Ringraziamo il Dr. Till Böcking per il protocollo originale di preparazione a singola molecola. 
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NSF 1121972(SS).

<ol>
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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti in questo documento.

L'imaging a virione singolo con AFM e l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione può essere utilizzato come metodologia alternativa alla tomografia CryoEM. Ognuna di queste metodologie ha i suoi punti di forza specifici. Ad esempio AFM può essere fatto su virioni WT senza alcun requisito per etichettare il campione o le proteine virali interne. La posizione delle strutture virali è deconvolta dai loro contributi alle proprietà elastiche del virione.
L'imaging a super-risoluzione virione singola in combinazione con i nuovi approcci genetici inversi virali diventa una tecnica potente per localizzare proteine virali a basso numero di copie20. I virus ricombinanti con la sostituzione delle loro proteine con proteine fuse con proteine fluorescenti possono essere prodotti e purificati utilizzando questi approcci genetici inversi. Sebbene l'imaging a super-risoluzione abbia specificità in parte a causa del tagging genetico, richiede l'uso dei virus mutanti.
AFM e imaging a super risoluzione sono metodi gratuiti che utilizzano preparazioni campione molto simili. I metodi delineati in questo documento, che sono adottati da precedenti test di imaging a singola molecola, consentono l'ancoraggio di singoli virioni con pochi effetti sulla topologia dei virioni.

Le interazioni non specifiche basate sulla carica sono usate abitualmente per l'adesione dei virioni nella microscopia a forza atomica1,2. Queste tecniche funzionano particolarmente bene se utilizzate su virioni non ineveloped con tappi moltorigidi 3-6. Sebbene queste tecniche siano molto efficaci nell'immobilizzare il campione, non impediscono il legame non specifico delle proteine alla superficie. Il legame non specifico può creare un problema quando si tenta di immaginare virioni con AFM e tecniche di fluorescenza a super risoluzione che richiedono incubazioni del campione con vari anticorpi. Qui delineamo un metodo di preparazione del campione per l'immobilizzazione specifica dei virioni.
Il poli(glicole etilenico) (PEG) innestato in poli(L-lisina) (PLL) e adsorbito su una superficie di vetro fornisce un blocco significativo per le interazioni elettrostatiche delle proteine con il vetro7. I test a singola molecola che richiedono l'immobilizzazione di singole molecole su superfici di vetro hanno approfittato di questa proprietà e l'hanno utilizzata per creare una specifica tecnica di immobilizzazione a singola molecola basata su PEG8-10. Questa preparazione è stata utilizzata anche per immobilizzare le gabbie di clatrarina sulla superficiedel vetro 11 e per creare un rivestimento omogeneo di fibronectin per l'adesione delle cellule di controllo 12.
Abbiamo adottato il metodo di preparazione del campione basato sull'adsorbimento PLL-g-PEG sulle superfici di vetro da metodologie di imaging a singola molecola e lo abbiamo applicato all'imaging di singoli virioni del virus della stomatite vescicolare (VSV). Questi virioni singoli sono stati immagini usando la microscopia a forza atomica (AFM). Esperimenti simili sono stati eseguiti anche su perline funzionalizzate come controllo. I virioni sono stati anche immagini dalla microscopia a fluorescenza a super risoluzione, in quanto un anticorpo VSV-G etichettato con Alexa 647 è stato utilizzato per creare un'immagine dell'involucro di singoli virioni. L'imaging fluorescente ad alta risoluzione utilizza la localizzazione di singole molecole per creareun'immagine 13-15. L'imaging bi-planare fPALM consente la localizzazione di singole molecole con 20 nm in piano e risoluzione di 50 nm lungo l'asseottico 15,16. Questa tecnica bi-planare è stata utilizzata per immagini di immagini fluorescenti a super-risoluzione presenti in questo studio. Una tecnica alternativa che ha risultati simili è STORM13,17,18.
Sia l'AFM che le immagini fluorescenti a super-risoluzione di VSV ancorate al vetro dalle procedure descritte in questo documento, hanno mostrato un legame specifico dei virioni al vetro con interazioni minime non specifiche19. Qui presentiamo i protocolli di preparazione del campione per gli esperimenti di imaging fluorescente AFM e super-risoluzione. In breve: le coverlips in vetro pulito sono funzionalizzate adsorbendo una miscela di PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-biotina. È tipico che questo film sottile sia progettato per fornire biotina funzionalizzata tra il 15 e il 25% su una superficie rivestita. Le copertine vengono ulteriormente incubate con avidina tetramerica. Un anticorpo virale biotinilato viene quindi utilizzato per creare un sito di legame unico per i virioni. Il legame dell'anticorpo può essere fatto in due modi.
Il primo metodo è ottimizzato per AFM, tuttavia rimane adatto per l'imaging a fluorescenza a super risoluzione. In questo metodo la superficie rivestita di avidina viene trattata con anticorpi biotinilati prima dell'adesione virale. I virioni immobilizzati vengono trattati con anticorpo etichettato Alexa 647 per coprire l'involucro e consentire l'imaging a fluorescenza a super risoluzione dei virioni.
Il secondo metodo è quello di attaccare il virus in soluzione con l'anticorpo biotinilato e l'anticorpo etichettato Alexa 647 prima di aderire ai virus alla superficie trattata con avidina; questo metodo è ottimizzato per esperimenti di imaging a fluorescenza a super risoluzione in cui il recupero dell'involucro virale è importante. Questo metodo ha il vantaggio di consentire un rivestimento anticorpale uniforme sulla superficie virale. L'anticorpo biotinilato può essere miscelato con anticorpi virali etichettati Alexa 647 in rapporti che consentono un sufficiente adsorbimento del virus alla superficie trattata con avidina mantenendo un'alta concentrazione di etichetta fluorescente all'esterno dell'involucro virale. Questi anticorpi virali etichettati Alexa 647 non sono biotinilati e il loro eccesso può essere risciacquato al fine di ridurre il rumore di fondo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

