristallo nuovi e cristallizzare complessi che possono essere instabili in alto soluzioni saline-12. </li><li> Esperimenti microseeding classica, in cui viene utilizzato una sola condizione di cristallizzazione, sono spesso utili a seguito della individuazione di una condizione promettente e durante la successiva ottimizzazione. È spesso necessario diluire il porta-seme per ottenere il numero desiderato di cristalli a goccia. Un esperimento &quot;combinatoria&quot; microseeding (dove una serie di ceppi di crescente diluizione sono aggiunti ad una condizione di cristallizzazione) è un metodo rapido per trovare la diluizione ottimale dello stock di sementi. Questo approccio è descritto di seguito. </li></ol> 2. Preparazione del Seme della Fotografico <ol><li> Fai una sonda di vetro arrotondato da una pipetta Pasteur di vetro utilizzando una fiamma Bunsen. <ol><li> Riscaldare la pipetta vicino al centro finché non diventa morbido, poi rimuovere rapidamente dal fuoco ed estrarlo staccando le estremità. Scopo di tirare il bicchiere di diametro inferiore a 0,25 mm. </li><li> Rompere il vetro nel punto in cui è circa 0,25 mm ed brevemente immergersi fine rotto nella fiamma. Ripeti finchè una semisfera di vetro con un diametro di ~ 0,75 millimetri è formata sull&#39;estremità. Questa sonda è utile per la frantumazione di materiale cristallino come è opportunamente dimensionato per urti con oggetti solidi su scala 0,01-1,0 mm e non danneggia la superficie di plastica di una cristallizzazione vassoio sub-bene o coprioggetto. Sonde più grandi (~ 1,0 millimetri) possono schiacciare i piccoli cristalli in modo più efficace perché i cristalli sono intrappolati tra il vetro e la plastica. </li></ol></li><li> Mettere una provetta da 1,5 ml contenente un Seed Bead sul ghiaccio. </li><li> Ispezionare un vassoio di cristallizzazione prestabilita utilizzando un microscopio binoculare o sistema di imaging cristallo e selezionare uno o più appropriato pozzi dal vassoio da cui raccolgono materiale cristallino per ceppo generazione. Qualsiasi materiale può essere utilizzato compresi aghi sottili, sferuliti, microcristalli e irregolari, cristalli mal formati. Lo stock di sementi deve essere fatta al più presto possibile dopo i cristalli smettere di crescere, come materiale più vecchio è più probabile che sia parzialmente reticolata, riducendo così la sua idoneità per l&#39;impiego in esperimenti di semina. In caso di dubbi sul fatto che il materiale cristallino per essere raccolto è sale o proteine ​​del pozzo può essere osservata con un microscopio a fluorescenza UV o sistema di imaging prima dell&#39;apertura, o il materiale cristallino può essere sottoposto a in-situ analisi di diffrazione a raggi X nel vassoio. Quando si utilizzano gli ex cristalli proteici approccio sarà fluorescenza sotto irraggiamento UV, cristalli di sale appariranno incolore. </li><li> Aprire bene il vassoio di cristallizzazione selezionato. Per 96 pozzetti seduta vassoi goccia tagliare il foglio superiore di tenuta di plastica intorno al pozzetto selezionato USIng una lama da bisturi. Per i vassoi goccia appesa a 24 pozzetti rimuovere il vetrino con un paio di pinzette. Capovolgere il vetrino e posizionarlo su una superficie pulita stabile. Rimuovere 50 microlitri della soluzione di riserva e trasferire il liquido alla provetta contenente il Seme branello assicurare che il tubo rimane sul ghiaccio durante. </li><li> Schiacciare a fondo i cristalli in subwell (vassoio 96 pozzetti) o coprioggetto (vassoio 24 pozzetti) gocce, utilizzando la sonda vetro preparato in sezione 2.1, visualizzazione dei risultati sotto un microscopio. Piccoli cristalli possono richiedere diversi minuti per schiacciare a fondo. Questo passo permette lo sperimentatore di verificare che i cristalli sono facili da schiacciare e sono quindi non reticolate, e anche che non sono cristalli di sale. I cristalli di sale producono un caratteristico click che può essere ascoltato e sentito quando sono schiacciati. Se i cristalli sono duri e difficili da schiacciare cercare di ottenere e utilizzare materiale fresco. </li><li> Togliere 5 ml di soluzione di serbatoio dal tubo rocaille e transfer al sub-ben equivalente (seduta esperimento goccia), o coprioggetto (appeso esperimento goccia) contenente il materiale cristallino per essere raccolto. Pipettare questo liquido su e giù 5-6 volte per risospendere tanto del contenuto sub pozzetti o coprioggetto possibile. Riportare la sospensione al tubo rocaille e ripetere questo passaggio altre due volte, in modo che materiale cristallino quanto è raccolto il più possibile. </li><li> Agitare la rocaille per due minuti, fermandosi ogni 30 secondi per raffreddare la provetta in ghiaccio. </li><li> Effettuare una serie di diluizioni, diluendo lo stock di semi in soluzione serbatoio di un fattore di 4-10 in ogni fase. In genere, troppi i cristalli si ottengono quando si utilizza un ceppo non diluito, in modo da utilizzare le scorte di sementi