Il nostro protocollo utilizza sonde fluorofore regolari e semplici tecniche di preparazione dei campioni che mantengono la cellula immagine in condizioni fisiologiche per studiare un processo cellulare altamente dinamico e strutture subcellulari dettagliate. Questa tecnica ci permette di indagare i processi cellulari ad una super risoluzione e in condizioni fisiologiche per un lungo periodo senza sacrificare né la risoluzione speciale né temporanea. Inizia tagliando una membrana di dialisi di taglio del peso molecolare da 12 a 14 kilodalton in piccoli pezzi e immergendo i pezzi con 100 microlitri di mezzo cellulare vivo per circa cinque minuti.
Mentre le membrane sono in ammollo, tagliare l'anello esterno di un tubo da 50 millilitri a piccoli pezzi e sterilizzare i pezzi in 70%etanolo. Per la dissezione e il montaggio dei teste, trasferire le mosche anestetizzate di dieci o tre giorni in una piastra di dissezione al microscopio di sezionamento e utilizzare forcep fini per rimuovere i teste. Una volta raccolti tutti i tester, lavare i tester due volte in mezzo a cellule vive e utilizzare una punta di pipetta per stendere da 100 a 150 microlitri di mezzo cellulare vivo al piatto inferiore di vetro preparato.
Utilizzare forcep fini per trasferire i tester di mosca al centro del piatto e rimuovere tutti tranne circa 10 microlitri del mezzo. Rapidamente, posizionare la membrana pre-bagnata sui teste e posizionare da due a tre piccoli pesi di plastica sulla membrana. Immediatamente, aggiungere da 100 a 150 microlitri di mezzo fresco a cellule vive e riposizionare l'anello sul lato elevato del piatto.
Posizionare il coperchio scivolare di nuovo sull'anello e ruotare un pezzo di carta velina in acqua prima di posizionare la carta sul foglietto di copertura. Quindi, coprire il piatto con un coperchio e fissare il piatto sul palco di un microscopio a super risoluzione. Per l'imaging di cellule staminali germinali, aprire il software di imaging e accendere la luce trasmessa.
Utilizza l'obiettivo 63X per concentrarti sul tessuto dei teste e accendere i laser. Fare clic su Live" per individuare le cellule staminali germinali. Regola lo stato attivo e fai clic su Dimensioni fotogramma"per impostare le dimensioni del fotogramma su 512 per 512 e 1024 per 1024 pixel e media"per impostare la media fotogrammi su uno o due.
Fare clic su Guadagno master"per impostare il guadagno di moltiplicazione degli elettroni su meno di 800 e laser"per impostare la potenza del laser sull'1%-2%Ingrandisci la regione o la cella di interesse per ridurre il tempo di acquisizione dell'immagine e ridurre lo sbiancamento delle foto e confermare che l'immagine è stata configurata in modo ottimale prima di fare clic su Avvia esperimento"per avviare l'acquisizione dell'immagine time lapse. Se Airyscan Acquisition non è configurato in modo ottimale", fare clic su Optimal"nelle sezioni frame size, Z-Stack e Scan Area" e ottimizzare l'intervallo di tempo, il numero di fette Z e la durata dell'imaging time-lapse, in base al design sperimentale e al tipo di campione. Dopo l'imaging, selezionate Elaborazione, Batch" e Elaborazione Airyscan e selezionate le immagini da elaborare.
Quindi fare clic su Esegui processo"per ottenere le immagini con super risoluzione. L'imaging a cellule vive di test di drosofilia che esprimono GFP di tubulina alfa nelle cellule germinali in fase iniziale utilizzando un microscopio confocale a disco rotante, consente la visualizzazione dell'intensità asimmetrica dei segnali GFP a due centrosomi, come un segnale più luminoso al centrosoma madre e un segnale relativamente più debole ai centrosomi figli. La differenza di luminosità è probabilmente riflessa dall'asimmetria temporale della nucleazione del microtubulo, ma la morfologia dettagliata e la quantità dei microtubuli non possono essere risolte usando la microscopia confocale a disco rotante.
Al contrario, l'imaging a super risoluzione delle cellule vive consente la visualizzazione e la quantificazione della morfologia e dei numeri dei microtubuli. Questa migliore risoluzione rivela anche modelli di nucleazione asimmetrica dei microtubuli, allungamento e maggiore interazione con la membrana nucleare. L'imaging a cellule vive consente anche la visualizzazione dell'invaginazione asimmetrica della membrana nucleare, ma non dei singoli microtubuli che entrano direttamente nel nucleo.
Al contrario, questa tecnica di super risoluzione delle cellule vive permette l'osservazione diretta di questi eventi mediante imaging simultaneo sia dei microtubuli che della lamina nucleare. Durante la metafase, entrambi i centromeri sorelle possono essere rilevati come un unico segnale usando la microscopia a disco rotante, anche se l'attacco centrale del microtubulo non può essere osservato. Al contrario, l'imaging dal vivo a super risoluzione consente la visualizzazione dell'attacco barimero microtubulo nella propase precoce.
Assicurarsi di posizionare una membrana sopra i tester per assicurarsi che non si muovano o galleggino durante l'imaging e per ottimizzare le impostazioni del microscopio per evitare lo sbiancamento delle foto e la tossicità fotografica. Ci sono molti modi in cui questo metodo può essere applicato, ad esempio per indagare la dinamica proteica, lo stress lineare o le difese e i processi cellulari.
