Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Preparazione del campione <ol><li> Inoculare i terreni LB con una singola colonia di ceppo JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescere durante la notte in uno shaker a 37 ° C. </li><li> Diluire la cultura 1:1000 in M9 + minimi di media [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl 2, Acidi MEM aminoacidi e vitamine] e crescere fino a metà-log fase (OD 600 = 0,2-0,3) in presenza di cloramfenicolo (150 mcg / ml) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Indurre la cultura con 20 mM IPTG per 2 ore (vedi nota n ° 1). </li><li> Cultura pellet in microcentrifuga (8000 rpm, 1 min) e risospendere in un volume uguale di M9 +; ripetizione. Dopo la risospensione secondi, continuare la crescita a temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Fissare cultura indotta con 4% paraformaldeide in PBS (pH = 7,4) a temperatura ambiente per 40 min. Cultura pellet e risospendere in un volume uguale di PBS; repeat. Se le cellule di imaging in diretta, saltare fissazione, cultura pellet e risospendere con un volume ugualedi M9 - [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl 2, Acidi MEM Amino]; ripetere. </li><li> Diluire perle oro 01:10 con la cultura sedimento. Applicare il campione alla camera di imaging preparato (vedi punto 2.4). </li></ol> [1] Nota: Il protocollo di induzione al di sopra (passi 1,1-1,3) è stato ottimizzato per il sistema di espressione del ceppo JB281. Condizioni di induzione dettagliate possono variare per altri sistemi di espressione o di proteine ​​di interesse. 2. Assemblea della Camera Imaging <ol><li> Fare una soluzione al 3% (w / v) in agarosio M9 -. Melt agarosio a 70 ° C in un banco blocco termico per 40min. Conservare agarosio fuso a 50 ° C per 5 h. </li><li> Collocare un vetrino pulito microaqueduct nella metà superiore della camera di imaging con gli elettrodi rivolti verso il basso. Allineare la guarnizione inferiore sul vetrino microaqueduct modo da coprire i canali di perfusione. </li><li> Applicare ~ 50 microlitri del fuso agarosio al centro del vetrodiapositiva. Immediatamente sopra la goccia di gel di agarosio con un panno pulito, asciutto coprioggetto. Permettere al gel di solidificare a temperatura ambiente per 30 min. <ol><li> Per pulire coprioggetti: organizzare vetrini in un supporto in ceramica e ultrasuoni per 20 minuti nella rotazione bagni di acetone, etanolo e KOH 1M in barattoli di vetro. Ripetere il ciclo per tre volte, per un totale di 9 sonications, seguito da un singolo sonicazione in dH 2 O. Conservare i coprioggetti puliti fresco dH 2 O. Prima dell&#39;uso, soffiare coprioggetto secco con aria filtrata. </li></ol></li><li> Rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto, lasciando cuscinetto di gel sulla diapositiva microaqueduct. Immediatamente aggiungere 1 ml di campione di coltura cellulare (vedi passo 1.6) all&#39;inizio del cuscinetto di gel. Attendere ~ 2 min, consentendo soluzione che deve essere assorbita dal cuscinetto di gel. Top Gel pad con un nuovo pulito, asciutto coprioggetto. Montare la camera tutta di immagini secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 3. Acquisizione di immagini <ol><li> Accendere la fotocamera microscopio, e laser. Aprire MetaMorph morbidoware (Molecular Devices). </li><li> Luogo appropriato di eccitazione / emissione filtri nel percorso di immagini (Figura 1). </li><li> Impostare potenze laser e le impostazioni di acquisizione di conseguenza. <ol><li> 488 nm laser = 15 mW (vedi nota # 2) </li><li> 561-nm laser = 75 mW </li><li> 405-nm laser = 2 mW ± filtro a densità neutra (Vedi nota # 3) </li></ol></li><li> Bloccare camera di imaging nella fase tramite l&#39;adattatore stadio complementare. </li><li> Designare una regione appropriata immagini (100x100 pixel) che è omogeneamente illuminato da tutti e tre i laser. </li><li> Individuare un&#39;area campione che contiene sia cellule e marcatori fiduciali (perle d&#39;oro) nelle immediate vicinanze, ma non sovrapposti. </li><li> Concentrarsi sulla superficie delle cellule più vicini al coprioggetto. Acquisire un&#39;immagine campo chiaro con 50 ms tempo di integrazione e spostare il focus 0,5 