Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

1 16S rRNA gene Amplicon Biblioteca Preparazione con il metodo Fusion <ol><li> Scongelare i primer (forward, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; inversa, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; grassetto: Ion Torrent adattatori specifici; corsivo: tasto sequenza per la calibrazione di intensità di segnale all&#39;inizio della corsa di sequenziamento; carattere regolare: primer specifici template; X ... X: 10 bp del codice a barre, vedere la Tabella 1 per alcune sequenze di codici a barre), il master mix 2x HotStartTaq Plus e dei campioni. Mescolare accuratamente prima dell&#39;uso, ad eccezione del master mix che deve essere miscelato con delicatezza. </li><li> Preparare una miscela di PCR (20 reazioni microlitri) con 0,5 mM del primer reverse, 0,4 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA) e 1x HotStartTaq Inoltre mix master. Aggiungere 18,5 ml della master mix all&#39;etubo ach PCR. </li><li> Aggiungere un primer forward (0,5 ml a 20 mm) con un codice a barre diverso per ciascuno dei campioni che saranno sequenziati insieme. Aggiungere 1 ml di campione (1-10 ng / mL) al tubo di PCR. </li><li> Porre i tubi in una macchina PCR ed eseguire il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 ° C per 5 min; 25 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 45 sec; allungamento finale a 72 ° C per 10 min. I prodotti di PCR possono essere conservati a 4 ° CO / N o congelati fino al momento dell&#39;utilizzo. </li></ol> 2 Amplicon Purificazione, quantificazione e Pooling <ol><li> Preparare un gel di agarosio al 2% utilizzando più grandi pettini disponibili. Aggiungere 5 ml di gel loading dye 6x alla reazione e carico sul gel, separando ciascun campione da un pozzo vuoto. Attivare il gel a 70 V per 50 min. </li><li> Scatta una foto del gel e tagliare le bande (dimensioni previste circa 250 bp: 190 bp prodotto più di 63 adattatori bp e codici a barre) utilizzando un bisturi pulito. </li><li&gt; Pesare le bande asportati e procedere con l&#39;estrazione gel e purificazione dei prodotti di PCR (con, ad esempio, kit QIAquick Gel Extraction). </li><li> Quantificare ciascun prodotto PCR con PicoGreen e fare diluizioni per ottenere una soluzione madre a 5 x 10 9 molecole / ml (circa 1 ng / ml). Se alcuni campioni mostrano minore amplificazione, regolare le diluizioni ad una concentrazione più bassa, tenendo presente che la concentrazione più bassa adatto per le procedure successive è 1,57 x 10 7 molecole / ml (26 pM). </li><li> Pool 10 ml di ciascun prodotto di PCR diluito per ottenere una piscina equimolare di campioni. Preparare una piscina separata per ciascuna della corsa sequenza programmata. I prodotti della PCR in pool possono essere conservati nel congelatore fino al momento dell&#39;utilizzo. </li></ol> 3. Emulsione PCR e sequenziamento <ol><li> Eseguire emulsione PCR: <ol><li> Diluire i prodotti di PCR in pool a 26 pM in un volume di 25 microlitri. Scongelare i reagenti provenienti da un kit modello Ion PGM. </li><li> Preparare la miscela di emulsione PCR (reagenti forniti nel kit) in una cappa PCR e aggiungere i prodotti di PCR in pool e le particelle sfera (in dotazione) in panchina. Mescolare accuratamente e inserire il composto in una cartuccia filtrante e top accuratamente con olio emulsione (in dotazione). </li><li> Lentamente invertire la cartuccia del filtro e carico sul emulsione automatizzato PCR apparecchi (ad esempio, Ion Uno strumento Touch 2). Selezionare il programma appropriato e avviare la procedura. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;emulsione automatizzato PCR è stata completata, rimuovere il surnatante dai tubi di raccolta e recuperare le particelle sfera sul fondo delle provette. Risospendere le sfere in 100 ml di soluzione di lavaggio (fornito nel kit) e prendere un aliquota di 2,0 microlitri per la libreria quantificazione. </li><li> Eseguire la quantificazione biblioteca. <ol><li> Mescolare 100 ml di tampone PESS (150 mM NaCl, 10mM NaPO 4, 1mM Na 2 -EDTA) con 2 ml di adattatore B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG AGG GAT-3 &#39;) della sonda e 2 ml di Adapter A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT-3 CAG CCC TGC GTG TCT CCG ACT&#39; sonda). Aggiungere 52 ml di questa