L'immobilizzazione dei virioni sulle superfici di vetro è un passo fondamentale nell'imaging a virione singolo. Qui presentiamo una tecnica adottata da test di imaging a singola molecola che consente l'adesione di singoli virioni a superfici di vetro con specificità. Questa preparazione si basa sull'innesto della superficie del vetro con una miscela di PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-Biotin, aggiungendo uno strato di avidina e infine creando ancoraggi virione attraverso l'attacco di anticorpi specifici del virus biotinilato. Abbiamo applicato questa tecnica in una serie di esperimenti tra cui la microscopia a forza atomica (AFM) e l'imaging a fluorescenza a super risoluzione. Questo metodo di preparazione del campione si traduce in un'adesione di controllo dei virioni alla superficie.

Imaging a virione singolo con AFM:
Il protocollo di preparazione del campione sopra descritto è stato utilizzato per ancorare virioni di tipo selvaggio alla superficie del vetro. I virioni VSV hanno una lunghezza di 180 nm a forma di proiettile e un diametro di 80 nm. Poiché ci sono una varietà di virioni per i quali questa tecnica può essere applicata, il concetto è dimostrato anche qui sulle perline biotinilate a 36 nm. Gli esperimenti AFM risultanti sono riportati nella figura 1. È importante notare che i virioni VSV hanno un modulo di Young inferiore (100 MPa) rispetto ai virus non ineveloped (GPa). Le particolari immagini del vv a virione singolo sono state ottenute in modalità di maschiatura in condizioni ambientali con un rigido sbalzino. Lo scopo è stato quello di deformare il virus al punto che la densità proteica extra all'interno del virus diventa visibile come un urto all'interno dell'immagine AFM. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la densità proteica extra all'interno della cavità del virus19.
Imaging a super risoluzione virione singola:
Gli anticorpi VSV-G etichettati Alexa 647 sono stati usati per rivestire l'involucro dei singoli virioni VSV per esperimenti di super-risoluzione utilizzando il metodo 5A. Per dimostrare la densità di tethering e la bassa associazione aspecifica, nella figura 2Aviene illustrata una scansione di grandi dimensioni del campione. Il recupero della busta virale su un virione rappresentativo è mostrato nella figura 2B (isosuperficie blu).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figura 1. Imaging AFM di perline e VSV sulla superficie PEGG funzionalizzata. Scansione AFM di perline biotinilate a 36 nm (A, B) e un virione VSV (C) ancorato alla superficie con un anticorpo VSVG biotinilato. AFM è stato fatto in modalità di scansione topografica dell'aria CA. Il raggio della punta è < 25 nm e le misurazioni sono state effettuate sotto modulazione di forza e maschiatura della luce. La punta aveva una costante di forza di 3 N/m e una frequenza risonante di 75 kHz con incertezza di 15 kHz. Mentre le perline hanno mantenuto la loro altezza durante la scansione AFM, il virion VSV ha un modulo giovane significativamente più piccolo ed è significativamente deformato in altezza. In questa immagine il virione è stato specificamente immaginato con un cantilever rigido in modalità di maschiatura che ha prodotto una piccola convoluzione xy (utilizzata per determinare la punta rispetto all'estremità smussata del virus) e la differenza di altezza tra la punta e l'estremità smussata del virus viene utilizzata per rilevare una densità proteica extra all'estremità smussata del virus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figura 2. Imaging basato sulla fluorescenza dei virioni VSV sulla superficie funzionalizzata PEGG. A)virioni VSV ricombinanti immobilizzati sulla superficie PEGG utilizzando un anticorpo anti VSVG biotinilato imageizzato in fluorescenza a campo largo. B) Ricostruzione a fluorescenza ad alta risoluzione dell'involucro di VSV attaccato alla superficie PEGG attraverso un anticorpo anti VSVG biotinilato e decorato con anticorpi anti-VSVG etichettati Alexa 647 (il metodo 5A è stato utilizzato per creare queste immagini). La superficie blu è una proiezione isosuperficie 2D. A sinistra mostra un modello del virus a forma di proiettile. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Dimensioni delle copertine</td>
			<td style="width:93px;">fluido</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 1. Aliquote fluide in base alle dimensioni delle copertine.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

L'attacco dei virioni a una superficie è un requisito per l'imaging a virione singolo mediante imaging a fluorescenza a super risoluzione o microscopia a forza atomica (AFM). Qui dimostriamo un metodo di preparazione del campione per l'adesione controllata di virioni a superfici di vetro adatte all'uso nell'AFM e nell'imaging a fluorescenza a super risoluzione.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Views.  University of Utah. L'attacco dei virioni a una superficie è un requisito per l'imaging a virione singolo mediante imaging a fluorescenza a super risoluzione o microscopia a forza atomica (AFM). Qui dimostriamo un metodo di preparazione del campione per l'adesione controllata di virioni a superfici di vetro adatte all'uso nell'AFM e nell'imaging a fluorescenza a super risoluzione.