micron nel campione (Figura 3Ai). </li><li> Acquisire insieme immagine verde fluorescenza con eccitazione da 488-n<html> m utilizzando un laser di integrazione 50 ms di tempo (Figura 3Aii). </li><li> Acquisire streaming video in canale rosso con illuminazione continua da 405-nm e 561-nm laser. Per cellule fisse, un frame rate 50 ms è utilizzato per un totale di 20.000 frames (~ 17 totale min) con la potenza del laser 405-nm rampa di circa 10% ogni 1.000 fotogrammi (vedi nota # 4). Per cellule vive, un telaio 10 ms rate viene utilizzato per un totale di 3000 frames (~ 30 s totale) alla temperatura costante di 405-nm potenza laser. </li><li> Spostare il fuoco posteriore alla superficie inferiore delle cellule e acquisire un&#39;altra immagine brightfield come al punto 3.7. </li></ol> [2] Nota: L&#39;intensità integrata della fluorescenza verde di una cellula è direttamente proporzionale al numero totale di FtsZ-mEos2 molecole espresse nella cella. Il 488-nm potenza di eccitazione e impostazioni di acquisizione d&#39;insieme fluorescenza deve essere mantenuta costante per tutte le celle in modo che la relativa FtsZ-mEos2 livelli di espressione in cellule differenti possono essere confrontati. ONTENUTO &quot;&gt; [3]. Nota: celle fisse sono ripreso con la densità neutra (ND) filtro (figura 1, componente ottico # 5) in posizione al fine di ottenere una bassa velocità di attivazione in modo che ogni singola molecola può essere identificato con precisione i ND filtro viene rimosso quando l&#39;imaging cellule vive per aumentare il tasso di attivazione, pur mantenendo una bassa probabilità di due molecole di essere attivati ​​simultaneamente in una diffrazione limitata zona. La velocità più applicato alle celle di imaging è necessario per ridurre il tempo totale di acquisizione, in tal modo &quot;congelare&quot; la Z-ring nel tempo e limitare l&#39;effetto del fotodanneggiamento alla cella. [4] Nota: Il numero di fotogrammi acquisiti sono stati ottimizzati per il nostro sistema e dipendono dalla particolare struttura cellulare, etichettatura densità, tasso di attivazione e se esaurire tutto il pool di fluorofori è importante per l&#39;analisi. In cellule vive, è importante per ottenere un numero sufficiente di localizzazioni in un breve periodo di time possibile per evitare la sfocatura dell&#39;immagine dovuta al movimento della struttura cellulare. 4. PALM Immagine Costruzione <ol><li> Determinare la posizione del centroide di ogni punto rilevato. <ol><li> Caricare la pila di immagini in Matlab (The MathWorks, Inc.). </li><li> Ritagliare la serie di immagini in una regione attorno a una cella che esclude tutti i cordoni fiduciali. </li><li> Selezionare una soglia di intensità per il rilevamento punto che è al di sopra del livello di fondo, ma al di sotto della media intensità posto. Abbiamo spiegare la variazione del livello di fondo durante un esperimento calcolando la media corrente di intensità massima utilizzando una finestra cornice 150. La soglia di intensità per ciascun frame viene quindi interpolato dai valori medi. </li><li> Sottrarre la rispettiva soglia di ogni fotogramma. I potenziali punti sono identificati come tre pixel adiacenti con intensità sopra la soglia. </li><li> Montare l&#39;intensità di fluorescenza di ogni punto prospettico ad un bidimensionale Gaussiafunzione n [Equazione # 1] usando un algoritmo non lineare almeno quadrati (Figura 2). La precisione di localizzazione di ciascun punto viene calcolato utilizzando il numero totale di fotoni rilevati [Equazione # 2]. Qualsiasi posto scarsamente in forma con una precisione di localizzazione superiore a 20 nm (cellule fisse) o 45 nm (cellule vive) viene scartato (vedi nota # 5). Qualsiasi punto con un&#39;intensità maggiore di due volte la media intensità, forse a causa di emettitori sovrapposte, anche scartato. </li><li> Per le cellule fisse, rimuovere le osservazioni ripetute della stessa molecola, ignorando qualsiasi punto la cui posizione baricentro si trova a 45 nm di qualsiasi altro posto che l&#39;ha preceduta da 6 fotogrammi o meno. Per le cellule vive, tutti i punti vengono mantenuti. </li></ol></li><li> Calibrare deriva esempio utilizzando movimento fiducial