Questo lavoro è finanziato dal Canadian Institutes of Health Research, Fondazione canadese per l&#39;innovazione, University of British Columbia Centro di Ricerca del sangue e University of Northern aC.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Reagenti da utilizzare in tutta l&#39;esperimento deve essere preparato prima di iniziare il protocollo chirurgico. Si noti che tutte le soluzioni sono state effettuate utilizzando una tecnica sterile. </li><li> Soluzione fisiologica salina (PSS) è meglio preparato in due componenti: la soluzione di base sale e bicarbonato di sodio. Preparare entrambe le soluzioni a concentrazione 20X e conservare a 4 ° C. Bicarbonato di sodio a 20X è 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) e soluzione salina di base a 20X concentrazione è 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), e 23,4 mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Le soluzioni devono essere preparate in dH 2 O e sostanze chimiche devono essere aggiunti uno alla volta e mescolate fino a quando la soluzione è chiara prima di aggiungere il successivo chimica </li><li> Preparare 2L di PSS diluendo volumi uguali di bicarbonato di sodio e di soluzione salina di base e diluito a concentrazione 1X (per due 2L di PSS diluire 100 ml di ogni soluzione di bicarbonato di sodio e sali di base in dH 2 O </li><li> Luogo matraccio 2L contenente PSS e PSS in acqua a 37 ° C bagno. Equilibrare la soluzione con il 5% di CO 2 / gas azoto equilibrio per 1 ora prima dell&#39;inizio della procedura chirurgica. </li><li> Prodotti chimici vasoattivi (es. fenilefrina, l&#39;acetilcolina, nitroprussiato di sodio) sono meglio preparati a concentrazione 1M in dH2O e conservati in 100μl aliquote a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Determinare il peso del mouse e somministrare la dose iniziale di sodio pentobarbital a 90mg/kg mediante iniezione intraperitoneale. Nel corso della procedura il mouse è continuamente monitorato per il piano di anestesia attraverso pizzico punta e attento esame della frequenza respiratoria. Ulteriori iniezioni di sodio pentobarbital deve essere somministrata, se necessario a 20mg/kg per mantenere aereo anestesia. L&#39;aereo chirurgico di anestesia viene mantenuta in conformità con le normative federali e istituzionali, come indicato nel protocollo di cura degli animali approvato dalla cura degli animali e del Comitato uso (ACUC) della University of Northern aC. </li><li> Rimuovere i capelli dalla zona addominale e fianchi / hip da rasoio. Eliminare le rimanenti capelli sciolti da tampone imbevuto di alcool e picchiettando l&#39;area con del nastro adesivo. Questo è sufficiente come questa procedura sperimentale è terminale. </li><li> Posizionare il mouse su un bordo chiaro chirurgico in posizione supina e collegare il mouse al bordo con nastro adesivo ogni zampa alla scheda. La temperatura corporea è mantenuta attraverso una lampada di calore esterno e monitorati tramite termometro rettale per garantire che l&#39;ipotermia non si verifica a causa di anestetico. </li></ol> 3. Procedura chirurgica <ol><li> Durante l&#39;intera procedura chirurgica garantire tessuti esposti è sempre tenuto superfused con equilibrata soluzione PSS riscaldata. E &#39;anche importante fare mai il contatto con la vascolarizzazione di interesse con strumenti chirurgici o danneggiare i vasi mettendo a molta forza su di loro attraverso la manipolazione del tessuto adiposo e del tessuto connettivo che li circonda. </li><li> Posizionare il mouse nell&#39;ambito di applicazione dissezione. Fai una incisione lungo la linea mediana della superficie ventrale della cavità addominale e ritrarre la pelle in direzione della colonna vertebrale del mouse. </li><li> Una volta che la pelle è ritratta in modo che la LN è facilmente visibile, la pelle perno su un piedistallo trasparente Sylgard 184. </li><li> Rimuovere il sottile strato di tessuto connettivo sovrapponendo l&#39;area intorno alla LN </li><li> Chiara la sovrapposizione del tessuto adiposo e circondano il linfonodo finché il letto microvascolare è esposto. Il segmento principale arteria stabilisce adiacente alla LN ed è comunemente sovrapposto dal venule. L&#39;intervento intero dura circa 30 minuti. </li></ol> 4. Imaging e Vessel Analysis <ol><li> Una volta che il segmento del vaso di interesse è esposto nell&#39;ambito di applicazione dissezione, fissare