Ringraziamo Alejandro Brun dal CISA-INIA per la fornitura di anti-febbre della Rift Valley Virus sieri. Il lavoro nei nostri laboratori è supportato da Forschungsförderung gioiello. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, il Leibniz Graduate School per le malattie virali emergenti (EIDIS), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, e la DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Semina di cellule A549 per infezione <ol><li> Coltivare una fiasca T75 di cellule A549 a 37 ° C e 5% di CO 2 nel terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% FCS, 526,6 mg / l di L-glutammina, 50.000 U / l di penicillina e 50 mg / l di streptomicina). </li><li> Prima di iniziare a raccogliere le cellule, scaldare mezzo di coltura cellulare, PBS e 0,05% tripsina-EDTA riscaldata a bagnomaria a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il terreno e lavare le cellule con 10 ml di PBS. Togliere nuovamente il PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA e distribuire equamente nel pallone. Trasferire la beuta in un incubatore con 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Quando tutte le cellule vengono staccate, aggiungere 7 ml di mezzo di coltura cellulare, risospendere le cellule, e trasferire la sospensione cellulare in un tubo Falcon da 15 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 800 xg per 5 min a temperatura ambiente, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di mezzo di coltura cellulare fresca. </li><li> Contare le cellule con una camera di conteggio. </li><li> Aggiungere 2,5 x 10 6 cellule in 5 ml di terreno di coltura in due fiasche T25 ciascuno. Incubare per 16 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Una beuta serve per il controllo finto e uno per l&#39;infezione Cl 13. </li></ol> 2. L&#39;infezione da febbre della Rift Valley Virus Clone 13 (Cl 13) <ol><li> NOTA: Cl 13 è un mutante virus attenuato che in Germania può essere gestito in BSL-2 condizioni. Si prega di fare riferimento alle relative linee guida nazionali. Altri induttori tipici IFN sarebbero virus Sendai (ceppo Cantell) o del virus della malattia di Newcastle. </li><li> , Terreno privo di siero pre-riscaldare PBS, e mezzo di coltura cellulare contenente 5% FCS. </li><li> Preparare 1,25 x 10 7 PFU / ml di Cl 13 in terreno privo di siero per infettare 2,5 x 10 6 cellule A549 con una molteplicità di infezione (MOI) di 5. Preparare una leggera (circa 10%) quantità maggiore di quella necessaria per tenere conto errori pipetta. </li><li> Lavare le cellule con PBS come descritto al punto 1.3. </li><li> Aggiungere 1 ml della diluizione Cl 13 odi mezzo privo di siero (controllo non infetto, finto) alle cellule e incubare per 1 ora a 37 ° C e 5% di CO 2. Spostare il pallone con attenzione ogni 15 min per assicurare un&#39;equa distribuzione delle Cl 13 diluizione e mezzo privo di siero, rispettivamente. </li><li> Dopo 1 ora di infezione, rimuovere l&#39;inoculo, aggiungere 5 ml di pre-riscaldato terreno di coltura cellulare con 5% FCS, e incubare per 5 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3. Preparazione dei lisati cellulari <ol><li> Preparare PBS / 0,5% Triton X-100 a 4 ° C. Non aggiungere inibitori della proteasi serina. </li><li> Lavare le cellule con PBS freddo e aggiungere 10 ml di PBS fresco. </li><li> Raschiare le cellule fuori, trasferire la sospensione cellulare in un tubo Falcon, e centrifugare a 800 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 30 microlitri di PBS / 0,5% Triton X-100. Trasferire il lisato in una fiala da 1,5 ml ed incubare per almeno 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il lisato alle 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il lisato chiarificato (surnatante) in una nuova provetta. </li><li> Determinare la concentrazione proteica mediante saggio Bradford come descritto altrove 33. </li><li> Conservare a -20 ° C o procedi alla digestione tripsina (4.1) o PAGE nativo (5.1). </li></ol> 4. Determinazione dei conformazionale cambiamenti di Pattern Recognition Recettori <ol><li> Trattamento TPCK-tripsina dei lisati cellulari <ol><li> Diluire L-1-tosylamido-2-feniletile clorometil chetone trattati (TPCK) tripsina in PBS ad una concentrazione finale di lavoro di 2 mg / mL. </li><li> Regolare in due nuovi tubi una concentrazione proteica finale di 25 mg di ciascun lisato (finto o Cl 13) di proteine ​​in un volume finale di 9 ml con PBS. Quindi, dovrebbe essere quattro tubi con 25 mg lisato ciascuna, due volte finte e due volte Cl 13 infezione. Una impostato come controllo di input (non trattato) e un set per il trattamento con TPCK-tripsina. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS (non trattato)o 1 ml di 2 mg / mL TPCK-tripsina (concentrazione finale: 0,2 mg / mL) per i lisati cellulari e mescolare le reazioni pipettando. NON congelare e scongelare aliquote TPCK-tripsina, perché compromette l&#39;efficienza della digestione. </li><li> Incubare lisati a 37 ° C per 25 min. Arrestare la reazione aggiungendo 5x denaturazione tampone campione (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerolo, 25% β-mercaptoetanolo, 0,5% blu di bromofenolo) e facendo bollire per 5 min a 95 ° C. È importante NON estendere il tempo di incubazione tripsina. Nel caso nessun frammento resistente alle proteasi sono rilevabili, il tempo di digestione con tripsina deve essere accorciata. </li><li> Dopo la bollitura, i campioni possono essere conservati a -20 ° C. </li></ol></li><li> SDS poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) e Western Blotting <ol><li> Caricare i campioni su un dodecil solfato di sodio (SDS) gel di poliacrilammide contenente un impilamento 5% su un gel risolvere 12%. Separare le proteine ​​a 25 mA per gel finoil blu di bromofenolo esaurisce. </li><li> Attiva una fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana per 30 secondi con metanolo e metterla in tampone di trasferimento (Tris 48 mM, glicina 39 mM, SDS 1,3 mM, 20% metanolo). </li><li> Preparare la blotting con un sistema blotting semisecco e consentire il trasferimento delle proteine ​​a 10 V per 1 ora. Prendere la membrana fuori, sciacquare brevemente con acqua e lasciare asciugare. </li><li> Riattivare la membrana da poco il trasferimento in metanolo. Lavare per 5 minuti con TBS. Bloccare con il 10% di latte scremato in TBS per 1 ora a RT o a 4 ° CO / N. Lavare il 3x membrana per 5 minuti ciascuno con TBS. </li><li> Preparare la diluizione anticorpo come indicato nella Tabella 1 e incubare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. </li><li> Lavare 3x membrana per 10 minuti ciascuno con TBS-T. Aggiungere l&#39;anticorpo secondario appropriato accoppiato con perossidasi di rafano alla diluizione 1:20.000 in 1% di latte scremato in TBS. Incubare 45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3x membrana per 10 minuti ciascuno con TBS-T e otempo supplementare ne con TBS. </li><li> Per il rilevamento del segnale utilizzando un kit commerciale chemiluminescense e un sistema di imaging gel digitale. </li></ol></li><li> Blu brillante Coomassie G-250 Colorazione <ol><li> Eseguire SDS-PAGE come descritto al punto 4.2.1. Caricare i campioni su un gel di poliacrilammide SDS ed eseguire il gel a 25 mA per gel fino bromofenolo blu si esaurisce. </li><li> Eseguire Coomassie Brilliant colorazione blu G-250 a RT. Fate tutte le incubazioni sotto costante agitazione. </li><li> Trasferire il gel alla soluzione di fissaggio contenente il 40% di metanolo e acido acetico 10% per 30 min. </li><li> Scambiare il buffer di soluzione decolorante (25% etanolo e acido acetico all&#39;8%) e incubare per 5 min. </li><li> Macchiare il gel con 0,2% Coomassie Brillant blu G-250 in 40% metanolo e acido acetico 10% per 1 ora. </li><li> Destain gel con la soluzione decolorante e scambiare buffer dopo 10 min, 30 min e 60 min. </li><li> Conservare il gel in 25% di etanolo, acido acetico all&#39;8% e 4% glicerolo a 4 ° C. </li&gt; <li> Eseguire l&#39;imaging e di analisi come descritto al punto 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. Analisi della oligomeriche membri di Pattern Recognition recettori <ol><li> PAGINA Native <ol><li> Preparare 50 pg di lisato cellulare in un volume finale di 10 ml con PBS e aggiungere 5 × tampone nativo campione (250 mM Tris-HCl pH 6.8, 1% desossicolato di sodio, 50% glicerolo, 0,5% blu di bromofenolo) ad una concentrazione finale di 1x. </li><li> Caricare immediatamente i campioni su un gel di poliacrilammide nativo con 5% come impilabile e 8% come risolvere gel. Qualsiasi ritardo si tradurrà in una perdita di complessi nativi 34. </li><li> Attivare il gel a 20 mA per gel a 4 ° C con 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM glicina come come anodo e 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glicina, 1% sodio desossicolato come tampone catodo. Dopo 1,5-2 ore (blu di bromofenolo band ha lasciato il gel circa 45 min prima) l&#39;elettroforesi è finito. </li></ol></li><li> Western blotting <ol><li> Attivare un polyvinylidene fluoruro (PVDF) membrana per 30 secondi con metanolo e metterla in tampone Towbin (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% SDS, 20% metanolo). </li><li> Assemblare una camera di macchia umido secondo le istruzioni del produttore e riempire il serbatoio con il tampone Towin. </li><li> Eseguire il blotting con 250 mA per 1,5 ore a 4 ° C. </li><li> Quando assorbente è finito procedere come descritto da 4.2.3 a. </li></ol></li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Percependo la presenza di virus e l&#39;attivazione del tipo antivirale IFN sistema sono cruciali per il successo delle risposte immunitarie innate 22. Rilevamento di virus viene così mediata da recettori di riconoscimento dei patogeni (PRR) come RIG-I e PKR, consentendo una risposta rapida e l&#39;attivazione dei meccanismi di difesa antivirale. Qui, descriviamo due metodi per valutare direttamente lo stato di attivazione di RIG-I e PKR. Digestione proteasi limitata come strumen...