marker. <ol><li> Ritagliare una regione di pixel 10x10 intorno un marcatore fiducial. </li><li> Sottrarre la relativa soglia determinato in 4.1.3 da ogni fotogramma. </li><li> Montare il profilo di intensità in ognitelaio con dei minimi quadrati algoritmo raccordo assumendo una forma bidimensionale gaussiana. </li><li> Calcolare lo spostamento tra le posizioni centroide rispetto al telaio 1. </li></ol></li><li> Correggere la posizione del centroide di ogni molecola unica indicata al punto 4.1 con la deriva campione adeguato calcolato in 4.2. Confrontate le immagini acquisite in campo chiaro 3.7 e 3.10. Se le cellule sono osservate per spostarsi rispetto al marker fiduciali, i dati sono buttato. </li><li> Sovrapporre tutte le posizioni corrette baricentro su una singola immagine composta da pixel 15x15 nm. Tracciare ogni molecola unica come unità-area, bidimensionale profilo gaussiano centrato alla posizione del centroide con una deviazione standard inferiore alla precisione di localizzazione [Equazione # 2]. Ciò si traduce in una mappa di densità di probabilità, in cui l&#39;intensità di un pixel è proporzionale alla probabilità di trovare una molecola di tale pixel (Figura 3Aiv). </li><li> Confrontando le immagini PALM alle immagini d&#39;insieme. <ol><li> Replot il centroposizioni id come in 4.4, ma su un aereo con 150x150 pixel nm e una deviazione standard pari a 250 nm. Questo genera un&#39;immagine PALM che imita un diffrazione limitata dell&#39;immagine, che può essere utilizzata per confrontare la diffrazione limitata, immagine acquisita insieme a 3,8 (Figura 3Aiii). </li><li> Per confermare che le molecole rilevate sono rappresentativi di tutta la popolazione, confrontare l&#39;immagine ricostruita insieme (Figura 3Aiii, passo 4.5.1) con l&#39;immagine di fluorescenza insieme sperimentale (Figura 3Aii, passo 3.8) per verificare che entrambe le immagini mostrano strutture di forma simile , l&#39;orientamento e l&#39;intensità relativa. </li></ol></li></ol> [5] Nota: la precisione di localizzazione minimo richiesto è stato determinato empiricamente per ogni metodo di imaging riportando le precisioni di tutte le molecole per un dato campione e la selezione di un taglio adeguato. 5. PALM Image Analysis <ol><li> Misura Z-Ring widthe diametro. <ol><li> Ruotare l&#39;immagine PALM modo da orientare verticalmente lungo l&#39;asse della cella (Figura 4A). </li><li> Ritaglia la regione contenente il cellulare Z-ring. </li><li> Calcolare l&#39;intensità cumulativa proiettando un profilo di intensità lungo l&#39;asse lungo della cella. </li><li> Montare il profilo di intensità di una distribuzione gaussiana. La larghezza dell&#39;anello è definito come la massima larghezza di mezzo completo (FWHM) della distribuzione gaussiana attrezzata (Figura 4B). </li><li> Proiettare il profilo cumulativo 5.1.2 intensità lungo l&#39;asse corto della cella. Il diametro dell&#39;anello è definita come la lunghezza del profilo di intensità (Figura 4C). </li></ol></li><li> Plotting Densità FtsZ (vedi nota 6). <ol><li> REPLOT le posizioni centroide come in (4.4), ma senza il profilo Gaussiano tale che ogni molecola unica viene dato un valore di 1 e assegnato ad un pixel corrispondente alla posizione centroide. In questo modo, l&#39;intensità di ciascunpixel rappresenta il numero totale di molecole rilevate in quel pixel. L&#39;immagine PALM densità può anche essere visualizzato come una trama di contorno (Figura 5E). </li></ol></li><li> Determinazione della risoluzione spaziale. <ol><li> Teoricamente-realizzabile risoluzione spaziale: creare un PSF rappresentativo per l&#39;intero campione con la precisione media determinata localizzazione di tutte le molecole rilevate e il calcolo della FWHM (equazione # 3). </li><li> Sperimentalmente-raggiunto risoluzione spaziale: calcolare lo spostamento medio tra le osservazioni ripetute della stessa molecola. </li></ol></li></ol> [6] Nota: Abbiamo usato totale PALM riflessione interna (TIR-PALM, Figura 1 e 5) per limitare l&#39;attivazione ed eccitazione di un sottile strato (~ 200 nm) sopra la cella / vetro interfaccia. in modo che soltanto le molecole FtsZ associate con la membrana più vicino al coprioggetto sarà rilevato.

