This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

Etichettare i contenitori da utilizzare per lo stoccaggio dei muscoli con gli identificatori appropriati per l&#39;animale e il muscolo raccolto. Pre-raffreddano i sacchetti / contenitori e strumenti per evitare congelamento / scongelamento del tessuto quando viene aggiunto. 1. Considerazioni di studio-progettazione per il tessuto muscolare Collection <ol><li> Per piccoli animali (murini) modelli di malattia muscolare, usa un intero muscolo per lo studio in quanto piccoli modelli animali spesso richiedono la valutazione di un intero muscolo di fornire sufficiente campionamento myofiber per gli studi patologici. Per grande animale (canino) modelli di malattia muscolare, usa porzioni muscolari che sono almeno 0.3 x 0.3 cm o maggiore nella loro trasversale (trasversale) aspetto. NOTA: biopsie nucleo può essere utilizzato anche, ma possono essere ottimale per studi di caratterizzazione primari a causa di problemi di campionamento. </li><li> Per gli studi che coinvolgono il sarcomero, la misura ultrastrutturali della lunghezza del sarcomero può comprendere un endpoint critico e può require specializzata manipolazione. Questo è di solito rilevante solo nelle malattie in cui gli elementi del sarcomero spettacolo lunghezze appropriato, come in alcune cause di nemaline miopatia. Alcuni laboratori preferiscono riparare il muscolo nel suo stato non-contratto o allungato, anziché effettuare queste misurazioni sul muscolo non in tensione o non allungato. <ol><li> Se non sarà misurata lunghezza sarcomero, fissare il tessuto muscolare senza pre-stiramento del muscolo collocandolo direttamente nel fissativo EM desiderato (vedi Reagenti). </li><li> Se saranno misurate le lunghezze sarcomero, possono essere utilizzate diverse tecniche di pre-allungare il muscolo (vedi Discussione): <ol><li> Utilizzare un dispositivo di bloccaggio per tenere il muscolo sua tensione di riposo, mentre è ancora in animale, asportare il muscolo intorno alla parte esterna della pinza, ed inserire direttamente nel fissativo EM desiderato (vedi Reagenti). </li><li> Allungare e pin muscolo ad una superficie (ad esempio un pezzo di sughero) ad una lunghezza simile a quella osservata <em&gt; in vivo dopo che è stato estratto dall&#39;animale. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sub-dividere il isolata del muscolo scheletrico in frammenti che sono appropriati per gli Studi desiderati (Figura 1) <ol><li> Per congelati istologia muscolare: <ol><li> Includere tanto di un determinato muscolo possibile per minimizzare i bias di campionamento (vedi punto 1.1), ma i campioni devono essere &lt;1,5 centimetri per evitare il congelamento artefatti. </li><li> Trattare tutti i muscoli dallo stesso studio simile per evitare che le differenze artefatti nelle dimensioni delle fibre a causa di differenze di trattamento. </li></ol></li><li> Per la microscopia elettronica (EM): <ol><li> Tagliare un ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 centimetri striscia di muscolo dal campione, con l&#39;asse longitudinale del campione parallelo all&#39;asse longitudinale del muscolo originale. NOTA: Il fissativo non sarà adeguatamente penetrare spessi pezzi di tessuto, in modo da mantenere lo spessore del campione pari o inferiore a 2 mm è fondamentale per ottenere risultati adeguati. Inoltre,l&#39;orientamento di tali piccoli frammenti di muscolo è spesso difficile, è consigliabile utilizzare un frammento di tessuto che imita l&#39;orientamento effettivo del muscolo (cioè, l&#39;aspetto più lungo dei campione fissato è l&#39;orientamento longitudinale del muscolo / miofibre) a minimizzare la movimentazione e la confusione durante la lavorazione EM. </li></ol></li><li> Per la coltura cellulare: <ol><li> La resa cella desiderata può influenzare la quantità di muscolo necessaria per lo stabilimento di coltura cellulare. Muscoli singoli (o porzioni di muscoli) da piccoli animali possono fornire il numero di cellule sufficienti a