Un evento cruciale nella difesa ospite antivirale è il rapido rilevamento del patogeno da parte dei cosiddetti recettori pattern recognition (PRR) 1,2. Rilevamento intracellulare di infezione da virus RNA dipende da due elicasi RNA citoplasmatici, RIG-I (acido retinoico gene inducibile I) e md5 se si usano (differenziazione melanoma associato proteine ​​5) 3-5. RIG-I è composto di due domini N-terminali caspasi assunzione (CARDs), un tipo DECH-box dominio RNA elicasi centrale, e un dominio C-terminale (CTD) 4,6. Considerando che il CTD e il dominio elicasi sono necessari per il riconoscimento del non-self (RNA virale), le carte mediare segnalazione a valle che porta alla creazione di uno stato di ospite antivirale. Se RIG-I è nello stato silenzioso, cioè in assenza di uno specifico ligando di RNA, la seconda carta interagisce con il dominio elicasi centrale e mantiene RIG-I in un auto-inibitrice conformazione 7-11. RIG-I si lega a breve doppiofilamento (ds) RNA recante un 5&#39;-trifosfato (5&#39;PPP), lungo dsRNA, e poliureta / UC-ricchi RNA, strutture firma classici che sono presenti sui genomi di molti virus a RNA 12-16. Due importanti caratteristiche di attivazione RIG-I sono un passaggio a una conformazione chiusa 6,17 e omo-oligomerizzazione 6,18,19. L&#39;interruttore conformazionale migliora RNA vincolante, espone le schede per la segnalazione a valle, e ricostituisce un sito ATPasi attivo 8,9,11,20. La formazione di oligomeri RIG-I porta ad una maggiore assunzione di molecole adattatrici segnalazione a valle per formare una piattaforma per antivirale trasduzione del segnale 11. La catena di segnalazione RIG-I-regolato casualmente attiva il fattore di trascrizione IRF-3 per up-regolazione di interferone (IFN-alpha/beta) geni e quindi l&#39;espressione del gene dell&#39;interferone stimolato geni (ISGS) per una completa risposta antivirale 21,22 . Uno dei migliori caratterizzato ISGS è la protei RNA-activatedn chinasi (PKR) 23. PKR appartiene alla famiglia delle eucariotico traduzione iniziazione fattore alfa 2 (eIF2α chinasi) ed è composto da un doppio filamento RNA dominio di legame N-terminale e un dominio chinasi C-terminale. Il dominio di chinasi costituisce l&#39;interfaccia dimerizzazione cruciale per l&#39;attivazione PKR e svolge le funzioni catalitiche della proteina. Il legame di PKR a dsRNA virale porta al suo cambiamento conformazionale che consente dimerizzazione e auto-fosforilazione in Thr 446 tra gli altri residui. PKR poi media fosforilazione di eIF2α, bloccando così la traduzione di mRNA virale 23-27. Entrambi RIG-I e PKR subisco grandi riarrangiamenti strutturali, formare complessi oligomerici e sono post-traduzionali modificato dalla fosforilazione / defosforilazione e di ubiquitinazione 10,11,19,23,24,26-29. Per una migliore comprensione dei quali strutture di RNA virali stanno attivando RIG-I e PKR (e in quale fase antagonisti virali potrebbe be interferenza), è importante determinare con precisione lo stato di attivazione. Per entrambi PRR è stato descritto in precedenza che l&#39;attivazione porta alla nascita di frammenti proteici tripsina-resistente 6,17,30 e oligomeri di ordine superiore 6,18,19. Tuttavia, data la ricchezza di letteratura su questi fattori chiave della risposta dell&#39;ospite antivirale 1,2,24, applicazione di metodi diretti sembra relativamente rari. Nella speranza di stimolare l&#39;utilizzo più ampio, forniamo protocolli convenienti e sensibili per analizzare con fermezza gli stati di attivazione del RIG-I e PKR. L&#39;IFN competente A549 linea cellulare umana è stato infettato da un attivatore consolidata di RIG-I e PKR, la attenuato virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13) 31,32. Dopo una semplice procedura di lisi, gli estratti di cellule infette sono testati dalla limitata tripsina digestione / Western Blot per valutare switching conformazionale, e blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (PAGINA) / Analys Western Blotè quello di misurare la formazione di oligomeri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Difese dell&#39;ospite all&#39;infezione da virus dipendono da una rapida individuazione da parte dei recettori pattern recognition (PRR) del sistema immunitario innato. Nel citoplasma, i PRRs RIG-I e PKR legano a specifici ligandi di RNA virale. Questa prima media commutazione conformazionale e oligomerizzazione e quindi permette l&#39;attivazione di una risposta interferone antivirale. Mentre i metodi per misurare l&#39;espressione genica ospite antivirale sono ben stabiliti, i metodi per monitorare direttamente gli stati di attivazione del RIG-I e PKR sono solo parzialmente e meno ben stabilite. Qui, descriviamo due metodi per monitorare RIG-I e PKR stimolazione al momento dell&#39;infezione, con un induttore di interferone stabilita, il virus della febbre della Rift Valley clone mutante 13 (Cl 13). Tripsina digestione limitata permette di analizzare alterazioni nella sensibilità proteasi, indicando cambiamenti conformazionali delle PRRs. Tripsina digestione dei lisati da finte infetti cellule si traduce in una rapida degradazione di RIG-I e PKR, whereas Cl 13 infezione porta alla nascita di un RIG-I frammento resistente alle proteasi. Anche PKR mostra una resistenza parziale virus-indotto a digestione con tripsina, che coincide con la sua caratteristica fosforilazione in Thr 446. La formazione di RIG-I e oligomeri PKR ha convalidato nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE). Al momento dell&#39;infezione, vi è un forte accumulo di RIG-I e PKR oligomeri, che queste proteine ​​sono rimasti come monomeri in campioni infetti finto. Digestione proteasi Limited e PAGE nativo, entrambi accoppiati ad analisi Western Blot, consentono una misurazione sensibile e diretto di due diverse fasi di RIG-I e l&#39;attivazione PKR. Queste tecniche sono relativamente facili e veloci da eseguire e non richiedono attrezzature costose.

