Vorremmo ringraziare il Dott. Davide Olivieri per la revisione critica di questo manoscritto, il Dr. Moreno Nuno per l&#39;aiuto logistico per costruire il nostro titolare animali e cuscinetti termici e il Dott. Vijay K. Kuchroo per la donazione tipo di Foxp3-KI GFP / GFP topi. Questo lavoro è supportato da &quot;Fundação para Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portogallo), concedere # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. Animal preparazione Note importanti: sospensioni cellulari BM e trapianti timica sono state effettuate in condizioni asettiche. Le sospensioni BM sono stati preparati all&#39;interno del cappuccio della nostra camera coltura cellulare, mentre il trapianto di timo è stata eseguita in sala operatoria situata all&#39;interno della nostra struttura animale. Al fine di mantenere e garantire queste condizioni asettiche, non ci era permesso di registrare il nostro video in questi luoghi. Tuttavia, tutti i materiali chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave e la panchina chirurgica è stata precedentemente puliti con Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) e il 70% di etanolo. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) ed erano in accordo con la Federazione delle Associazioni degli animali europea Science Laboratory (FELASA) direttive. Il numero ID approvazione è AO10/2010. Tutti gli esperimenti sono stati procedure immagine del terminale e gli animali sono stati sottoposti ad eutanasia immediatamente successivo alla fine di immagineacquisizione. La procedura dettagliata è la seguente: <ol><li> Irradiare (con un γ-irradiatore) 8 settimane topi vecchi Nudo con 900 rad per distruggere i precursori emopoietici endogena all&#39;interno dell&#39;osso zucchine (BM). Dopo l&#39;irradiazione, tornare gli animali nelle loro gabbie fino a preparare le cellule del donatore BM per iniezione endovenosa e ulteriormente ricostituzione BM. Questo trasferimento BM è stata eseguita 1 ora dopo l&#39;irradiazione. </li><li> Separare gli animali donatori BM. Tibie e femori degli arti posteriori di un animale sono generalmente sufficienti a ricostituire fino a 3 animali destinatario. Dopo l&#39;eutanasia con la CO 2, rimuovere gli arti posteriori e quindi rimuovere la pelle ei muscoli dalle ossa. </li><li> Tagliare l&#39;estremità chiusa di ogni osso e lavare con PBS (o RPMI) o schiacciarli tutti in un mortaio, con un pestello, con 2 ml di PBS (o RPMI) per rimuovere il BM. </li><li> Disturbare la struttura BM in una cella singola sospensione da ripetizioni di aspirazione USI vigorosang una pipetta P1000. In alternativa, si può anche passare la BM in tutto un ago 21G siringa più volte. Centrifuga (400g, 5 min, RT), risospendere le cellule in PBS, e iniettare per via endovenosa nel vostro nude-irradiati destinatari. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato BM da Foxp3-KI GFP / topi GFP in cui tutte le cellule T regolatorie (Tregs) esprimono GFP 1. </li><li> L&#39;accettazione del BM donatore si verifica nei primi giorni dopo il trasferimento, in quanto il mancato BM-ricostituito gli animali non possono sopravvivere più di 14 giorni. Tuttavia, si dovrebbe attendere da 4 a 6 settimane per consentire il recupero completo di tutti i comparti BM. Bactrim (Roche) è stato aggiunto all&#39;acqua (2 mg / ml) durante la prima settimana dopo l&#39;irradiazione per diminuire il rischio di infezioni batteriche. </li><li> Timo trapianto embrionale è stato già descritto 2. In breve, coppie di iniziare ad allevare topi isogeniche e verificare la presenza di collegare (la prova del coito) ogni giorno. Separare le femmine collegato e CO 2-li eutanasia il giorno 15 di pregnAncy (osservazione della spina è il giorno 1 di gravidanza). Rimuovere gli embrioni e il timo. Posizionare il timo embrionale in PBS freddo fino al trasferimento. </li><li> Per eseguire il trapianto di timo, anestetizzare BM-destinatario topi nudi con ketamin (120 mg / g di peso del mouse) / xylazina (16 mg / g di peso del mouse) e tenerli su di una piastra elettrica a 37 ° C fino a