stabilire colture cellulari, quindi, se necessario, piscina tessuto da più muscoli. </li></ol></li></ol> 3. Fissazione lavorazione di tessuti e per la microscopia elettronica (EM) <ol><li> Collocare un frammento di muscolo non superiore a 2 mm sua dimensione più sottile direttamente nel fissativo EM desiderato (vedi Reagenti). </li><li> Posizionare il muscolo in tampone fissativo EM (vedi Reagenti), dopo 2-48 ore di fixation. Fissazione prolungata (per settimane o mesi) può causare la perdita di dettaglio ultrastrutturale per studi EM. </li><li> Invia ad un impianto di base di EM per l&#39;elaborazione. </li></ol> 4. Congelamento muscolare per istologica, biochimica e studi molecolari <ol><li> Rimuovere eccessiva umidità nel campione COMPLETAMENTE tamponando il campione con un tovagliolo di carta finché il tessuto è leggermente aderente al telo. Eccessiva umidità produrrà significativi manufatti di congelamento nel muscolo. NOTA: tessuto può essere ulteriormente asciugato facendolo rotolare in polvere per bambini. Questo passaggio non è generalmente necessaria per i muscoli meno che non siano stati in un ambiente eccessivamente umido. </li><li> Posizionare OCT (o un adesivo simile come la gomma adragante) sul fondo di una cryomold superficiale o sul sughero, con solo abbastanza Office per fornire una base per il muscolo orientato (Figura 2C). Etichettare il sughero o cryomold prima il congelamento può essere utile per il monitoraggio del campione. </li><li> Carefully posizionare il muscolo nello stampo con l&#39;orientamento desiderato, con la maggior parte del muscolo sporgente dal PTOM in modo che il muscolo sezionata non è in contatto con OCT (Figura 2C). </li><li> Aggiungere isopentano a una tazza di metallo fino a raggiungere una profondità di circa 3-4 cm. </li><li> Indossare guanti di protezione termica e rimuovere il coperchio di Dewar. </li><li> Posizionare o tenere la tazza di metallo a contatto con l&#39;azoto liquido, in modo che il livello di azoto liquido sulla parte esterna della coppa è superiore al livello del isopentano all&#39;interno della tazza. Strategie per organizzare questi contenitori sono mostrati nella Figura 2. <ol><li> Non consentire l&#39;azoto liquido per entrare nella tazza di metallo, in quanto produce una schiuma spumeggiante che può essere ingombrante per lavorare con (ed è anche sufficientemente freddo per congelamento). </li></ol></li><li> Osservare il isopentano per determinare quando ha raggiunto la temperatura adeguata. Alla temperatura appropriata (ottimale tra -140 a -149 ° C), cosìCoperchio bianco ciottoli di isopentano congelati formeranno (dopo pochi minuti, e dopo la nebbia iniziale è scomparso sopra la isopentano) sul fondo della coppa, oppure la soluzione generalmente addensare alla consistenza di melassa. Congelamento prima di questa fase sarà resa atifacts congelamento. <ol><li> Se il isopentane blocca del tutto solida, scongelare e chill al congelamento di nuovo le temperature prima di riutilizzarli. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze pre-refrigerati, abbassare il campione e sughero / muffa nella isopentane per circa 10-20 sec. </li><li> Porre il campione congelato in un contenitore pre-raffreddato. </li><li> Mantenere campione e contenitore in ghiaccio secco in ogni momento fino al trasferimento in un -80 ° C freezer. </li></ol> 5. Se Artifact congelamento è presente nel tessuto già congelati, è possibile migliorare il grado di Artefatto congelamento utilizzando la seguente &quot;Disgelo e Congelare nuovamente&quot; Procedura <ol><li> Prendere blocchi dal congelatore, una alla volta, E tenerli in ghiaccio secco. La tempistica di questo protocollo è fondamentale. Scongelare e ricongelare un blocco alla volta soltanto. </li><li> Spostare campione dal ghiaccio secco a RT. </li><li> Se il campione è stato incorporato in OCT, rimuovere PTOM circostante il più completamente possibile utilizzando un bisturi. </li><li> Lasciare il campione scongelamento a temperatura ambiente