Il riconoscimento di un agonista virale RIG-I o PKR trigger switching conformazionale 6,17,30 e oligomerizzazione 6,18,27. Abbiamo analizzato questi due marcatori di attivazione da parte limitato la digestione della proteasi e nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), rispettivamente. Cellule umane A549 sono state infettate con virus della febbre della Rift Valley clone 13 (Cl 13), che è caratterizzata da una mutazione dell&#39;antagonista IFN NSs 35,...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Difese innate alle infezioni virali sono attivati ​​da recettori di pattern recognition (PRR). I due PRRs citoplasmatici RIG-I e PKR legano a RNA virali firma, il cambiamento di conformazione, oligomerize, e attivare la segnalazione antivirale. Metodi sono descritti che consentono di tenere sotto controllo la commutazione conformazionale e l&#39;oligomerizzazione di questi PRRs citoplasmatici.

Attivazione Monitoraggio del Pattern Recognition antivirale recettori RIG-I E PKR By limitata proteasi Digestione e PAGE Native

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Views.  Philipps-University Marburg.  Difese innate alle infezioni virali sono attivati ​​da recettori di pattern recognition (PRR). I due PRRs citoplasmatici RIG-I e PKR legano a RNA virali firma, il cambiamento di conformazione, oligomerize, e attivare la segnalazione antivirale. Metodi sono descritti che consentono di tenere sotto controllo la commutazione conformazionale e l'oligomerizzazione di questi PRRs citoplasmatici. 

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

Riconoscimento della transglutaminasi epidermica da IgA e 2 anticorpi transglutaminasi tissutale in un raro caso di Rhesus Dermatite

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescenza per Monitorare il Cellular assorbimento di Lattoferrina umana e la sua associata attività antivirale contro il virus dell&#39;epatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

All&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...