il preparato sul microscopio intravitale. Si noti che animale rimane sul tabellone chiaro chirurgico, mentre il microscopio intravitale per tutta la durata dell&#39;esperimento. La temperatura corporea è mantenuta attraverso lampada di calore e di misura mediante termometro rettale, come descritto nella sezione chirurgica. L&#39;aereo anestesia è inoltre monitorato in tutto l&#39;esperimento, come descritto nella sezione 2.1. </li><li> Impostare il superfusione e le linee di aspirazione. Superfusione di PSS avviene a gravità da un serbatoio, nel serbatoio camicia d&#39;acqua riscaldata (la giacca viene fatta circolare acqua e riscaldata dal bagnomaria circolante) di essere irrorati dal 5% di CO 2 di azoto equilibrato, e giù una linea a goccia ad una velocità di 10 ml / min. Una linea di aspirazione deve essere usato per continuare tirare PSS superfused dalla preparazione. Da notare che prima della sperimentazione le linee di aspirazione e camicia d&#39;acqua sono accuratamente puliti e conservati dopo ogni esperimento. Questo assicura sterilità prima del prossimo esperimento. </li><li> Controllare la temperatura del PSS superfusing. Regolare la temperatura delcircolazione bagnomaria e / o il tasso di superfusione PSS per raggiungere una temperatura di circa 37 ° C in tutta la preparazione. </li><li> Lasciare che la vascolarizzazione a equilibrare con PSS per almeno 60 minuti e quantificare il diametro del vaso con la pinza video. Tipicamente, diametro del vaso deve essere determinata in più punti (ad esempio, a 40, 50 e 60 minuti) per garantire la nave si è stabilizzata. </li><li> Valutare la salute della nave che utilizza un agonista della muscolatura liscia specifici (es. fenilefrina, PE) ed un agonista endotelio specifiche (es. acetilcolina, ACh). Concentrazione di agonista deve essere regolata a seconda della agonista, ma per PE e Ach la nave dovrebbe essere valutata per ogni concentrazione di oltre cumulativa (10-5M a 10-9M) al superfusate. Ogni applicazione agonisti devono essere separati da una fase di lavaggio (di solito 30 minuti) utilizzando PSS fino a quando la nave ritorna al diametro di riposo. </li><li> In seguito alla valutazione della salute dei vasi sanguigni, le successive farmaci vasoattivi, etichettatura fluorescenti e celle tracciamento esperimenti possono essere condotti. </li><li> Dopo la fine dell&#39;esperimento l&#39;animale viene data una dose eccessiva di sodio pentobarbital. L&#39;animale viene poi monitorato per assicurare che non c&#39;è risposta a pizzico punta e la mancanza di movimenti respiratori o di battito cardiaco. Nel momento in cui questa è seguita da dislocazione cervicale. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Dopo il periodo di equilibrio della preparazione dovrebbe produrre un&#39;immagine chiara che permette l&#39;identificazione sia delle arteriole e venule che fornisce il nodo inguinale linfa. Ci dovrebbe essere cellule adipose minimo circostanti i vasi per consentire pareti della arteriole e venule essere chiaramente osservato per le pinze video da sovrapposte per calcolare diametro del vaso. Il punto integrante di una preparazione di successo is l&#39;arteriola ha una ricca offerta di sangue si muove attraverso il lume e che ci sia un grado significativo del tono vascolare (cioè l&#39;arteriola ha la capacità effetto vasocostrittore e vasodilate alla muscolatura liscia ed endoteliali agonisti specific rispettivamente) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Immagine microscopia intravitale di linfonodi inguinali alimentazione arteriola nodo (freccia rossa) che alimentano il linfonodo equilibrata con soluzione fisiologica e che corre lungo il lato venule principale (freccia verde). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Normale risposta vasoattivi per fenilefrina superfused (PE) con l&#39;aggiunta cumulativo di soluzione fisiologica dalle concentrazioni 10 -9 M per 10 -5 M. La presenza di una vasocostrizione robusta è indicativa di normale funzionamento della muscolatura liscia presente nella arteriole. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Normale risposta vasoattivi per superfused acetilcolina (ACh) con l&#39;aggiunta cumulativo di soluzione fisiologica da concentrazioni di 10 -9 M per 10 -5 M. La presenza di una vasodilatazione robusta è indicativa della normale funzione endoteliale presente nelle arteriole.