fino al punto in cui è completamente scongelato, ma non fino al punto in cui si sta asciugando fuori. <ol><li> Spingere delicatamente il campione con una pinza per garantire che il campione è completamente scongelato prima di passare alla fase successiva. </li></ol></li><li> Congelare il muscolo, come specificato nei passaggi 4,1-4,10. </li></ol> 6. Preparazione di Muscle per pelate in fibra single Testing Funzionale <ol><li> Il regime di custodia per il muscolo dipende da quando il muscolo / fiber viene utilizzato per esperimenti. <ol><li> Per l&#39;uso nel giro di poche settimane, posizionare il muscolo in una soluzione di 50% glycerol/50% soluzione rilassante (vedi Reagenti), e conservare a -20 ° C. </li><li> Per uso poppaer un paio di settimane, posizionare il muscolo in una soluzione del 75% glycerol/25% soluzione rilassante (vedi Reagenti), e conservare a -80 ° C. </li><li> In alternativa, lasciare asciugare muscolare, perno di sughero, e negozio on granuli di silice a -80 ° C. Questi muscoli disidratati possono essere usati per anni. </li></ol></li></ol> 7. Preparazione del muscolo fresco per la spedizione di coltura cellulare per laboratori esterni Protocolli per la creazione di colture cellulari sono stati ben descritto altrove 4-7. <ol><li> Riempire una provetta sterile da 50 ml con sterile terreno di coltura completo. </li><li> Aggiungi il tessuto muscolare per il tubo con una pinza sterile, sommergendo completamente il tessuto in media. <ol><li> Riempire il resto del tubo con mezzi per impedire l&#39;essiccazione durante la spedizione. </li></ol></li><li> Aggiungi impacchi di ghiaccio alla scatola di polistirolo e posizionare il tubo conico vicino a numerosi impacchi di ghiaccio. <ol><li> Si prega di notare che dovrebbero essere usati solo impacchi di ghiaccio (e non ghiaccio secco)per evitare danni da congelamento del liquido e tessuto. </li></ol></li><li> Pacchetti Nave O / N, ma i tessuti possono durare due giorni in queste condizioni. </li></ol>

<ol>
	<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy.">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li><li>Talmadge, R. J., Roy, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubularin-deficient+myoblasts+display+increased+apoptosis,+delayed+proliferation,+and+poor+cell+engraftment.">Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment.</a> Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).</li><li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells.">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li><li>Webster, C., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+age-related+decline+in+replicative+life-span+of+Duchenne+muscular+dystrophy+myoblasts:+implications+for+cell+and+gene+therapy.">Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy.</a> Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).</li><li>Ottenheijm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+filament+length+dysregulation+contributes+to+muscle+weakness+in+nemaline+myopathy+patients+with+nebulin+deficiency.">Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency.</a> Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).</li><li>Witt, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+regulates+thin+filament+length,+contractility,+and+Z-disk+structure+in+vivo.">Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo.</a> EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).</li><li>Garton, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+automated+computational+method+for+skeletal+muscle+fibre+morphometry+analysis.">Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis.</a> Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).</li><li>Kim, Y. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il muscolo scheletrico è un tessuto strutturalmente e funzionalmente unico, e sono necessari per consentire la valutazione ottimale dei parametri strutturali e funzionali procedure di preparazione specializzati. Mentre una varietà di tessuti sono comunemente congelato per studi patologici in contesti clinici e di ricerca, protocolli di congelamento per tessuti non muscolari generalmente comportano la totale immersione del tessuto in OCT prima del congelamento. Come mostrato in figura 3, tale protocollo è inadatto per la valutazione patologica del muscolo scheletrico e tuttavia è abbastanza simile al protocollo qui descritto che ciò è un errore comunemente incontrati. L&#39;obiettivo di questo documento è quello di fornire un protocollo semplice per la corretta gestione del muscolo per evitare problemi come questo. Consigli è stato compilato sulla corretta manipolazione di muscoli per off-site fisiologico e studi cellulari nel tentativo di agevolare l&#39;acquisizione di dati di alta qualità dai laboratori centrali esterne nei casi wheri studi sul posto non sono preferibili o possibile. Come notato in questo protocollo, elementi che sono assolutamente essenziale per il corretto trattamento dei muscoli per studi patologici includono minimizzare il contenuto di acqua del tessuto, diminuendo la temperatura alla quale il muscolo è congelato, e aumentando la velocità con cui si ottiene il congelamento. Un&#39;eccessiva umidità all&#39;interno del tessuto o eccessiva lentezza del processo di congelamento (prodotto da temperature insufficienti o dalla mancanza di un contatto diretto tra l&#39;agente e il congelamento del tessuto, come si incontra con azoto liquido) porterà a congelamento artefatti che possono alterare analisi patologica. Come Ottobre fornisce un&#39;ulteriore fonte di umidità dei tessuti, molti laboratori usano altri adesivi come gomma adragante come substrato incorporamento. Anche nei casi in cui il congelamento viene eseguita in modo appropriato, occorre prestare attenzione per evitare di esemplari successivamente accidentalmente scongelamento attraverso il contatto con contenitori o strumenti RT.Così, un processo di congelamento successo richiede un grado di pianificazione che comprende un pre-raffreddamento di tutti gli strumenti e contenitori da utilizzare. Quando artefatti congelamento si incontrano, c&#39;è un metodo qui descritto per il recupero del tessuto che è sufficiente per la maggior parte delle valutazioni patologiche. Tuttavia, questo ciclo di congelamento / scongelamento non offre perfetta istologia e ha il potenziale di compromettere altri studi molecolari o enzimatica del tessuto (oltre al tempo necessario per ri-congelare il tessuto), quindi utilizzando appropriate tecniche di congelamento iniziale è di gran lunga preferibile . Nei casi in cui il congelamento manufatto viene rilevata sul tessuto pre-congelato, tuttavia, la tecnica qui descritta può essere estremamente utile. Fissazione e lavorazione di tessuti per EM in grado di offrire sfide tecniche specifiche che richiedono una pianificazione prima della raccolta del tessuto. L&#39;errore più comune quando il prelievo dei campioni per EM prevede l&#39;utilizzo di frammenti di tessuto che sono troppo spessi per glutaraldehyde di penetrare. Come glutaraldeide penetra solo circa 0,1 cm nel tessuto muscolare da una superficie data, la cura dovrebbe essere presa per assicurare che una dimensione dei campioni EM è più spesso di 0,2 centimetri. Inoltre, come EM è un ottimo mezzo per valutare direttamente l&#39;apparato contrattile, alcuni ricercatori hanno sviluppato strategie di pre-tensione o pre-stiramento del muscolo prima della fissazione per consentire la misurazione di elementi contrattili ad una tensione fisiologicamente rilevanti. Non esiste un protocollo standard per il pre-tensionamento, ma due strategie sono brevemente descritte in questo protocollo. Va notato che i tentativi di pre-tensionamento del muscolo può produrre risultati imprevedibili se non sono fatte in modo molto specifico, e può essere preferibile fissare muscoli nello stato lasco per evitare modifiche artefatti di lunghezza sarcomero attraverso un non-standard procedura di pre-tensionamento 8,9. Per i muscoli in cui tali misure specifiche