miscela per l&#39;aliquota di 2,0 microlitri preso nel passo 3.2 e aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio (dal kit modello) per i restanti 52 microlitri come un vuoto per la quantificazione. </li><li> Incubare a 95 ° C per 2 min, quindi a 37 ° C per 2 min. Trasferire le miscele in provette da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di tampone TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% Triton X-100, pH 8.0), mescolare e centrifugare a 15.500 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lasciare 20 microlitri in ciascun tubo. Ripetere questa procedura di lavaggio due volte. </li><li> Aggiungere 180 ml di tampone TEX, risospendere le particelle di pellet e trasferirli in provette 500 microlitri Qubit. </li><li> Misurare la fluorescenza per FAM e Cy5 utilizzando un apparato Qubit e calcolare il rapporto delle sfere positive utilizzando la calcolatrice disponibile sul sito web Ion Comunità. </li></ol></li><li> Arricchisci il resto delle particelle sfera di sfere positivi (contenenti DNA amplificato) utilizzando un sistema di arricchimento automatico (ad esempio, Ion One Touch Enrichment System). <ol><li> Reagenti Dispensare nei pozzetti della strip 8-ben fornito: Bene 1: particelle sfera dal punto 3.2; Bene 2: pre-lavato perline MyOne streptavidina C1 (13 microlitri); Beh 3, 4 e 5: soluzione di lavaggio (fornito nel kit modello); Ben 6: vuota; Ben 7: fondere-off soluzione (NaOH 125 mM, 0,1% Tween 20); Ben 8: vuoto. </li><li> Installare un suggerimento sul braccio pipettaggio e un tubo di 0,2 ml per la raccolta del campione. Avviare lo strumento. Alla fine l&#39;arricchimento, aggiungere 10 ml di soluzione neutralizzante (fornito). Le sfere arricchite possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 15 giorni. </li></ol></li><li> Inizializzare lo strumento sequenza: <ol><li> Collegare allo strumento sequenziamento e preparare un piano di corsa di sequenziamento, specificando i dettagli della corsa sequenziamento. </li><li> Installarel la soluzione di lavaggio # 2 (fornita nel kit di sequenziamento Ion PGM), la soluzione di lavaggio # 1 (350 ml NaOH 100 mM) e la soluzione tampone di auto-pH (in dotazione). </li><li> Avviare la procedura di inizializzazione e quando viene richiesto aggiungere il dATP, dGTP dCTP e dTTP nucleotidi (in dotazione) nelle rispettive provette da 50 ml. Avvitare i tubi sulla macchina per il sequenziamento e continuare la procedura di inizializzazione. Quando l&#39;inizializzazione è completata, avvia immediatamente la procedura di esecuzione. </li></ol></li><li> Preparare i campioni per il sequenziamento e caricare il chip: <ol><li> Raccogliere le sfere arricchite dal punto 3.4 alla parte inferiore del tubo per centrifugazione a 15.500 xg per 1,5 min. Rimuovere il surnatante lasciando esattamente 3 ml. </li><li> Aggiungere 3 ml di sequenziamento Primer (fornito nel kit di sequenziamento), mescolare accuratamente pipettando su e giù per risospendere le particelle. Incubare a 95 ° C per 2 min, quindi a 37 ° C per 2 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di polimerasi (in dotazione), mescolare bene e incubmangiato a temperatura ambiente per 5 min. Procedere per caricare la miscela di enzimi sfera sul chip sequenziamento entro 30 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, caricare il chip sequenza sul sequencer ed eseguire un controllo di qualità chip. Rimuovere il liquido dal chip per centrifugazione e caricare il campione nel chip lentamente pipeting premuto il mix enzima-sfera (7 ml) ed evitando l&#39;introduzione di bolle nel chip. </li><li> Centrifugare il chip per tre volte per 1 minuto in una microcentrifuga. Modificare l&#39;orientamento del chip ad ogni centrifugazione e mescolare pipettando su e giù tra ogni esecuzione. </li><li> Caricare il circuito integrato nello strumento e iniziare la corsa. </li></ol></li></ol> Analisi 4. base dei dati di sequenza <ol><li> Connettersi al server di dati di sequenziamento e scaricare il file FASTQ. Creare un file delimitato da tabulazioni &quot;oligo&quot; contenente le informazioni di fondo e di codici a barre (vedi esempio nella tabella 1). Scaricare i file di riferimento Greengenes dal Motsito Hur ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Avviare Mothur ed eseguire analisi: <ol><li> Convertire