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Immagini PALM contengono informazioni sui conteggi molecola e posizioni all&#39;interno di una cella, consente un&#39;analisi dettagliata della distribuzione e la disposizione delle molecole proteiche bersaglio che è difficile da ottenere con altri mezzi. Di seguito si evidenzieranno le precauzioni che dovrebbero essere prese per estrarre informazioni quantitative precise, pur mantenendo la rilevanza biologica delle immagini PALM. Abbiamo anche esplorare le informazioni che possono essere meglio ottenuta utilizzando ce...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 50 x MEM Aminoacidi </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitamine </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td> Electron Micrsocopy Scienze </td><td> 15.710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarosio </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Oro Perle </td><td> Microsfere-Nanosfere </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging Camera </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fase Adattatore </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> NA 1,45, 60x Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Camera </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488 nm Sapphire Laser </td><td> Coerente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire Laser </td><td> Coerente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm Laser CUBE </td><td> Coerente </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

Divisione cellulare batterica richiede il montaggio coordinato di più di dieci proteine ​​essenziali alla midcell 1,2. Centrale di questo processo è la formazione di un anello simile sovrastruttura (Z-ring) dalla proteina FtsZ al piano di divisione 3,4. La-Z anello costituito da più singolo filamento protofilamenti FtsZ, e comprendere la disposizione dei protofilamenti all&#39;interno Z-ring fornirà sul meccanismo di Z-ring e la sua funzione di generatore di forza 5,6. Questa informazione è rimasta inafferrabile a causa delle limitazioni attuali convenzionale microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Microscopia a fluorescenza convenzionale non è in grado di fornire una immagine ad alta risoluzione di Z-ring a causa del limite di diffrazione della luce (~ 200 nm). Electron cryotomographic di imaging ha rilevato sparsi protofilamenti FtsZ in piccole C. cellule crescentus 7, ma è difficile da applicare a grandi cellule qualiE. coli o B. subtilis. Qui si descrive l&#39;applicazione di un metodo di risoluzione super-microscopia a fluorescenza, microscopia localizzazione fotoattivati ​​(PALM), per caratterizzare quantitativamente l&#39;organizzazione strutturale della E. coli Z-ring 8. PALM offre sia immagini alta risoluzione spaziale (~ 35 nm) e un&#39;etichettatura specifica per consentire l&#39;identificazione univoca delle proteine ​​bersaglio. Abbiamo etichettato FtsZ con il mEos2 fotoattivabile proteina fluorescente, che passa da verde a fluorescenza (eccitazione = 488 nm) al rosso fluorescenza (eccitazione = 561 nm) in caso di attivazione a 405 nm 9. Durante un esperimento PALM, singoli FtsZ-mEos2 molecole sono stocasticamente attivati ​​e le corrispondenti posizioni centroide delle singole molecole sono determinati con &lt;20 nm precisione. Un super-risoluzione di immagine di Z-ring viene poi ricostruita sovrapponendo le posizioni centroide di tutti i rilevati FtsZ-mEos2 molecole. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Usando questo metodo, abbiamo trovato che la Z-anello ha una larghezza fissa di circa 100 nm ed è composto da un fascio di allentato protofilamenti FtsZ che si sovrappongono tra loro in tre dimensioni. Questi dati forniscono un trampolino per ulteriori indagini modifiche ciclo cellulare dipendenti della Z-ring 10 e può essere applicata ad altre proteine ​​di interesse.

Illustrato in Figura 3Aiv è bidimensionale, super-risoluzione resa del Z-ring generato dal metodo di imaging PALM descritto sopra. Qui di seguito, riassumiamo informazioni qualitative e quantitative che possono essere ottenuti da esse. Qualitativamente, abbiamo osservato che la Z-ring è una struttura irregolare che adotta più configurazioni (singola banda o arco elicoidale) che non sono distinguibili in tradizionali immagini di fluorescenza (confronta Figura 3A-Di...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l&#39;organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

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Biology

11.7K Views.  The Johns Hopkins University School of Medicine. Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

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Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.