non sono necessarie (compresa la maggior parte biopsies eseguite per scopi clinici), sforzi di pre-tensionamento del muscolo non sono generalmente realizzati, e l&#39;effetto principale sulla morfologia muscolare è una spaziatura non uniforme dei sarcomeri nel muscolo. Questo documento rappresenta il primo di una serie di fornire SOP per l&#39;esecuzione di prove in campo malattia muscolare congenita, e rappresenta gli sforzi di oltre 20 esperti del settore malattia muscolare congenita che abitualmente esegue cellulare, molecolare, funzionale, fisiologico e la ricerca patologica. Una gamma di POS pubblicati sarà reso disponibile nel corso del prossimo anno, ed i protocolli necessari e opportuni formati di pubblicazione per ciascuna sono stati discussi in un muscolo congenita malattia Consortium Workshop tenutosi nel mese di aprile del 2013 a Washington DC L&#39;obiettivo di questo sforzo SOP è quello di fornire una tabella di marcia per la sperimentazione necessaria e l&#39;analisi di campioni nel campo malattia muscolare congenita a 1) uniformare le pratiche e gli endpoint utilizzati nel nostro campo come male come possibile e 2) fornire istruzioni su pratiche standard per i nuovi ricercatori nel nostro campo. Noi crediamo che queste risorse potranno facilitare l&#39;ingresso di nuovi ricercatori nel nostro campo sotto-studiato e migliorare la portata della ricerca che possono essere eseguite così. Inoltre, una standardizzazione delle pratiche sarà estremamente utile per confrontare i dati tra gli studi e per identificare gli endpoint per la pianificazione e l&#39;esecuzione di studi preclinici e clinici. Sebbene l&#39;obiettivo principale di questo articolo è correlato al congelamento e preparazione di tessuti adatti per una varietà di studi, il gruppo di collaborazione anche discusso gli endpoint utili per l&#39;analisi patologica dei campioni muscolari. Allo stato attuale, non vi è consenso ufficiale l&#39;approccio da adottare quando si esegue l&#39;analisi patologica, e una varietà di diversi studi vengono eseguiti a relazionarsi nuove scoperte a pubblicazioni precedenti per ciascuna malattia. Così, abbiamo pensato che sarebbe utileproporre alcune linee guida generali per la programmazione degli endpoint patologici nel muscolo patologia caratterizzazione. Prima di quantificare la patologia in uno studio, considerevole pensiero dovrebbe essere messo in 1) il metodo di misurazione della dimensione delle fibre, 2) la possibilità di anomalie fibra-specifico tipo o gli effetti del trattamento, 3) la possibilità di anomalie o effetti che sono limitati a singoli muscoli, e 4) una strategia per quantificare patologici che sono caratteristici per la malattia in studio. Dimensioni delle fibre è un endpoint necessario per la maggior parte degli studi, e purtroppo ci è ampia variazione nel modo in cui viene quantificato. Molti studi riportano questi risultati con i metodi di quantificazione automatici forniti dal software di imaging proprietario, ma molti di questi programmi prendono scorciatoie (come nell&#39;ipotesi in cui le fibre sono cerchi o ellissi) che possono rendere queste misurazioni automatizzate imprecisa. E &#39;necessario capire come questi programmi automatici fanno le loro misurazioni brima di avere fiducia nelle misure e lo incoraggiano i ricercatori a comprendere questi dettagli nei metodi di carta. Inoltre, la misurazione specifico utilizzato per indicare la dimensione delle fibre è estremamente variabile, e alcune misure sono preferibili ad altri 10,11. Una misura comunemente usata di dimensioni delle fibre è l&#39;area della sezione trasversale di fibra (CSA), in particolare perché gli investigatori effettuano studi fisiologici standardizzare i risultati di misurazioni CSA ottenuti utilizzando i loro strumenti. Purtroppo, mentre misure CSA possono riflettere accuratamente dimensioni delle fibre in sezioni trasversali perfette, sono ampiamente in funzione dell&#39;orientamento fibra (nella misura in cui le fibre longitudinali