Il muscolo scheletrico funge da importante serbatoio di nitrato che, dopo la sua conversione in nitrito, funge da fonte di NO durante l'esercizio. Qui presentiamo la metodologia per misurare questi ioni nei muscoli e in altri tessuti. Per iniziare, preparare la soluzione di conservazione o arresto dei nitrati combinando 890 millimolari di ferricianuro di potassio e 118 millimolari di n-metilmaleimmide in acqua distillata, assicurandosi che nessun cristallo rimanga in soluzione, quindi aggiungere un tensioattivo non ionico in un rapporto da 1 a 9 e mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
Diluire la soluzione di arresto in un rapporto da 1 a 9 con acqua distillata e aggiungere la soluzione di arresto diluita al tubo di omogeneizzazione. Quindi, scongelare il precedente tessuto muscolare di ratto isolato e congelato sul ghiaccio. Una volta che il tessuto si è scongelato, rimuovere il grasso rimanente e il tessuto connettivo dal muscolo scheletrico.
Tagliare pezzi del muscolo scheletrico e asciugarli su una garza per asciugarli. Pesare la quantità appropriata di tessuto muscolare scheletrico, quindi posizionare il tessuto pre-peso nei tubi di omogeneizzazione contenenti la soluzione di arresto. Per l'omogeneizzazione in un omogeneizzatore rotante, posizionare nella macchina il tubo di tipo M contenente il muscolo scheletrico prepesato e la soluzione di arresto pre-misurata.
Omogeneizzare ogni campione due volte e, dopo ogni omogeneizzazione, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio per 5 minuti per raffreddare. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare brevemente il tubo. Rimettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di metanolo prima di vorticare Per 15 secondi.
Omogeneizzare nuovamente il campione e incubarlo su ghiaccio per 30 minuti, quindi centrifugare il campione, aspirare il surnatante e procedere alla misurazione dei livelli di nitriti e nitrati. Per l'omogeneizzazione delle perline, posizionare il tessuto muscolare scheletrico in un tubo contenente perline e omogeneizzare due volte per 45 secondi alla massima velocità disponibile sullo strumento. Dopo ogni omogeneizzazione, posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio per 5 minuti per raffreddare, quindi centrifugare il tubo, riposizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di metanolo prima di vorticare Per 15 secondi.
Omogeneizzare nuovamente il campione per 45 secondi, quindi incubarlo su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare il campione, aspirare il surnatante e procedere alla misurazione dei livelli di nitriti e nitrati. Per l'omogeneizzazione a base di polverizzatore, preparare provette contenenti la soluzione di arresto diluita, quindi pesare e registrare il peso dei tubi.
Dopo aver raffreddato lo strumento polverizzatore su ghiaccio secco per 30 minuti, utilizzando una pinzetta raffreddata in azoto liquido, trasferire il campione di tessuto pre-pesato al polverizzatore, quindi aggiungere una piccola quantità di azoto liquido per garantire che il tessuto sia alla temperatura dell'azoto liquido. Dopo che il 95% dell'azoto liquido si è vaporizzato, posizionare lo strumento di frantumazione sopra il tessuto e premere con decisione per sentire la frantumazione del campione, quindi usando un mazzuolo, colpire lo strumento di frantumazione da 3 a 5 volte. Quando l'intero campione è stato polverizzato, utilizzando un cucchiaio raffreddato ad azoto liquido e una pinzetta, trasferire direttamente il tessuto frantumato nel tubo prepesato contenente la soluzione di arresto diluita.
Quindi, vortice il tubo per 15 secondi, quindi aprire il tubo per verificare la presenza di eventuali tessuti bloccati nel coperchio. Se c'è, prova a sloggiarlo, quindi vortice di nuovo. Centrifugare brevemente il campione per 2 o 3 secondi.
Pesare nuovamente il tubo e calcolare il peso del tessuto deducendo il peso originale del tubo da questo nuovo peso. Posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere un volume appropriato di metanolo al tubo e vortice accuratamente il tubo per 15 secondi prima di incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti, quindi centrifugare il campione, aspirare il surnatante e procedere alla misurazione dei livelli di nitriti e nitrati.
I livelli di nitrati e gli omogenati muscolari scheletrici di ratto preparati utilizzando un omogeneizzatore rotante, un omogeneizzatore di perline e un polverizzatore erano simili. È interessante notare che, per i livelli di nitriti, il campione omogenato preparato da un polverizzatore ha mostrato il valore più alto, che era statisticamente diverso dagli altri due valori del campione. Un confronto dei livelli di nitriti e nitrati negli omogenati glutei preparati da 20, 50 e 200 milligrammi di tessuto utilizzando un omogeneizzatore di perline ha mostrato che né i livelli di nitrati né quelli di nitriti erano significativamente diversi tra le dimensioni del campione muscolare.
Il confronto dei livelli di nitrati in diversi tessuti muscolari scheletrici delle gambe dei roditori ha rivelato che il muscolo gluteo aveva livelli di nitrati circa due volte più alti rispetto agli altri tre tessuti muscolari. Tuttavia, queste differenze non hanno raggiunto la significatività statistica. Analogamente ai livelli di nitrati, anche la concentrazione di nitrati nel muscolo gluteo era superiore a quella negli altri tre tessuti muscolari ed era significativamente superiore a quella del campione gastrocnemio.
Il nostro metodo è relativamente semplice e adatto a piccoli campioni, preservando nitrati e nitriti durante la preparazione del campione.
