Le nuove tecniche di microscopia richiedono lo sviluppo di strumenti adeguati per la corretta comprensione dei processi biologici studiati. Questo protocollo descrive le fasi di elaborazione delle immagini necessarie per il tracciamento a singola molecola, inclusa la stima dei parametri di diffusione laterale e la quantificazione delle dimensioni dello spot sull'intera traiettoria nella membrana cellulare. Questo protocollo combina l'uso di diverse parti software, tra cui ImageJ, MATLAB e uTrack, così come alcune proteine che sono state sviluppate specificamente per questo protocollo.
Questo metodo è illustrato con il tracciamento dei recettori a membrana sotto microscopia ottica, ma può essere applicato a qualsiasi struttura simile a particelle le cui traiettorie possono essere tracciate nel tempo in una sequenza video. Questa tecnica si riferisce alla ricerca di base e non ha applicazione diretta in un ambiente clinico. Tuttavia, può essere utilizzato per aiutare nella caratterizzazione di eventi biologici sia in diverse malattie che quindi nell'identificazione di nuovi obiettivi terapeutici.
Questo protocollo è rilevante per il tracciamento delle particelle nelle membrane cellulari, come mostrato in questo video, ma può anche essere applicato per il tracciamento di cellule complete, batteri, nanoparticelle in un fluido o qualsiasi altro oggetto il cui centro può essere ben determinato. Questo protocollo è intuitivo e richiede solo la conoscenza della coltura cellulare e delle tecniche di microscopia. Le diverse tecniche e strumenti informatici utilizzati in questo protocollo possono intimidire un nuovo utente.
La dimostrazione visiva aiuta a utilizzare questa tecnica con sicurezza. Per iniziare, far crescere le cellule di Jurkat, trasfetterle con un vettore recettore della chemiochina etichettato GFP monomerico e selezionare le cellule con bassi livelli di espressione del vettore etichettato, come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Aggiungere i supporti contenenti il ligando CXCL12 o il supporto di controllo a ciascuna stoviglie microwell con fondo di vetro da 35 millimetri rivestite con fibronectina e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius.
Quindi, aggiungere le cellule ordinate a ogni piatto e incubare per 20 minuti prima di imaging delle cellule. Dopo l'incubazione, trasferire il primo piatto di cellule in uno stadio di microscopio TIRF e passare all'obiettivo di immersione dell'olio 100x. Individuare e mettere a fuoco le celle utilizzando un campo luminoso per ridurre al minimo gli effetti di fotobleaching.
Quindi passare alla modalità TIRF ed eseguire una regolazione a fuoco fine utilizzando una bassa intensità laser. Acquisire filmati di circa 50 secondi di lunghezza, riducendo al minimo l'intervallo di tempo tra i fotogrammi. Per ogni file video di condizione sperimentale, creare una nuova cartella seguendo le indicazioni sulla struttura dei file descritte nel protocollo di testo di questo video.
Aprire il video con Fiji o ImageJ trascinando e rilasciando il file sulla barra dei menu delle Fiji e fare clic su OK per importare il file LIF utilizzando i bioformati. Per progettare una maschera, importare anche l'immagine multicanale corrispondente. Quindi, crea una maschera creando prima una singola immagine con i canali utili per la progettazione della maschera.
Selezionate Immagine (Image) nel menu della barra e fate clic su Colore (Color) seguito da Dividi canali (Split Channels) per visualizzare i diversi canali come immagini separate. Unire nuovamente i tre canali in una singola immagine selezionando Immagine nel menu della barra, andando su Colore e selezionando Unisci canali. Assicurarsi di selezionare i canali appropriati e quindi premere OK per generare una nuova immagine non in pila.
Sincronizzare le due finestre andando al menu della barra, selezionando Analizza e quindi andando a Strumenti e selezionando Sincronizza Windows. Verrà visualizzata una nuova finestra con le possibilità di immagine sincronizzate. Ora, con le due finestre sincronizzate, è possibile ritagliare la stessa area in entrambe le finestre.
Passare a Immagine nel menu della barra e selezionare Ritaglia. Con lo strumento di selezione rettangolare, disegna la regione di interesse. Le due immagini ritagliate verranno mostrate singolarmente.
Quindi, annullare la sincronizzazione di entrambe le finestre. Se non è stata creata alcuna maschera, disegnare l'area di interesse con lo strumento di selezione e il ritaglio. Successivamente, salvate il video come sequenza di immagini nella directory Videosec.
Quindi selezionare l'immagine multicanale, passare a Plugin nel menu e selezionare Editor segmentazione per aprire il plug-in dell'editor di segmentazione. Scegliete lo strumento di selezione a mano libera e usatelo per selezionare un'etichetta verde e progettare la maschera più esterna. Una volta progettato, premi il pulsante Più nell'opzione di selezione della finestra composita e la maschera selezionata verrà visualizzata sul visualizzatore.
Ripetere questo passaggio per tutte le etichette. Una volta progettate tutte le maschere, salvare la maschera con lo stesso nome di file del video, con il nome:mask.tif. Aprite MATLAB e aggiungete la directory uTrack al percorso andando a Imposta tracciato (Set Path) e selezionando Aggiungi con (Add With).