il file FASTQ ad un FASTA e un file di qualità utilizzando il seguente comando: fastq.info (FASTQ = test.fastq) </li><li> Determinare l&#39;appartenenza al gruppo di ogni sequenza e tagliare le sequenze utilizzando il seguente comando: trim.seqs (FASTA = test.fasta, oligo = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minLength = 150, keepforward = T) </li><li> Le varie opzioni possono essere modificati secondo la severità desiderato </li><li> Classificare le sequenze del greengenes tassonomia utilizzando il seguente comando: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, method = wang, gruppo = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, tassonomia = gg_99_otus.tax, cutoff = 50) </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Il metodo presentato qui è semplice e poco costoso, e dovrebbe consentire a molti laboratori di accedere al potere di sequenziamento metagenomica. Anche se varia a seconda della piattaforma di sequenziamento utilizzate, una volta che le librerie sono costruite è richiesto molto poco hands-on tempo, con la maggior parte del processo di essere automatizzate. Per la piattaforma di sequenziamento qui utilizzato (Ion Torrent PGM), la procedura completa può essere eseguita in due giorni di lavoro. Al momento della scrittura (settembre 2013), i costi dei reagenti relativi all&#39;esempio sopra descritto sono stati i seguenti: amplificazione PCR di 36 campioni: $ 25, purificazione gel e DNA PicoGreen quantificazione di 36 campioni: $ 125, emulsione PCR per un campione ampliconi pool : $ 150 e reagenti di sequenziamento: $ 250, per un totale di $ 550 o $ 15 per campione o $ 0,0015 lettura qualità-filtrato. Questo prezzo non comprende contratto di strumento di servizio, gli ammortamenti strumento, stipendio tecnico e l&#39;utilizzo dello spazio in laboratorio. tenda &quot;&gt; Uno dei passi più importanti è quello di riunire tutti i prodotti in un rapporto equimolare, al fine di recuperare numero simile di letture per ciascuno dei campioni. PicoGreen quantificazione è stato utilizzato qui, ma altri metodi potrebbe essere adatto, anche se meno preciso (ad esempio, la quantificazione UV, quantificazione a base di gel). Anche facendo la quantificazione più accurata e messa in comune, vi è una certa variabilità nel numero di letture per campione, e nel tipico run indicato nella tabella 2, che varia da 4.380 a 32.750 legge, con una media di 10.338 letture. Se l&#39;elaborazione di gran numero di campioni (più di 40-50), singola colonna di purificazione gel può essere sostituito da purificazione gel in lamiera o di purificazione utilizzando perline con un taglio rigoroso dimensioni (ad esempio, AMPure perline) . Ad oggi, la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione più utilizzato per il gene 16S rRNA è 454. tecnologia di sequenziamento La Ion Torrent utilizzato in questo protocollo è concettualmente molto similea 454 e le due tecnologie sono soggette allo stesso tipo di errori di sequenziamento. Non sorprendentemente, è stato dimostrato che il sequenziamento Ion Torrent portato risultati di sequenziamento molto simili a 454 sequenziamento 10. Recentemente, molti ricercatori hanno esplorato l&#39;uso della tecnologia Illumina per 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento 18,19. In ogni caso, sarebbe facile per adattare l&#39;attuale protocollo per altri sequencer da banco come l&#39;Illumina MiSeq o la 454 GS Junior cambiando le sequenze dei primer fusione per abbinare gli adattatori e codici a barre necessari per queste tecnologie di sequenziamento, come nel metodo descritto recentemente per il Illumina MiSeq 19. In alternativa, i ricercatori potrebbero seguire i passi 1 e 2 del protocollo qui descritto e inviare i ampliconi pool a un centro di sequenziamento, dove sarebbero stati eseguiti l&#39;emulsione PCR e sequenziamento. Il gene 16S rRNA letture sono stati tagliati e classificati utilizzando Mothur, ma molte altre analisi può essere eseguita su16S rRNA ampliconi del gene. Ad esempio, la diversità beta può essere valutata calcolando le distanze Unifrac tra ogni coppia campione utilizzando la procedura descritta in <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Alpha indici di diversità e il numero di unità tassonomiche operative di ciascun campione possono essere