Ringraziamo R. Heintzmann per discussioni fruttuose durante lo sviluppo di un approccio strisce-illuminazione, K. Rajewsky e A. Haberman per fornire C57BL / 6 B1-8 GFP topi transgenici. Riconosciamo la Deutsche Forschungsgemeinschaft in concessione NI1167/3-1 (a RN), HA5354/4-1 e SFB633, A15 progetto (AEH), la Charité in concessione Rahel-Hirsch borsa di studio (per RN) per il sostegno finanziario. In particolare, ci riconosciamo la rete JIMI per le discussioni fruttuose e supporto infrastrutturale

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).</li><li>Esplugues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Th17+cells+occurs+in+the+small+intestine.">Control of Th17 cells occurs in the small intestine.</a> Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).</li><li>Hauser, A. 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U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).</li><li>Berning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain.">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551 (2012).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced optical imaging. , (2001).</li><li>Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shack-Hartmann-wave+front-sensor-based+adaptive+optics+system+for+multi-photon+microscopy.">Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).</li><li>Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+in+microscopy.">Adaptive optics in microscopy.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).</li><li>Niesner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+single+and+multibeam+two-photon+microscopy+for+high-resolution+and+high-speed+deep+tissue+and+intravital+imaging.">The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.</a> Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).</li><li>R&#252;ckel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+wave-front+correction+in+TPM+using+coherence-gated+wave-front+sensing.">Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).</li><li>Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique.">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li><li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues.">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation.">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li><li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+intravital+microscopy.">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+structured-illumination.">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li></ol>

Volker Andresen è azionista di LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Germania. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse.

Lo scopo di imaging ottico intravital è di visualizzare dinamicamente e funzionalmente motilità e interazioni cellulari per comprendere tessuto e funzione degli organi in salute e malattia 5. Il più potente tecnologia per ottenere questo, multi-fotone microscopia a scansione laser, deve ancora superare le limitazioni relative a onda distorsioni anteriori, dispersione, acquisizione lenta, photobleaching e photodamage, che limitano la sua risoluzione spaziale, contrasto nonché la sua risoluzione temporale ....