o obliquamente sezionata avranno misurazioni artificialmente elevati CSA) e sono risultati così non ideali per dimensioni delle fibre. Una misura preferibile di dimensioni delle fibre che è meno dipendente fibra sezione trasversale è il diametro minimo di Feret (diametro MinFeret), che è la misura del secoloe diametro minore nella cellula muscolare 12. Questa misura è solo leggermente in funzione dell&#39;orientamento della fibra ed è generalmente la clinica oro standard per la misura della fibra, e gli investigatori sono incoraggiati a muoversi verso l&#39;uso di questa tecnica. Queste misure possono spesso essere effettuate utilizzando lo stesso software che genera le misurazioni CSA 13, ed è anche semplice da misurare manualmente. Per quanto riguarda la valutazione dei dati patologici secondo tipo di fibra, muscolo specifico, e nel contesto dei risultati patologici relative alla patologia specifica, questi sono argomenti meno controversi che dovrebbe essere considerato durante la progettazione di uno studio. Tipo di fibra può essere valutata mediante colorazione immunoistochimica o ATPasi, ma è utile considerare che i muscoli specifici e specie animali hanno specifiche miscele di tali tipi di fibre (che richiedono quindi diverse aspettative e strategie di sperimentazione). Muscle coinvolgimento patologico specifico o l&#39;efficacia del trattamentopuò verificarsi, e il peso totale del muscolo rispetto ai controlli può essere utilizzato per identificare il grado di eterogeneità della malattia prima di decidere muscoli per valutare patologicamente. Infine, è noto che molte malattie muscolari sono associati ad alterazioni patologiche specifiche (quali steli in nemaline miopatia nemaline 14,15), e così è anche utile considerare se queste anomalie si trovano in un muscolo-fibra-tipo o distribuzione specifico quando si esegue l&#39;analisi 16,17. Nel complesso, mentre noi non proponiamo una serie inflessibile di standard per la valutazione del muscolo, crediamo che tali questioni dovrebbero essere considerati prima della realizzazione di studi patologici in qualsiasi malattia del muscolo scheletrico.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

Il muscolo scheletrico è un tessuto unico per la sua struttura e funzione, che richiede protocolli per la raccolta dei tessuti per ottenere risultati ottimali da valutazioni funzionali, cellulari, molecolari, e patologici. A causa della sottigliezza di alcune alterazioni patologiche viste nei disturbi muscolari congenite e il potenziale di fissazione di interferire con il riconoscimento di queste caratteristiche, la valutazione patologica del muscolo congelato è preferibile muscolare fisso nel valutare muscolo scheletrico per malattia muscolare congenita. Inoltre, il potenziale di produrre gravi artefatti congelamento nel muscolo richiede precauzioni specifiche per la congelazione muscolo scheletrico per l&#39;esame istologico che non vengono comunemente utilizzati per la congelazione altri tessuti. Questo manoscritto descrive un protocollo per congelamento rapido del muscolo scheletrico utilizzando isopentano (2-metilbutano) raffreddato con azoto liquido per mantenere ottimale la morfologia del muscolo scheletrico. Questa procedura è efficace anche per freezing tessuto destinati a studi di espressione genetica o proteine. Inoltre, abbiamo integrato il nostro protocollo di congelamento in un procedimento più ampio che descrive anche i metodi preferiti per il triage a breve termine di tessuto per (1) sola fibra studi funzionali e (2) coltura cellulare dei mioblasti, con un focus sullo sforzo minimo necessario per raccogliere tessuti e trasportarlo in ricerca o di riferimento laboratori specializzati per completare questi studi. Nel complesso, questo manoscritto fornisce una descrizione di come tessuto fresco può essere efficacemente distribuito per una varietà di studi fenotipici e quindi fornisce procedure operative standard (POS) per studi patologici legati alla malattia muscolare congenita.