calcolati utilizzando strumenti all&#39;interno QIIME come AmpliconNoise 21 o utilizzando la procedura descritta da Huse et al. 22 e disponibili all&#39;interno Mothur. I primer usati qui amplificato le regioni variabili 3 e 4 del gene 16S rRNA, ma molte altre regioni potrebbero essere mirati. In questo studio, i geni 16S rRNA sono stati amplificati da materiale vegetale e la scelta di fondo è stata fatta per evitare l&#39;amplificazione del cloroplasto 16S rRNA gene 23,24. Vi è un&#39;ampia varietà di altri primer disponibili che variano in termini di durata del prodotto, potenza tassonomica e l&#39;utilità 25,26. Tuttavia, in tutti i casi 200-400 bp legge del gene 16S rRNA non può essere classificato in modo affidabile a livello di specie, e le analisi sono limitate al genere e livelli tassonomici più elevati. Altri geni potrebbero essere più appropriato se sono necessarie informazioni a livello di specie, come i cpn60 e rpoB geni 27,28. Future gocce drastici nel costo di sequenziamento e di aumenti nel potere di strumenti analitici potrebbero rendere fattibile sostituire 16S rRNA gene sequencing da metagenomica fucile, ma fino ad allora 16S rRNA sequenziamento del gene rimane il gold standard di microbiologia ambientale.

Sequenziamento metagenomiche è una tecnologia molto potente in quanto esso si rivolge la totalità delle informazioni genetiche contenute in un campione ambientale. Ci sono diversi gusti di sequenziamento metagenomica, tra cui shotgun sequencing, librerie di grandi inserti e amplicon sequenziamento. Amplicon sequenziamento offre il vantaggio di essere relativamente poco costoso, veloce e in grado di produrre legge da una singola regione genomica che può essere generalmente allineato. Inoltre, il flusso dei dati per il sequenziamento degli ampliconi è per lo più standardizzata. Tuttavia, poiché si basa sulla PCR, ha tutti i pregiudizi legati alla specificità incompleta, copertura incompleta e Primer polarizza 1,2, il che rende questo approccio semiquantitativo al meglio. Diverse regioni genomiche possono essere mirati per il sequenziamento degli ampliconi compresi i geni funzionali, ma le opzioni più popolari sono da utilizzare geni marcatori quali il gene 16S rRNA per generare un profilo di comunità. Tradizionalmente, 16S rRNA gene ampliconi sequencing è stata effettuata utilizzando tecniche di alta intensità di lavoro che comprendeva la clonazione in E. coli, colonia di raccolta ed estrazione plasmide seguita da Sanger sequenziamento sui plasmidi isolati, e, di conseguenza, la maggior parte degli studi analizzati meno di 100 cloni per campione. Sequenziamento di prossima generazione ha portato due importanti progressi: massiccia parallelizzazione delle reazioni di sequenziamento e, soprattutto, la separazione clonale di modelli senza la necessità di inserire frammenti di geni in un ospite. Questo ha semplificato enormemente il sequenziamento del 16S rRNA ampliconi del gene, che ora è tornato come una caratteristica di routine di molti studi di microbiologia ambientale, risultando in un &quot;rinascimento&quot; per il 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento 3. Dal momento che l&#39;avvento di Roche 454 sequenziamento nel 2005 4, molte altre tecnologie di sequenziamento di prossima generazione sono apparsi sul mercato (ad esempio, Illumina, Solido, PacBio). Più recentemente, l&#39;introduzione della sequenza bancors portati a piccoli laboratori la capacità di sequenziamento, una volta esclusivo di grandi centri di sequenziamento. Cinque macchine da banco sono attualmente disponibili: la 454 GS Junior, la Ion Torrent Personal Genome automatico (PGM) e Proton, e la Illumina MiSeq e NextSeq 500 Mentre tutti questi sequencer offrono meno legge per corsa e un minor numero di basi per ogni dollaro di più pieno sequencer scala, sono più flessibili, rapidi, e le loro bassi costi di acquisizione e di esecuzione li rende alla portata di piccoli laboratori accademici. Sequencer da banco sono particolarmente adatte per ampliconi, piccolo genoma e bassa complessità metagenoma sequenziamento negli studi di microbiologia ambientale, perché questo tipo di studi in genere non richiede una profondità estrema di sequenziamento. Ad esempio, è generalmente accettato che per il 16S rRNA sequenziamento del gene studia il numero di