diluito per controllare il numero di cristalli per bene. Nel primo turno di RMM, è importante non diluire la soluzione stock di sementi, in quanto maggiore è la concentrazione dei semi si ottengono le più colpi di cristallizzazione. </li><li> Se non deve essere utilizzato immediatamentetamente, trasferire la sospensione madre seme e il seme azione diluito ad una -20 ° C o -80 ° C per una conservazione. Per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento, che possono ridurre l&#39;efficacia dello stock di sementi, conservare il materiale in piccole aliquote di volume, cioè 10-20 ml. Una volta congelate, le scorte di semi possono essere conservati a tempo indeterminato fino a quando necessario. </li></ol> 3. Istituzione di cristallizzazione vassoi <ol><li> A seconda della disponibilità di strutture di cristallizzazione e le preferenze dello sperimentatore, lo screening cristallizzazione RMM può essere effettuata sia utilizzando i vassoi da 24 pozzetti che impiegano il metodo di diffusione del vapore goccia appesa o piatti a 96 pozzetti utilizzando il metodo di diffusione del vapore goccia seduta. Vassoi di cristallizzazione per RMM possono essere stabiliti sia a mano, utilizzando un liquido movimentazione dispenser robotizzato, o una combinazione dei due. </li><li> Un esperimento tipico RMM istituito dalla mano comprenderà, 1,0 ml soluzione proteica, 1,0 microlitri condizioni di cristallizzazione, e0,5 microlitri ceppo. Un tipico esperimento impostato utilizzando un robot di cristallizzazione comprenderà, soluzione proteica 0,3 ml, 0,2 ml condizioni di cristallizzazione, e 0,1 microlitri stock di semi. </li><li> Per eseguire lo screening RMM in 24 pozzetti appeso vassoi goccia, in primo luogo, con una pipetta manuale, trasferire 300 ml di ciascuna condizione da 96 pozzetti schermo condizione di cristallizzazione in 10 ml formato singolo tubo in ciascun pozzetto di 4 x 24 pozzetti cristallizzazione pregreased vassoi. <ol><li> Trasferire 1 ml di ciascuna condizione cristallizzazione da ciascun serbatoio 300 microlitri sulla superficie di un corrispondente coprioggetto di plastica da cui sono stati rimossi entrambi strisce di protezione protezione anteriori e posteriori. </li><li> Per il 1 ml di ciascuna condizione di cristallizzazione aggiungere 1 ml di soluzione proteica seguiti da 0,5 ml di cristallo ceppo. Invertire ogni coprioggetto tale che la goccia di liquido è rivolta verso il basso e la posizione sopra la appropriata bene. </li><li> Premere verso il basso sul vetrino, comprimendo la sealing grasso e formare una tenuta sicura. Una volta che tutti i 96 gocce sono stabiliti, il vassoio deve essere trasferito in un incubatore o camera a temperatura costante, di solito nell&#39;intervallo 4-18 ° C per una conservazione. </li></ol></li><li> Per eseguire lo screening RMM in 96 pozzetti seduta vassoi goccia in primo luogo trasferire 20-50 ml di ciascuna condizione da un 96-ben schermo condizione di cristallizzazione in formato profondità del blocco e in ciascun corrispondente pozzetto della piastra di cristallizzazione. Questa fase di trasferimento può essere eseguito utilizzando un robot cristallizzazione o un trasferimento manuale utilizzando una pipetta a 8 canali. <ol><li> Soluzioni stock serbatoio Transfer, proteine ​​e sementi verso le gocce a mano o con un robot utilizzando i volumi descritti in 3.1. Alcuni robot cristallizzazione disponibili in commercio non contattare dispense e performante semi di trasferimento di magazzino utilizzando un sistema del genere può causare il blocco di dispensare consigli o tubi associato. L&#39;ordine di erogazione è variabile: alcuni robot dispensare tutte le soluzioni contemporaneamente. Sequesto non è possibile, a meno di proteine, poi serbatoio, poi ceppo. </li><li> Se un contatto erogazione robot non è disponibile di trasmissione i semi utilizzando una siringa di vetro basso volume con ago smussato. Risciacquare l&#39;ago passando attraverso la soluzione serbatoio poi dispensare il brodo seme in ogni goccia. </li><li> Sigillare il vassoio con un foglio di sigillatura trasparente e trasferimento in un&#39;incubatrice o una stanza a temperatura costante per la conservazione. </li></ol></li></ol> 4. Ispezione di cristallizzazione vassoi <ol><li> Visualizza tutti gli esperimenti di cristallizzazione utilizzando sia un microscopio binoculare o un sistema di imaging di cristallo. Che nel primo generalmente all&#39;utente maggiore controllo sulla profondità di vista e il grado di ingrandimento di quest&#39;ultimo, ma richiede più tempo. </li><li> Ispezionare ogni sub-well/coverslip in sequenza e registrare qualsiasi evidenza di formazione di cristalli. Gli esperimenti devono essere controllati una volta ogni 24 ore per 5 giorni successivi stabilimento e lan seguito, una volta ogni 7 giorni per un massimo di 4 settimane. </li><li> Cicli multipli di RMM sono spesso necessari prima di cristalli di qualità ottimale di diffrazione sono prodotti. </li></ol>