quando non si inconscio. </li><li> Esporre chirurgicamente il rene per eseguire il trapianto di timo. In primo luogo scrub la pelle con ChloraPrep (CareFusion Inc.) e il 70% di etanolo. Poi, fare un 1 cm taglio sulla pelle del dorso-laterale parte del corpo dell&#39;animale, 2 mm sotto l&#39;ultima costola toracica. </li><li> Tagliare la cavità peritoneale ed estrarre il rene di questa cavità. Fai un piccolo taglio superficiale nella capsula renale con una lama da bisturi. Utilizzando pinze con una punta molto sottile fare una sacca sotto la capsula renale del mouse destinatario e aggiungere fino a 4 lobi del timo in questo sacchetto. </li><li> Mettere il rene b<html> ack al suo posto, sutura la cavità peritoneale con uno o due punti, e quindi chiudere la pelle del mouse utilizzando lo stesso metodo di sutura. In alternativa, suture può essere fatto utilizzando colla chirurgica. </li><li> Iniettare analgesici (Butorfanolo a 5 mg / kg) per via sottocutanea a destra dopo aver terminato l&#39;intervento chirurgico per evitare il dolore degli animali e tenere gli animali in una piastra elettrica fino a quando iniziano a riprendersi dall&#39;anestesia. I topi sono in gabbia individuale per i primi 3 giorni dopo il trapianto per evitare che i compagni gabbia di rimuovere i punti. Rimozione punti di sutura dopo 1 settimana. </li><li> Topi nudi non hanno cellule T. Pertanto, è possibile valutare l&#39;accettazione timo innesto monitorando la percentuale di CD4 + e CD8 + cellule T nel sangue. Una volta alla settimana, 2 settimane dopo il trapianto di timo, sanguinare gli animali e la macchia di sangue con anti-CD4 e anticorpi monoclonali anti-CD8 (MAbs). Quando i CD4: CD8 rapporto è di circa 2:1, il timo trapiantato è pienamente funzionale (Figura 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. Acquisizione di immagini intravitale Preparare tutto il materiale necessario in anticipo e metterle da parte. <ol><li> Anestetizzare gli animali con ketamin / xylazina (stessi dosaggi indicati al punto 1.5) e metterli su una piastra elettrica a 37 ° C. Iniettare 100 ml di rodamina B isotiocianato-destrano (20 mg / ml in PBS) per via endovenosa per permettere la visualizzazione futura del flusso sanguigno. </li><li> Esporre il rene trapiantato che contiene il timo secondo il protocollo precedentemente descritto al punto 1.6. </li><li> Per evitare che il rene di tornare nella sua posizione originale, chiudere i lati laterali della incisione cutanea con punti di sutura. </li><li> Posizionare un pezzo di PBS-cotone imbevuto sulla parte superiore dell&#39;organo per mantenerlo umido. </li><li> Mettete il termoforo sulla parte superiore del palco titolare animale (Figura 2A). </li><li> Mettere l&#39;animale in cima alla piastra elettrica nel supporto animale, fino organo (Figura 2B). </li><li> Pizzicare l&#39;organo, in entrambi i lati con una pinza mfacciata di foglio di alluminio sottile (Figura 2C). </li><li> Chiudere il detentore degli animali e posizionare la sonda in alto riscaldatore il più vicino possibile al tessuto (Figura 2D). Questa sonda riscaldatore misura costantemente la temperatura dell&#39;organo e invia queste informazioni al riscaldatore per regolare la corrente elettrica, mantenendolo a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il PBS-cotone imbevuto e aggiungere basso punto di fusione di agarosio (2% in PBS) a 30 ° C sulla parte superiore della vostra preparazione. </li><li> Coprire l&#39;intera preparazione con il riscaldatore superiore (Figura 2E). In apertura di questo riscaldamento vi è il coprioggetti isolare l&#39;agarosio dall&#39;obiettivo (Figura 2F). Monitorare l&#39;anestesia del mouse e iniettare una mezza dose di richiamo ogni 40 min. Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, l&#39;eutanasia con l&#39;animale di CO 2. </li></ol> Nota: le immagini della clip foglio di alluminio e il riscaldatore superiore è presentato in Figura 3. 