letture per campione non è di primaria importanza, come ~ 1000 recita in grado di generare gli stessi schemi come multi-milioni di letture dataset 5. Detto questo, da banco di nuova generatio<html> n sequencer ancora generano grandi quantità di dati di sequenza, con rese massime di ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) e ~ 100 GBP (Illumina Successivo Seq 500), che è più che sufficiente per la maggior parte degli studi di microbiologia ambientale. Sequenziamento di prossima generazione di ampliconi 16S rRNA utilizzando sequenziatori da banco è stata recentemente applicata a una vasta gamma di ambienti. Ad esempio, la Ion Torrent PGM è stata utilizzata per la comunità analisi di sterili di miniera di uranio che avevano particolarmente pH elevato e bassa permeabilità 6, dei sistemi di acquacoltura a ricircolo 7, di idrocarburi contaminati suoli artici 8,9, di sabbie petrolifere di estrazione sedimenti colpite e biofilm dal fiume Athabasca 10,11, della rizosfera di salici piantati in terreni contaminati 12, dei corpi umani e animali 13-16 e di digestori anaerobici 17. jove_content &quot;&gt; In questo contributo abbiamo dettaglio il nostro approccio alla sequenza 16S rRNA ampliconi del gene in casa utilizzando un banco sequencer di nuova generazione (la Ion Torrent PGM). Dopo l&#39;estrazione del DNA, i geni 16S rRNA sono amplificati utilizzando primer batteriche a livello di dominio che contengono adattatori di sequenziamento e, sequenze specifiche del campione unici (codici a barre). Gli ampliconi sono purificati, quantificati e riunite in un rapporto equimolare. I campioni aggregati vengono poi amplificati clonale in una emulsione PCR e sequenziati. sequenze risultanti vengono analizzati utilizzando strumenti bioinformatici disponibili al pubblico ( ad esempio, Mothur).

<table><tbody><tr><td>Ion 314 Chip Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482261</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482006</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Template OT2 200 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4480974</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>203646</td><td></td></tr><tr><td>Primers and probes</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BSA 20 mg/ml</td><td>Roche</td><td>10,711,454,001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr></tbody></table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

Una delle principali questioni in ecologia microbica è &quot;chi è là?&quot; Questa domanda si può rispondere utilizzando vari strumenti, ma uno degli standard d&#39;oro di lunga durata è quello di sequenziare ampliconi 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene generati da-livello di dominio PCR Le reazioni di amplificazione di DNA genomico. Tradizionalmente, questo è stato eseguito da clonazione e Sanger (elettroforesi capillare) sequenziamento degli ampliconi della PCR. L&#39;avvento di sequenziamento di prossima generazione ha enormemente semplificato e aumentato la profondità di sequenziamento per 16S rRNA sequenziamento del gene. L&#39;introduzione di sequencer da banco permette ora piccoli laboratori per svolgere il loro 16S rRNA sequenza in-casa in una questione di giorni. Qui, un approccio per 16S rRNA gene ampliconi sequenziamento utilizzando un banco di nuova generazione sequencer è dettagliata. Il DNA ambientale viene prima amplificato mediante PCR utilizzando primer che contengono le schede di sequenziamento e codici a barre. Essi vengono poi accoppiati alle particelle sferiche tramite emulsione PCR. Le particelle sono loaded su un chip monouso ed il chip viene inserito nella macchina sequenziamento dopo di che viene eseguito il sequenziamento. Le sequenze vengono recuperati in formato FASTQ, filtrati ed i codici a barre vengono utilizzati per stabilire l&#39;appartenenza campione della legge. Il filtrato e categorizzata letture vengono poi ulteriormente analizzati utilizzando gli strumenti disponibili pubblicamente. Un&#39;analisi esempio in cui la legge sono stati classificati con un algoritmo di tassonomia trovare all&#39;interno del pacchetto software Mothur è dato. Il metodo qui descritto è semplice, poco costoso e semplice e dovrebbe aiutare i laboratori più piccoli di trarre vantaggio dalla rivoluzione genomica in corso.