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo articolo abbiamo descritto un metodo generale per lo screening RMM la cristallizzazione della proteina. Abbiamo dimostrato con due proteine ​​di prova di un aumento significativo nel tasso di successo di cristallizzazione con questo metodo. Analisi di diffrazione con radiazione di sincrotrone di un sottoinsieme di cristalli generati utilizzando RMM e metodi non RMM rivelato piccola variazione nella qualità di diffrazione tra i cristalli coltivati ​​utilizzando entrambi i metodi, anche se gli autori pr...

Dalla sua domanda iniziale da Perutz, Kendrew e collaboratori nel determinare le strutture di emoglobina e mioglobina, ai moderni ad alto rendimento condotte automatizzati di genomica strutturale consorzi, macromolecolare cristallografia a raggi X ci ha offerto uno scorcio strutturale senza precedenti nel mondo della proteina . Questa tecnica rimane il metodo sperimentale più ampiamente applicabile che permette la visualizzazione diretta della struttura delle proteine ​​a atomico, o vicino risoluzione atomica (cioè nell&#39;intervallo 1-3 Å). Un prerequisito per diffrazione di raggi X da applicare a una proteina è che deve prima essere cristallizzato, ed è questa fase del processo che resta il solo grande fattore limitante nella determinazione della struttura con metodi di diffrazione 1, 2. Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione del processo di cristallizzazione delle proteine, e notevoli miglioramenti nella qualità e disponibilità di schermi di cristallizzazione,vassoi e tecnologie correlate, resta impossibile prevedere in modo affidabile la probabilità di successo di cristallizzazione 3. Metodi biochimici e biofisici possono essere applicati per valutare se una proteina di interesse display caratteristiche favorevoli per la nucleazione e la crescita di cristallo, cioè è ben piegato, omogenea, monodisperse, ecc, tuttavia, queste intuizioni in alcun modo fornire un predittore definitiva di cristallizzazione propensione. Seeding è stato a lungo preteso di essere un metodo praticabile per migliorare il numero, le dimensioni e la qualità dei cristalli esistenti o di materiale cristallino 4-7. Questo approccio si basa sul presupposto che una condizione che supporta cristallo nucleazione può non essere ottimale per la successiva crescita di cristalli e viceversa. Trasferendo materiale nucleate da una condizione all&#39;altra, si può tentare di disaccoppiare efficacemente questi processi, dando così l&#39;accesso al nuovo, ancora inesplorate spazio cristallizzazione,e di conseguenza aumentare il tasso di successo di un esperimento di screening. Metodi stabiliti sono stati documentati per (i) macroseeding, il trasferimento di un singolo cristallo in toto da una condizione all&#39;altra 8, (ii) realizzato semina, il trasferimento di materiale nucleati, generalmente ottenuta mediante l&#39;applicazione di pressione direzionale utilizzando ad esempio baffo di un gatto alla superficie di un cristallo esistente, seguita da successivo passaggio del baffo attraverso una nuova cristallizzazione goccia 9, e (iii) microseeding &quot;classico&quot;, il trasferimento di cristallo &quot;semi&quot;, generati dalla raccolta schiacciato cristalli (o cristallina materiale), in condizioni analoghe a quelle che hanno dato i semi 10. In particolare tutti e tre questi metodi sono molto tempo e poco scalabile, certamente in confronto a ciò che è realizzabile con le moderne di gestione dei liquidi robotica cristallizzazione. Questi fattori hanno contribuito, in qualche modo, almeno, alla percezione che le sementiing è un metodo di essere visitato solo quando altri metodi non sono riusciti a dare i suoi frutti. Microseeding matrice casuale (RMM) è una innovazione metodologica recente che combina i vantaggi di microseeding tradizionale con quelle di screening ad alto rendimento e scalabilità 11-13. Questo approccio si basa sulla generazione di un archivio di sementi, prodotti a partire da materiale cristallino nucleate, che può essere frazionato in / su ciascun sub-well/coverslip all&#39;interno di uno schermo di cristallizzazione 96-condizione standard. Questo metodo è applicabile sia seduto o appendere esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 96-ben 24 pozzetti o. RMM è stato dimostrato sperimentalmente per aumentare significativamente il tasso di successo di cristallizzazione, e produrre cristalli di una maggiore qualità e quantità 11, 13, 14 di diffrazione, e rappresenta uno strumento innovativo nell&#39;arsenale dei cristallografi &#39;di approcci in ongoing sforzo verso il successo cristallizzazione. Qui si descrive un metodo generale per RMM e fornire dati di esempio che illustrano l&#39;efficacia di questa tecnica.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Lo screening matrice microseed casuale (RMM) è una tecnica di cristallizzazione della proteina in cui cristalli di semi vengono aggiunti agli schermi casuali. Aumentando la probabilità che i cristalli crescono nella zona metastabile del diagramma di fase di una proteina, contatti supplementari cristallizzazione si ottengono spesso, la qualità dei cristalli prodotti può essere aumentata, e una buona scorta di cristalli per esperimenti di raccolta dati e da bagno sono forniti. Qui si descrive un metodo generale per RMM che possono essere applicati a entrambi seduti goccia o appesi esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 24-ben 96 pozzetti o.