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	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale qui presentata offre la possibilità di microcircolo immagine del linfonodo in vivo. Così, fornisce un mezzo di diretta, in tempo reale osservazione. Imaging del microcircolo LN è un sito unico che permette di studiare l&#39;interfaccia tra la risposta immunitaria e la vascolarizzazione. Utilizzando questa preparazione, messa a fuoco può essere diretto specificamente alla risposta immunitaria, alterazioni del sistema vascolare, o interazione tra le due cose. Come per tutti gli approcci sperimentali, un microscopio a intravitale ha sia vantaggi e limiti. IVM standard, come la preparazione descritta qui, può facilmente essere modificato, ed è stato precedentemente dimostrato dagli autori per consentire microscopia epifluorescente attraverso l&#39;introduzione di coloranti traccianti fluorescenti o popolazioni di cellule con etichetta. Anche se IVM norma non garantisce la possibilità di tre di imaging tridimensionale e la rintracciabilità come sarebbe dato da microscopia a due fotoni o angiografia, il monitoraggio delle cellule è ancora realizzato in due dimensioni permettendo cellula-cellula e cellula-vascolarizzazione interazione da osservato e quantificato e in collaborazione con in-vivo di amministrazione e conseguente colorazione con anticorpi fluorescenti può essere usato per fornire i dati sulle proteine ​​/ marcatore espressione in tempo reale. In particolare, le tecniche di imaging alternative richiedono un ambiente statico per le immagini; bloccaggio dell&#39;area chirurgica o l&#39;aggiunta di un coprioggetto su un piatto preparazione è spesso necessario. Questo limita, se non elimina, la capacità di perfusione attivamente mediatori vascolari o altro oltre alla preparazione per valutare l&#39;integrità vascolare e la fisiologia, ecc o l&#39;uso di altre tecniche come la vasodilatazione esperimenti condotti all&#39;interno della preparazione IVM. Inoltre, standard IVM non richiede una preparazione completamente pianeggiante e non è influenzato dal movimento, come quello generato dalla respirazione degli animali. Questo permette IVM standard da utilizzare in zone più chirurgica con maggiore riproducibilità. Ciò è esemplificato dalla preparazione del linfonodo inguinale descritto qui. Date le dimensioni e la forma dei linfonodi, la preparazione non può essere piatta, senza ferire il tessuto e la posizione del nodo dà origine al movimento significativo a causa della respirazione animale. Tali problemi sarebbero difficili da superare con altri metodi, ma sono facilmente risolto con la preparazione standard di IVM descritto. In sintesi, la preparazione cui sopra può essere combinato con qualsiasi numero di altri biochimici, vascolari, e / o tecniche immunologiche, come il trasferimento di sottoinsiemi di cellule attivate o etichettati, induzione di ipossia, e sovra-espressione di deplezione dei mediatori vascolari. Tuttavia, le applicazioni aggiuntive dipendono dalla salute della preparazione iniziale. Pertanto, è vitale per testare sempre la salute del sistema vascolare essere ripreso e valutato. Punti chiave per raggiungere una preparazione sanitaria sono garantire la preparazione è costantemente perfuso con PSS equilibrata alla temperatura del corpo e riducendo al minimo il contatto e lo stress immessi sul campo operatorio durante l&#39;intervento chirurgico.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th></tr><tr><td> Sodio Bicarbonato </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Calcio cloruro diidrato </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodio nitroprussiato </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Fenilefrina </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Acetilcolina </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio eptaidrato </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodio Pentobarbitol </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