3. A due fotoni di acquisizione immagini Abbiamo usato un montante &quot;Prairie Ultima XY&quot; microscopio a due fotoni. Il nostro sistema è equipaggiato con un laser Ti: zaffiro, quattro PMT superiore per il controllo simultaneo fino a 4 canali acquisizioni e un obiettivo 20x immersione in acqua. <ol><li> Accendere il laser Ti: zaffiro e il sistema intero microscopio. </li><li> Aggiungi specchi dicroici e set di filtri in base alla lunghezza d&#39;onda desiderata. Nel nostro caso abbiamo usato una Olympus-BX2 titolare Chroma contenente un specchio dicroico 565 nm, una 525/50 nm filtro (per Foxp3-GFP segnale), e un 595/50 nm filtro (per Destrano-Rodamina-B del segnale all&#39;interno dei vasi sanguigni ). La gamma di lunghezze d&#39;onda laser utilizzato è stato tra i 880-900 nm. </li><li> Aggiungere il detentore degli animali al microscopio, collegare e accendere tutte le stufe, aggiungere acqua sul diaframma riscaldatore superiore, con attenzione abbassare l&#39;obiettivo in acqua, e concentrarsi su una nave o di alcune GFP-Tregs. </li><li> Con il microscopio x, y, z di controllo esterno, in modo rapido sondaggio il tessuto per individuare una regione<html> di interesse. </li><li> Regolare il guadagno del PMT per ottimizzare la separazione dei colori e minimizzare la quantità di laser necessario a conseguire segnale sufficiente rispetto alla media. Tenta di utilizzare la quantità minima di laser per evitare foto-danneggiamento del tessuto. </li><li> Una volta che la regione di interesse si trova, iniziare time-lapse imaging. Nel nostro caso, un tipico 5D (x, y, z, t, e il colore) protocollo di acquisizione consiste nell&#39;acquisizione immagini sequenziali di un micron, profondità 50 del volume del tessuto, suddivisi in 4,0 micron z-gradini, x e y lunghezza di 140 micron ciascuno. Ogni volume è di circa 30 secondi per essere acquisita. Pertanto, il 60 acquisizioni che si esibiranno per 30 minuti di acquisizione delle immagini. </li><li> Trasferire i dati al server istituzionali e utilizzare ImageJ, Imaris, Volocity o software per eseguire il rendering multi-dimensionale e il monitoraggio delle cellule. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <html> g1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. . Embrionali accettazione timo e la funzione Dopo BM recuperare, timo embrionali sono state trapiantate a BM animali ricostituito, due settimane dopo il trapianto di timo, questi topi sono stati dissanguati una volta alla settimana per monitorare la percentuali dei sottotipi di cellule T con la colorazione anti-CD4 o anti-CD8 MAbs. Abbiamo considerato il timo è stato accettato con successo negli animali con un CD4: CD8 rapporto intorno 1.5-2.0:1 (A). Per confermare la sua funzionalità, abbiamo sacrificato qualche timo-trapiantati animali e confrontato la percentuale delle diverse sottopopolazioni timocita con i topi WT (B). Le percentuali di doppio negativo (DN, CD4 - CD8 - timociti) sottopopolazioni (dalla colorazione con anticorpi anti-CD25 e anti-CD44 MAbs), doppio-positivi (DP; CD4 + CD8 + timociti) e single-positivi (SP) CD4 + o CD8 + timociti erano simili tra questi animali. ig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Titolare di assemblaggio degli animali. Dopo profondamente anestetizzati, l&#39;animale viene messo in cima ad una piastra elettrica, precedentemente montato sulla parte superiore del palco titolare animale (A). Il rene trapiantato contenente il timo è rivolto verso l&#39;alto (B). Un morsetto di alluminio pizzichi delicatamente il rene intero (C) per tenerlo in posizione. Fig. 1C inserire mostra in dettaglio il morsetto. La parte superiore del supporto animale sia messo in atto (D). Il PBS-cotone imbevuto viene rimosso dalla parte superiore dell&#39;organo, sostituito da calde basso punto di fusione agarosio, e il riscaldatore superiore è aggiunto (E). Infine, tutta l&#39;assemblea è trasferito al microscopio, qui rappresentato dalla responsabilità oggettiva (F). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> Figura 3. Dettagli di parti titolare. Queste immagini mostrano la fascetta foglio di alluminio (A) che fissano il rene (B). Nota anche la regione dove si trova il timo trapiantato. Questo indica approssimativamente la regioneper tagliare la capsula timo e fare la tasca per mettere il timo embrionale. Il coprioggetti riscaldatore superiore (C) è stato fissato con colla al silicone per la sua parte in basso (D). Movie 1. Intravitale immagini di Foxp3-GFP + timociti all&#39;interno del timo dove erano custoditi i livelli fisiologici di ossigenazione e temperatura (37 ° C) durante tutto il processo. Si noti il ​​flusso di sangue e il movimento di Tregs. Queste velocità può essere misurata e confrontata con i dati pubblicati. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Clicca qui per visualizzare il filmato.</a> Movie 2. Intravitale imaging di Tregs all&#39;interno di un timo, dove sono state acquisite le immagini a 30 ° C. Si noti l&#39;assenza di movimento e la forma rotonda delle celle, nonostante il mantenimento del flusso sanguigno. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Clicca qui per visualizzare il filmato.</a>

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	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo lavoro abbiamo dimostrato le procedure per l&#39;imaging a due fotoni di timociti all&#39;interno di un animale vivo. Abbiamo anche descritto alcuni parametri che si dovrebbe controllare attentamente, come la continuazione del flusso sanguigno e il mantenimento della temperatura dell&#39;organo durante le procedure di imaging. Tuttavia, nonostante gli sforzi attenzione a mantenere l&#39;organo stabile, artefatti da movimento come &quot;organo alla deriva&quot; può verificarsi. Correzione delle immagini posteriore può essere eseguita dallo sviluppo di algoritmi specificamente progettati per questo scopo. Ulteriori analisi di immagine potrebbe anche essere fonte di nuovi protocolli di sviluppo che cerca di minimizzare gli errori. Il timo è l&#39;organo dove si producono tutte le cellule T e, quindi, è l&#39;organo dove immunologi interessati a capire la generazione di γδ, CD4, CD8 o cellule T si concentrerà la loro attenzione. Maggior parte degli studi riguardanti le cellule T sono basate su differenze nei numeri e / o la stabilità di questi cells dopo diverse in vitro / in vivo manipolazioni. Tuttavia, solo dopo la visualizzazione in vivo, abbiamo potuto osservare l&#39;interazione tra le cellule del sistema immunitario coinvolte nel mantenimento dell&#39;omeostasi 3-7. Pertanto, l&#39;osservazione in vivo di timociti è probabilmente una delle informazioni più importanti mancanti per comprendere meglio la biologia delle cellule T. Intravitale TPM fornisce un quadro dettagliato dei movimenti e le interazioni delle cellule T e qui si dimostra come può essere utilizzato per studi dettagliati timocita. Tuttavia, ogni tecnica ha i suoi limiti. Mentre intravitale acquisizione di immagini è il sistema più accurato per riflettere il comportamento delle cellule all&#39;interno del corpo, è anche vero che l&#39;acquisizione di immagini di organi espiantati è meno laborioso ed è stato utilizzato per raccogliere informazioni importanti sul sistema immunitario 8,9. Inoltre, non si può negare metodi di imaging intravitale richiedere un intervento chirurgico per esporre i tessuti e vasi sanguigni in animali anestetizzati,che di per sé potrebbe causare una alterazione della fisiologia dell&#39;organo intero 10. Tuttavia, ci sono in modo non invasivo i metodi che aboliscono gli artefatti causati dalla procedura chirurgica 11 e nuovi metodi sono in fase di sviluppo che meglio preparare in anticipo gli animali da utilizzare 12. Pertanto, le nuove procedure chirurgiche e pedaggi ridurrà al minimo o aggirare le limitazioni reali di acquisizione immagini intravitale e diventano sempre più accessibili alla comunità scientifica. Abbiamo dimostrato che il metodo che abbiamo descritto è fattibile e riporta tutto in vivo manipolazioni sistemici, la somministrazione di questi farmaci, che abbiamo usato. Quindi, si consiglia l&#39;uso di questo metodo insieme a tecniche di ex vivo già disponibili al fine di integrare e rafforzare ulteriormente gli studi sullo sviluppo timociti.