Quindi, modificare la directory di lavoro nella directory contenente la serie da analizzare. Richiamare uTrack digitando l'interfaccia utente grafica del selettore filmato nella console e premendo INVIO. In questo modo verrà aperta la finestra di selezione del filmato.
Premere il pulsante Nuovo filmato e attendere la visualizzazione della finestra Aggiunta filmato. Premere Su Aggiungi canale per scegliere la directory con il video e compilare i parametri delle informazioni del filmato. Impostare la directory di output per i risultati di uTrack su Risultati, quindi premere Impostazioni canale avanzate, riempire i parametri relativi all'acquisizione e salvare.
Dopo aver creato il filmato, premete Continua nella finestra di selezione del filmato. Qui, uTrack chiederà il tipo di oggetto da analizzare. Selezionate Particelle singole (Single Particles) e quindi apparirà la finestra del pannello di controllo.
Selezionare quindi il primo passaggio, Passaggio 1:Rilevamento, quindi fare clic su Impostazione. Verrà visualizzata la finestra Impostazione raccordo modello miscela gaussiana (Setting Gaussian Mixture Model Fitting). Immettere le impostazioni visualizzate qui e quindi premere Applica.
Nel Pannello di controllo fare clic su Esegui per eseguire il passaggio di rilevamento. Dopo alcuni minuti, controllare i risultati premendo il pulsante Risultato. Il filmato mostra cerchi rossi sulle particelle rilevate.
Se non viene mostrato alcun cerchio rosso, questo passaggio non ha funzionato correttamente e dovresti riprovare. Ora, unisci le particelle che sono state appena rilevate in tracce che si estendono su più fotogrammi impostando prima i parametri come mostrato qui. Quindi premere Esegui nel Pannello di controllo.
Eseguire quindi analisi delle tracce. Definire le impostazioni, come illustrato di seguito, quindi premere Applica ed Esegui. Verificare i risultati premendo prima il pulsante Risultato, quindi fare clic su Mostra numero traccia della finestra delle opzioni filmato e controllare fotogramma per fotogramma che ogni traccia è stata identificata correttamente, contrassegnando manualmente particelle che non sono particelle vere.
In MATLAB, immettete il comando come mostrato qui. Questo comando farà sì che il programma legga tutte le traiettorie e calcoli i coefficienti di diffusione. Quindi, escludete le traiettorie corrispondenti a punti o traiettorie identificati in modo errato fornendo l'elenco di punti da escludere.
Calcolare i coefficienti di diffusione istantanea per ciascuna delle tracce di questa cella seguendo il protocollo di testo che lo accompagna. In questo caso, calcolare il coefficiente di diffusione per un lag di tempo è uguale a 4 chiamato da D1 a 4. Al termine, scomporte le traiettorie in traiettorie brevi e lunghe.
Per analizzare traiettorie lunghe, digitate il comando come mostrato qui per classificare il tipo di movimento attraverso il loro spettro di ridimensionamento del momento. Analizza l'intensità di ogni particella lungo la loro traiettoria. Configurare questo comportamento di base in molti modi diversi seguendo il protocollo di testo allegato.
Quindi, raccogliere le informazioni sulla diffusione e sull'intensità per tutte le traiettorie. Raccogliere solo le informazioni sulla diffusione e sull'intensità per traiettorie brevi. Infine, raccogli il ridimensionamento dello spettro del momento e le informazioni sull'intensità digitando quanto segue, dove long è il suffisso usato in precedenza.
L'utilizzo delle tecniche descritte in questo protocollo consente il tracciamento automatizzato delle particelle rilevate nei filmati di microscopia a fluorescenza e l'analisi delle loro caratteristiche dinamiche. Da questa analisi, si possono ottenere caratteristiche diverse in base alle variazioni negli stimoli. Ciò include la percentuale di macchie immobili basate su quattro diversi stimoli, la percentuale di traiettorie lunghe superiori a 50 fotogrammi e i tipi di movimento lungo le traiettorie come spezzati da movimenti diretti, liberi o confinati.
Inoltre, è possibile determinare il coefficiente di diffusione, le intensità media spot e il numero di recettori per particella. Questo mostra la distribuzione dei valori del coefficiente di diffusione breve per ogni punto in risposta a diversi stimoli. La linea rossa rappresenta il valore mediano, questo grafico simile mostra le intensità del punto medio per ogni punto lungo i suoi primi 20 fotogrammi in risposta agli stessi stimoli.
Ancora una volta, la linea rossa rappresenta il valore di intensità media. Poiché l'intensità corretta media di un punto è correlata al numero di proteine fluorescenti presenti in questo punto, si può calcolare direttamente il numero di recettori per particella, come mostrato qui. MATLAB è un linguaggio di programmazione con la fascienza di maiuscole e minuscole.
È possibile variare i nomi delle variabili rispetto a quelli descritti in questo protocollo, ma assicurarsi di essere coerenti nella denominazione. I nomi delle funzioni non possono essere modificati e virgole, due punti e punti e punti e virgola sono importanti per una sintassi corretta. La microscopia a singola molecola consente la visualizzazione di singole proteine di membrana con una risoluzione spazio-temporale senza precedenti e offre opportunità uniche per rivelare aspetti imprevisti della biologia cellulare.
Questi protocolli aprono nuove porte per l'analisi quantitativa dei video di microscopia nelle cellule e nella biologia molecolare.