Per fornire esempi di manufatti visto con il congelamento improprio, diversi quadricipiti muscoli di topo sono stati congelati utilizzando diverse tecniche (Figura 3) per replicare gli errori comunemente riscontrati. Come mostrato in Figura 3A, muscolo scheletrico opportunamente congelato mostra una stretta apposizione di miofibre al tessuto circostante (solitamente altre fibre muscolari, ma a volte lo spazio endomysial tra miofibre è riempito con fibrosi o cellule infiammatorie in una varietà di malattie o processi pregiudizio) e un compartimento citoplasmatico chiaramente visibile. Per l&#39;analisi patologica, la possibilità di visualizzare lo spazio intracellulare è spesso più importante del vano endomisio, come di solito è fondamentale individuare chiaramente la presenza di cambiamenti degenerativi, cambiamenti rigenerativi o altri reperti patognomonici (nuclei centrali, inclusioni intracellulari) in questa spazio. Pertanto, la presenza di cristalli di ghiaccio nel compartimento intracellulare rappresenta amproblema RINCIPALI nella valutazione patologica del muscolo. La corretta congelamento del tessuto muscolare richiede entrambe le temperature sufficientemente fredde e una velocità sufficiente di congelamento per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio. Anche quando contabilità per entrambi i fattori, notevole manufatto congelamento può ancora verificarsi a causa di eccessiva umidità all&#39;interno del tessuto muscolare. Questo problema è più comunemente riscontrato nel tessuto muscolare precedentemente immerso in soluzione fisiologica e sufficientemente secche o quando il muscolo è stata in contatto diretto con il mezzo di montaggio Ott sito di sezionamento (Figura 3B, 3E). Mentre qualche contatto con ottobre è di solito inevitabile come conseguenza del processo di montaggio, dovrebbe essere fatto ogni sforzo per evitare il contatto tra le aree che saranno istologicamente valutato e ottobre utilizzato per il montaggio. Al contrario, i campioni congelati con un -80 ° C freezer (Figura 3C) e l&#39;azoto liquido (Figura 3D) forniscono esempios del manufatto congelamento che è prodotto dalla temperatura non ottimale o velocità di congelamento. Il processo di congelamento lento incontrato mettendo tessuto in un -80 ° C freezer fornisce un esempio estremo di congelamento manufatto. Quando si utilizza l&#39;azoto liquido, il problema principale è che il contatto tra azoto liquido e il tessuto provoca una guaina di azoto gassoso per formare all&#39;interfaccia tessuto-liquido, e questa interfaccia gassoso non è sufficientemente fredda per produrre muscolare rapida congelamento 1. Questo può produrre artefatti significativi congelamento vicino alla superficie del campione, ma zone interne del campione hanno maggiori probabilità di flash freeze ad un tasso adeguato e può essere interamente risparmiata di congelamento manufatto. Mentre la semplice immersione del tessuto muscolare in azoto liquido non è neanche lontanamente utile come il processo isopentano congelamento, può essere utile per il congelamento di campioni di muscolo di grandi dimensioni in situazioni in cui isopentano non è disponibile (come ad esempio i campioni autoptici clinici a istituzionilaboratori di patologia muscolare clinici out). Risultati utilizzando questa strategia sono generalmente migliori quando si utilizzano grandi porzioni di tessuto (&gt; 2 cm di varie dimensioni). Mentre evitare manufatto congelamento fornisce risultati istologici ottimali, è stato anche sviluppato una tecnica (e descritto) che inverte sostanzialmente congelamento artefatti consentire la valutazione del tessuto impropriamente congelato. Tessuto che viene impropriamente congelato (Figura 3E) può essere scongelato e ricongelato in condizioni strettamente controllate (Figura 3F) per consentire la ridistribuzione dell&#39;acqua all&#39;interno delle fibre, e il grado di conservazione morfologica che è ottenibile può essere eccellente. Nella nostra esperienza, questo processo conserva la morfologia intracellulare del tessuto in misura notevole, ma spesso produce una separazione artefatta di fibre all&#39;interno dello spazio dell&#39;endomisio. Come molti endpoint patologiche si