Linfonodi (LN), situato in tutto il corpo, sono parte integrante del sistema immunitario. Essi servono come sito per l&#39;induzione della risposta immunitaria adattativa e, quindi, lo sviluppo delle cellule effettrici. Come tale, LNs sono la chiave per combattere i patogeni invasori e mantenere la salute. La scelta della LN di studio è dettata dalla accessibilità e il modello desiderato; del linfonodo inguinale è ben posizionato e supporta facilmente gli studi di modelli biologicamente rilevanti della pelle e della mucosa genitale infezione. La LN inguinale, come tutti i LNS, ha una vasta rete microvascolare fornirla di sangue. In generale, questa rete microvascolare include il arteriola principale di alimentazione della LN che successivamente i rami e si nutre di alta venule endoteliali (HEV). HEV sono specializzati per facilitare il traffico delle cellule immunitarie nel LN sia durante l&#39;omeostasi e infezioni. Come HEV regolare il traffico in LN sotto entrambe queste circostanze, è una zona di esplorazione intenso. La LN alimentazione arteriola, ha influenza diretta sul monte HEV ed è l&#39;alimentazione principale di sostanze nutritive e cellule del sangue ricco in LN. Inoltre, i cambiamenti nel arteriola mangimi sono implicati nel facilitare l&#39;induzione di risposta immunitaria adattativa. Il microcircolo LN è evidente importanza nel mantenimento di un ottimale apporto di sangue al LN e regolare afflusso delle cellule immunitarie nel LN, che sono elementi cruciali in funzione LN corretta e la risposta immunitaria in seguito. La possibilità di studiare il microcircolo LN in vivo è la chiave per chiarire come il sistema immunitario e il microcircolo interagiscono e si influenzano l&#39;un l&#39;altro all&#39;interno della LN. Qui, vi presentiamo un metodo per imaging in vivo del linfonodo inguinale. Ci concentriamo su immagini del microcircolo della LN, prestando particolare attenzione ai metodi che assicurano lo studio dei vasi sani, la capacità di mantenere l&#39;imaging dei vasi vitali per un certo numero di ore, e la quantificazione di grandezza delle navi. Metodi per la perfusione del microcircolo con farmaci vasoattivi come pure la possibilità di rintracciare e quantificare il traffico cellulare sono anche presentato. Microscopia intravitale della LN inguinale consente una valutazione diretta della funzionalità microvascolare e in tempo reale, interfaccia di interfaccia diretta tra cellule del sistema immunitario, la LN, e la microcircolazione. Questa tecnica potenziale per essere combinata con tecniche immunologiche molti ed etichettatura delle cellule fluorescenti e manipolati per lo studio della vascolarizzazione LNs altri.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Una tecnica per l&#39;esecuzione di microscopia intravitale del linfonodo inguinale (LN) è delineato. Tale tecnica permette in tempo reale,<em&gt; In vivo</emStudio&gt; del microcircolo linfonodi e la struttura sia durante l&#39;omeostasi e infezioni. Questa tecnica può essere adattata a studi traffico di cellulare e ad altri siti linfonodali.

Microscopia intravitale del linfonodo inguinale

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K Views.  University of Northern British Columbia. Una tecnica per l'esecuzione di microscopia intravitale del linfonodo inguinale (LN) è delineato. Tale tecnica permette in tempo reale, In vivo del microcircolo linfonodi e la struttura sia durante l'omeostasi e infezioni. Questa tecnica può essere adattata a studi traffico di cellulare e ad altri siti linfonodali.

Video: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine superficiale Lymph Chirurgia Node

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento di cellule murine Linfonodo stromali

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Raccolta e trattamento dei linfonodi da grandi animali per l'analisi del RNA: preparazione per gli studi di trascrittomica di linfonodo di grandi specie animali

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...