(A) Esempio di un esperimento RMM Per dimostrare l&#39;efficacia dello screening RMM abbiamo applicato questo metodo per la cristallizzazione di gallina albume lisozima (HEWL) e del fegato bovino catalasi (BLC). Entrambi questi enzimi sono eminentemente cristallizzabile e sono strutturalmente obiettivi 15, 16 ben caratterizzati. Come tale entrambi forniscono ottimi soggetti di prova con cui illustrare il tasso di successo di cristallizzazione maggiore ottenibile con RMM. Esperimenti ...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Qui si descrive un metodo generale per lo screening matrice microseed casuale. Questa tecnica è indicata per aumentare in modo significativo il tasso di successo di cristallizzazione della proteina esperimenti di screening, ridurre la necessità di ottimizzazione, e di fornire un approvvigionamento affidabile di cristalli per la raccolta di dati ed esperimenti ligando-ammollo.

Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  University of Bristol.  Qui si descrive un metodo generale per lo screening matrice microseed casuale. Questa tecnica è indicata per aumentare in modo significativo il tasso di successo di cristallizzazione della proteina esperimenti di screening, ridurre la necessità di ottimizzazione, e di fornire un approvvigionamento affidabile di cristalli per la raccolta di dati ed esperimenti ligando-ammollo. 

Video: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Ricerca

Biologia

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

Preparazione del Mgm101 ricombinazione delle proteine ​​da Strategy Tagging MBP-based

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...