Due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM), con i suoi vantaggi per l&#39;imaging dei tessuti profondi relativi a infrarossi ultra-short di eccitazione impulsiva 1, ha rivoluzionato il nostro punto di vista sui processi vitali a livello di singola cellula rivelando motilità e l&#39;interazione di vari modelli sottopopolazioni di cellule negli animali viventi 2-5. Tuttavia, la tecnologia attuale è ancora insufficiente a chiarire i meccanismi di funzionamento degli organi e disfunzioni come prerequisito per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, in quanto rende solo informazioni sparse sulle basi molecolari della risposta cellulare all&#39;interno dei tessuti nella salute e nella malattia. La tecnologia attuale permette solo una finestra spaziale di poche centinaia di micron dovuta alla dispersione ed effetti di distorsione d&#39;onda anteriori risoluzione spaziale e rapporto segnale-rumore 6, che sono particolarmente evidenti nel tessuto altamente compatto di animali adulti. Questi effetti di distorsione anteriori di scattering e onda sono dovute ad un un ambiente altamente eterogeneod anisotropo distribuzione dell&#39;indice di rifrazione in tessuto, che porta in un primo passo per una profondità dipendente deterioramento della risoluzione spaziale 3D e infine alla perdita totale del segnale proveniente dai fotoni di eccitazione balistici, cioè la perdita di rapporto segnale-rumore. In termini di bioscientific e applicazioni biomediche tessuti profondi, questo significa che la tecnologia attuale è in grado di rivelare inequivocabilmente comunicazione cellulare perché scarsa risoluzione comporterebbe interazioni falsamente positivi mentre la riduzione del rapporto segnale-rumore causerebbe il sistema trascurare alcuni interazioni tra strutture dim. Per rilevare inequivocabilmente interazioni cellulari in modo dinamico, una risoluzione spaziale elevata è necessario migliorare la profondità all&#39;interno del tessuto. Le potenti tecniche nanoscopia attualmente introdotte sulla base di algoritmi numerici particolari, ad esempio approcci struttura illuminazione, sulla deplezione del primo stato eccitato, ad esempio </em&gt; STED, RESOLFT, o sulla localizzazione molecola, ad esempio dSTORM, PALM, hanno trovato numerose applicazioni in cellule fissate e in colture cellulari Live 7. Tuttavia, al fine di estendere queste applicazioni per sezioni di tessuto, tessuto vivente e organismi abbiamo ancora bisogno di superare le gravi difficoltà tecniche. Eccitazione a due fotoni STED con differenti lunghezze d&#39;onda e con una singola lunghezza d&#39;onda (sw2PE-STED) per eccitazione e di emissione stimolata è stata applicata per migliorare la risoluzione laterale in fettine cerebrali 8 o artificiali in matrici di celle incorporate 9, rispettivamente, allo stesso risoluzione assiale TPLSM standard. Utilizzando un fotone STED, le dinamiche di spine dendritiche potrebbero essere esposte alla superficie della corteccia cerebrale (fino a 10-15 micron di profondità) in un topo vivente Thy1 EGFP con una risoluzione di 67 nm 10. Uno strumento versatile per la biologia dello sviluppo è fornito dalla multifocale microscopio strutturato-illuminazione, che fornisce duplice migliorato 2Drisoluzione. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata solo in organismi con una bassa propensione di diffusione della luce come embrioni di pesce zebra 11. Tuttavia, nessuna di queste tecniche può essere applicata nel tessuto altamente dispersione di animali adulti in diverse centinaia di micrometri, che sono modelli cruciali per la ricerca biomedica e clinica delle malattie con insorgenza dopo la nascita. Indipendentemente dal approssimazione utilizzato per calcolare la forma del fronte d&#39;onda a diffrazione limitata, cioè la funzione del punto di diffusione (PSF), dopo la focalizzazione attraverso una lente, la larghezza della PSF lungo l&#39;asse ottico (risoluzione assiale) è almeno tre volte più grande la larghezza PSF perpendicolare all&#39;asse ottico (risoluzione laterale) 12. Onda distorsioni anteriori dei diversi ordini quantificati mediante coefficienti di Zernike modificato notevolmente la forma del fronte d&#39;onda dell&#39;onda elettromagnetica focalizzata nella rappresentazione del tessuto profondo che porta a molto più grandi PSF, specialmente lungo l&#39;otticaal all&#39;asse 13-15. Quindi, entrambe le leggi di diffrazione e gli effetti di distorsione del fronte d&#39;onda indicano la risoluzione lungo l&#39;asse ottico come il fattore limitante nella rappresentazione dei tessuti profondi. Considerando che le tecniche nanoscopia si concentrano sulla lotta contro i limiti di diffrazione solo, è necessaria una tecnologia che migliora la risoluzione assiale e il contrasto contrastando sia la diffrazione ed effetti di distorsione delle onde-front per imaging ad alta risoluzione intravitale. Idealmente, questa tecnica dovrebbe essere anche abbastanza veloce per consentire il monitoraggio delle dinamiche cellulari. La correzione in tempo reale di aberrazioni di FPF e la perdita di contrasto utilizzando ottiche adattive in TPLSM è stato ampiamente studiato e migliorato negli ultimi dieci anni 13,14,16-18 ed è quindi la scelta migliore attualmente disponibile che porta ad una migliore gestione dell&#39;eccitazione balistico Fotoni 14. Ancora, a causa del fatto che la maggior onda correzione anteriore approcci utilizzati in ottica adattiva sono iterativo e che ettarove essere ripetuto per piccole aree (pochi 10 x 10 micron 2) a causa dell&#39;elevata eterogeneità dell&#39;indice di rifrazione nel tessuto, la velocità di acquisizione è significativamente inferiore a quello necessario per la motilità cellulare imaging e comunicazione. Inoltre, il limite fisico in adattativi ottica migliorata TPLSM è ancora determinato dalla diffrazione. Modulazione spaziale di illuminamento (SPIN) e modulazione temporale sul lato rivelazione (SPADE) sono stati teoricamente proposto da applicare alla microscopia a scansione laser per migliorare la risoluzione. La loro applicazione pratica nel campo dell&#39;imaging intravitale resta da dimostrare 19. Presi insieme, vi è una forte domanda per lo sviluppo di tecnologie che migliorano la risoluzione per l&#39;imaging del tessuto profondo nel vivere animali adulti. In questo lavoro, raggiungiamo la modulazione spaziale del modello di eccitazione controllando il processo di scansione in multi-beam strisce-illuminazione multi-fotone laser-smicroscopia conserviera (MB-SI-MPLSM) 20. Contrariamente agli approcci illuminazione strutturati, in cui la sezione di eccitazione traversa è spazialmente modulata, usiamo solo il processo di scansione per ottenere la modulazione spaziale della eccitazione. Espandendo l&#39;eccitazione di una lunghezza d&#39;onda, siamo in grado di migliorare sia la risoluzione spaziale e rapporto segnale-rumore in tessuto profondo fortemente diffondenti di tessuto (per esempio linfonodi, cammino libero-dispersione 47 micron 6), indipendentemente dalla ottica segnale non lineare si rileva, ad esempio, fluorescenza, generazione di seconda armonica o altra frequenza di miscelazione fenomeno. Usando questo approccio a lunghezze d&#39;onda di eccitazione fino a 900 nm, possiamo dinamicamente immagine strutture proteiche cellulare su scala di poche molecole in centri germinali dei linfonodi del mouse. Così, si può visualizzare meglio l&#39;interazione tra unità di antigene trasportano sulla superficie delle cellule follicolari dendritiche e cellule B nel processo di tastatura antiGen durante la risposta immunitaria in organi linfoidi secondari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">ATTO590 &#8211; NSH for coupling</td>
			<td style="width:99px;">ATTO Tec, Germany</td>
			<td style="width:119px;">AD-590-35</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">CD21/35 &#8211; Fab fragment &#8211; ATTO590</td>
			<td style="width:99px;">DRFZ, Berlin</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">B1-8 Jk-/- EGFP+</td>
			<td style="width:99px;">Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment&#160;</td>
			<td style="width:99px;">StemmCell Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19854</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Polystyren beads (605), 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F8803</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">TriMScope I</td>
			<td style="width:99px;">LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OPO (manual version)</td>
			<td style="width:99px;">APE, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:99px;">Coherent, Duisburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td>
			<td style="width:99px;">Olympus Germany, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly resolved intravital striped-illumination microscopy of germinal centers