<table border="1"><thead><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rodamina B ishothiocyanate-Destrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> preparare stock a 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Microscopio a due fotoni </td><td> Prairie Technologies Inc. </td><td> Prairie Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: zaffiro laser </td><td> Coherent, Inc. </td><td> Chameleon Ultra Famiglia </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA immersione obiettivo </td><td> Olympus Inc. </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Titolare (Filtri / dicroici) </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dicroico </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitplane AG Inc. </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer Inc. </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, USA </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

Microscopia a due fotoni (TPM) fornisce l&#39;acquisizione di immagini in aree dentro tessuti e organi. In combinazione con lo sviluppo di nuovi strumenti stereotassica e procedure chirurgiche, TPM diventa una potente tecnica per identificare i &quot;nicchie&quot; all&#39;interno di organi e al documento cellulari &quot;comportamenti&quot; di animali vivi. Mentre l&#39;imaging intravitale fornisce informazioni che meglio ricorda il reale comportamento cellulare all&#39;interno dell&#39;organo, è sia più faticoso e tecnicamente impegnativo, in termini di attrezzature necessarie / procedure alternative di acquisizione ex vivo imaging. Così, si descrive una procedura chirurgica e romanzo titolare &quot;stereotassica&quot; organo che ci permette di seguire i movimenti di Foxp3 + all&#39;interno delle cellule del timo. Foxp3 è il principale regolatore per la generazione di cellule T regolatorie (Tregs). Inoltre, queste cellule possono essere classificati secondo la loro origine: cioè. timo differenziato Tregs sono chiamati &quot;in natura Tregs&quot; (nTregs), o comepposed a livello periferico, convertito Tregs (pTregs). Anche se notevole quantità di ricerche è stato riportato in letteratura riguardanti il fenotipo e la fisiologia di queste cellule T, molto poco si sa circa la loro interazione in vivo con altre cellule. Questa carenza può essere dovuto alla mancanza di tecniche che permettono tali osservazioni. Il protocollo descritto in questo articolo fornisce un rimedio per questa situazione. Il nostro protocollo prevede l&#39;utilizzo topi nudi che mancano di un timo endogena dal momento che hanno una mutazione puntuale nella sequenza di DNA che compromette la differenziazione di alcune cellule epiteliali, tra cui le cellule epiteliali del timo. Topi nudi sono state gamma-irradiati e ricostituito con zucchine osseo (BM) da Foxp3-KI GFP / GFP topi. Dopo il recupero BM (6 settimane), ogni animale ha ricevuto il trapianto di timo embrionale all&#39;interno della capsula renale. Dopo l&#39;accettazione del timo (6 settimane), gli animali sono stati anestetizzati, il rene che contiene iltimo trapiantato è stato esposto, titolare fisso nel nostro organo, e tenuto in condizioni fisiologiche di imaging in vivo da TPM. Abbiamo utilizzato questo approccio per studiare l&#39;influenza di droghe nella generazione di cellule T regolatorie.

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Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l&#39;acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell&#39;identificazione di &quot;nicchie&quot; all&#39;interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  Instituto Gulbenkian de Ciência. Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...