trovano nello spazio intracellulare e quellilo spazio endomisio sono meglio visualizzato con colorazioni speciali (sia per evidenziare fibrosi o per identificare altri tipi di cellule), questi cambiamenti artefatti difficilmente compromettere veramente la valutazione patologica del muscolo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Triage di tessuto per studi strutturali, funzionali e cellulari del muscolo scheletrico. Seconda dei tipi di studi desiderati, tessuto muscolare scheletrico raccolti vengono elaborati in una varietà di modi per ottenere risultati ottimali. I protocolli descritti in questo documento descrivono i metodi per la valutazione degli o il trattamento di campioni di muscolo scheletrico per gli studi off-site per ottimizzare i risultati ottenibili dalle strutture centrali di esperti. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Esempi di apparecchiature utilizzate per congelamento muscolare. Come descritto nel protocollo, congelamento ottimale muscolare richiede immersione del tessuto muscolare in isopentano che si trova alla temperatura di congelamento. Un mezzo sicuro ed efficiente di ottenere isopentano ghiacciata prevede l&#39;utilizzo di un contenitore metallico per la isopentano che viene raffreddato in un Dewar contenente azoto liquido circostante. Come è spesso conveniente avere entrambe le mani libere, è possibile utilizzare un tutore come un anello di supporto (A) per ospitare il contenitore isopentano in azoto liquido evitando la miscela dei due liquidi. In alternativa, il contenitore potrebbe anche essere mantenuta l&#39;azoto liquido manualmente (B). In entrambi i casi, il tessuto non deve essere collocato in isopentano fino alla isopentano è visibilmente gelata sul fondo del contenitore (solitamente ciottoli bianchi opachi) e quindi deve essere immerso per 10-20 secondi per consentire il completo congelamento. Isopentane a temperatura di congelamento produce minimal &quot;nebbia&quot;, (cioè, la temperatura è insufficiente se considerevole presenza di nebbia). Una volta che il tessuto è congelato, metterlo direttamente in contenitori pre-raffreddati (e poi direttamente in un dispositivo di raffreddamento o freezer) per evitare lo scongelamento accidentale dopo il congelamento. Muscolare (C) opportunamente montato congelato dovrebbe avere la maggior parte del tessuto muscolare che sporge da una base di congelati ottobre <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Esempi di congelamento artefatto, e di un efficace scongelamento / ricongelamento. Immagini rappresentative della (A) dei muscoli opportunamente isopentano congelati, (B) il muscolo congelate in modo adeguato in isopentano, ma mentre in contatto con il mezzo di montaggio ottobre, (C) del muscolo congelato in un congelatore -80 ° C, e (D </strong&gt;) muscolo congelato in azoto liquido, i quali visualizzare vari gradi di congelamento manufatto. Come mostrato in (B), l&#39;alto contenuto di liquido di ottobre produce significativi artefatto congelamento nel muscolo che è in contatto con esso, deve essere utilizzato in modo che solo la quantità minima di ottobre necessaria per il montaggio, e il muscolo per la valutazione istologica dovrebbe essere &quot;permanente out &quot;dalla sua superficie. La lentezza del processo di congelamento utilizzando un (C) -80 ° C o congelatore (D) azoto liquido (rispetto alla velocità di congelamento in isopentano ghiaccio freddo) può portare alla produzione di artefatti significativi congelamento. Pannelli E e F spettacolo muscolo stesso campione che era (E) inizialmente subottimale congelati (a causa di un contatto eccessivo con OCT) e poi (F) scongelati e ricongelati utilizzando la tecnica qui descritta. Mentre si può osservare una certa separazione artefatta tra le fibre nel campione ricongelati, l&#39;i miglioramenton la morfologia intracellulare delle fibre muscolari è evidente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Tissue Triage e Freezer per i modelli di malattia muscolare scheletrico

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.8K Views.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Ricerca

Biologia

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...