Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare come l'importanza di diversi domini proteici nell'interazione enzimatica del recettore e nell'attivazione enzimatica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente test concomitanti delle interazioni enzimatiche del recettore e delle conseguenze funzionali di questa interazione sull'attività enzimatica. Per ogni piastra, utilizzare 10 millilitri di DMEM integrati con 10%FBS e 1%penicillina e streptomicina.
Il giorno prima della trasfezione, seminare cellule renali embrionali umani 293-T in piastre di 12 10 centimetri usando un emocitometro per contare le cellule. Incubare a 37 gradi Celsius nel 5%C02. Una volta che le cellule sono confluenti dall'80 al 90%, utilizzare un agente di trasfezione a base lipidica per trasfetto cinque delle piastre.
Eseguire la trasfezione seguendo le istruzioni del produttore per le celle di aderenza in piastre di 10 centimetri. Quindi trasfetto un secondo set identico di cinque piastre insieme a una piastra aggiuntiva che funge da controllo non trasfetto per la misurazione della quantità di proteine espresse prima dell'immunoprecipitazione. Incubare le piastre trasfette in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius nel 5%CO2 per 48 ore.
Utilizzare un microscopio fluorescente per esaminare le celle per l'espressione GFP e assicurarsi che la trasfezione si sia verificata correttamente. Mescolare 15 microlitri di ortovanato di sodio da 100 millimolare con 50 microlitri di perossido di idrogeno al 30% per preparare una miscela di pervanadate fresca. Per fosforilate le versioni taggate del PD-1, rimuovere il supporto dalle celle trasfette PD-1-GFP.
Aggiungere 10 millilitri di DMEM semplice e 10 microlitri di pervanadate ad ogni piastra. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule tre volte in PBS ghiacciato utilizzando cinque millilitri di PBS per lavaggio.
Durante l'esecuzione dell'immunoprecipitazione, tutti i passaggi devono essere eseguiti sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Integrare il tampone dilisi con inibitori della proteasi sciogliendo una compressa degli inibitori in 10 millilitri di tampone. Aggiungere anche un millimolare di ortovanato di sodio al tampone che verrà utilizzato sulle piastre transfette PD-1-GFP.
Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciata alle cellule, assicurandosi di aggiungere il tampone di lisi contenente l'ortovanato di sodio solo alle piastre contenenti cellule trasfette da PD-1-GFP. Utilizzare un raschietto per cellulare per rimuovere e raccogliere immediatamente le cellule dalle piastre. Trasferire i lisati in tubi freddi da 1,5 millilitri e ruotarli a 0,005 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Per raccogliere il supernatante post-nuclei dai lisati, spinli verso il basso a 10.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi e scartare il pellet. Conservare i supernatanti per il secondo set di sei piastre su ghiaccio per una successiva analisi WCL.
Per iniziare a preparare le perline anti-GFP, agitare delicatamente la bottiglia contenente le perline prima dell'apertura per evitare la sedimentazione. Rimuovere 40 microlitri delle perline anti-GFP dal liquame per ogni condizione. Centrifuga a 500 volte la gravità e quattro gradi Celsius per tre minuti.
Rimuovere il supernatante per lavare le perline, assicurandosi di ridurre al minimo il contatto tra la pipetta e le perline per evitare perdite. Rimescolare le perline in 80 microlitri di tampone di lysis per campione. Aggiungere le perline lavate direttamente al lysate cellulare dalle cellule che esprimono PD-1-GFP del primo set di quattro piastre.
Ruotare a 0,005 volte la gravità per 30 minuti a quattro gradi Celsius per immunoprecipitare le proteine taggate dalla GFP. Lavare le perline tre volte utilizzando un millilitro di tampone di lisi fredda che non contiene ortovanadate per ogni lavaggio. Quindi centrifugare a 2.500 volte la gravità per 10 secondi.
Dividere il lisato dell'SHP2 attivo dal primo set di piastre in tre porzioni uguali e aggiungere una porzione a ciascuno dei tre tubi contenenti le perline lavate contenenti PD-1-GFP. Aggiungere 1/3 del volume di lisato dalle cellule non trasfette al secondo tubo delle perle PD-1-GFP di tipo selvatico. Scartare il restante 2/3.
Incubare le perline per quattro ore a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata a 0,005 volte la gravità. Dopo questo, lavare le perline due volte usando un millilitro di tampone di lisi fredda per ogni lavaggio. Aggiungere 80 microlitri di tampone dilisi a ciascun campione, assicurando che il volume totale in ogni tubo sia di 100 microlitri.
Utilizzando una punta di pipetta tagliata, pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Quindi trasferire 50 microlitri da ogni tubo in due tubi freschi da 1,5 millilitri. Lavare le perline una volta con tampone di lavaggio fosfatasi.
Quindi rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere 100 microlitri di tampone di dosaggio alle perline e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti sotto delicata agitazione. Quando il tampone diventa giallo, terminare la reazione aggiungendo 50 microlitri di una soluzione molare di idrossido di sodio.
Centrifuga a 2.500 volte la gravità per 10 secondi. Successivamente, trasferire il supernatante in due pozzi di mezza area in una piastra da 96 po '. Leggere gli assorbenti a 405 nanometri ed esprimere i risultati come densità ottica relativa sulla versione di controllo di tipo selvaggio di PD-1-GFP.
Prima spin giù le perline a 2.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Aggiungere 20 microlitri di tampone Laemmli due volte e far bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando un kit BCA, misurare la concentrazione proteica dei controlli di input.
Trasferire 30 microlitri del campione più diluito in un nuovo tubo. Utilizzare il tampone di lisi per diluire il resto dei controlli di input alla stessa concentrazione del campione più diluito. Quindi trasferire 30 microlitri di ciascuno dei comandi di ingresso diluiti su un nuovo tubo.
Aggiungere volumi uguali di due volte il buffer Laemmli ai lisati e farli bollire di 95 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, spingi le perline a 2.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 secondi prima di eseguire l'analisi Western Blot come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, viene sviluppato un saggio combinato di co-immunoprecipitazione e attività enzimatica per la valutazione parallela delle interazioni enzimatiche del recettore e dell'attivazione.
Non sorprende che SHP2 non sia riuscito a legarsi al PD-1 quando ITSM è stato mutato. Sorprendentemente, la versione mutante dell'ITIM inibì l'associazione SHP2 solo in misura limitata. Tuttavia, il saggio di attività SHP2-fosfatasi rivela che ITIM e ITSM sono ugualmente indispensabili per l'attività enzimatica.
Ciò rivela un modello di attivazione in due fase in cui SHP2 viene piegato in una conformazione automatica in condizioni di riposo. All'attivazione del PD-1, SHP2 viene reclutato nell'ITSM fosforilato. Tuttavia, l'ITIM deve anche essere fosforilato per dispiegarsi SHP2 nella sua conformazione attiva.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione cellulare per esplorare la funzione dei domini proteici nelle interazioni recettore-enzima.