Monitoraggio della comunicazione cellulare da intravital tessuto profondo microscopia multi-fotone è la chiave per comprendere il destino delle cellule immunitarie all&#39;interno di campioni di tessuti spessi e gli organi in salute e malattia. Controllando il modello di scansione in microscopia multi-fotone e l&#39;applicazione di algoritmi numerici appropriati, abbiamo sviluppato un approccio strisce-illuminazione, che ha consentito di ottenere 3 volte migliore risoluzione assiale e miglior rapporto segnale-rumore, cioè contrasto, in più di 100 micron di profondità il tessuto all&#39;interno altamente dispersione del tessuto degli organi linfoidi rispetto allo standard di microscopia multi-fotone. La velocità di acquisizione nonché effetti Fotodecolorazione e fotodanneggiamento erano simili alla tecnica basata fotomoltiplicatore standard, mentre la profondità di immagine era leggermente inferiore a causa dell&#39;uso di rilevatori di campo. Utilizzando l&#39;approccio strisce-illuminazione, siamo in grado di osservare le dinamiche dei depositi complessi immuni sulle cellule follicolari dendritiche secondarie ̵1; sul livello di alcune molecole proteiche in centri germinativi.

Risoluzione spaziale nei linfonodi Le dimensioni della funzione del punto di diffusione efficace (EPSF) corrispondono alla risoluzione spaziale di un microscopio 12. Abbiamo misurato questa funzione tre dimensionale acquisendo il segnale di seconda generazione armoniche di fibre collagene nei linfonodi dal nostro MB-SI-TPLSM rispetto alle stabiliti tecniche di microscopia a scansione laser a due fotoni, cioè TPLSM rilevamento di campo (mediante telecamere CCD) e TPLSM rilev...

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Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  Leibniz Institute.  Ad alta risoluzione intravital immagini con maggiore contrasto fino a 120 micron di profondità in linfonodi di topi adulti si ottiene spazialmente modulando il pattern di eccitazione di un microscopio a due fotoni multifocale. In 100 micron di profondità abbiamo misurato risoluzioni di 487 nm (laterali) e 551 nm (assiale), eludendo così dispersione e diffrazione limiti. 