Dopo purificazione su gel, con 25 cicli di amplificazione PCR, i prodotti di amplificazione sono generalmente ad una concentrazione di 0,2-10,0 ng in 50 ml di acqua. Questo può variare notevolmente a seconda della concentrazione di DNA di partenza, il tipo di campione e il kit di purificazione utilizzato. Si raccomanda di mantenere il numero di cicli di PCR per il più basso possibile per evitare la formazione chimera e diminuire pregiudizi amplificazione, tenendo presente che tutti i campioni devono essere amplificati utilizzando lo stesso numero di cicli. Per ridurre al minimo il numero di policlonale letture e sfere vuote e massimizzare il numero di letture, il rapporto Qubit deve essere compresa tra 0,1 e 0,3 e la fluorescenza FAM deve essere superiore a 200 314 Utilizzo di un chip su una Ion Torrent PGM, la produzione media è di circa 0,3-0,5 M buona qualità legge dopo il filtraggio dei risultati in Mothur. Tabella 2 mostra una tipica composizione del numero di letture dopo ogni fase della procedura per una corsa contenente 36 ambienti multiplexaticampioni mentali amplificato con primer mira la regione V3-4 delle 16S e analizzati utilizzando Mothur. In Mothur, la procedura trim.seqs generare un file &quot;* .trim.fasta&quot; che contiene le sequenze che passavano i filtri di qualità e un &quot;* .scrap.fasta&quot; che contiene le sequenze che non ha superato i filtri di qualità con la ragione di reiezione in sequence header. Quando fornito con codici a barre nel file &quot;oligo&quot;, questo comando genererà anche un file &quot;* .Gruppi&quot; che contiene l&#39;appartenenza al gruppo di ogni sequenza in base alla sequenza di codice a barre. La procedura classify.seqs genera un &quot;.tax.summary&quot; che può essere aperto in Excel. Questo file contiene il riassunto della appartenenza tassonomica (in linee) per ciascuno dei campioni (nelle colonne). Questo file può essere utilizzato per analisi statistiche a valle e di visualizzare composizione della comunità a vari livelli tassonomici. Il file &quot;.taxonomy&quot; contiene il tassonomica dettagliataaffiliazione per ogni sequenza. La composizione media della comunità a livello di phylum / classe in tutti i 36 campioni è mostrato in Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Composizione media comunitaria a livello di phylum / classe per tutti i campioni. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> avanti </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> codice a barre </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Esempio di file &quot;oligo&quot; per l&#39;uso in Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # Di legge </td><td style="width:123px;"> % Del passo precedente </td><td style="width:107px;"> Avg. per campione </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Numero di pozzi </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35.070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells con perline </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30.947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perline con i modelli </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90% </td><td align="center"> 30.910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perline monoclonali </td><td align="center"> 826.805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22.967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Buona qualità legge (uscita dal sequencer) </td><td align="center"> 782.204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21.728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> (Lunghezza di 150bp min. Media. Punteggio di qualità di 20 su una finestra 50bp, min.) Passo Mothur filtri </td><td align="center"> 372.168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10.338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificato al livello di phylum in GreenGenes (il 50% della soglia di confidenza) </td><td align="center"> 342.171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificata a livello familiare in GreenGenes (il 50% della soglia di confidenza) </td><td align="center"> 316.512 </td><td align="center"> 92.50% </td><td align="center"> 8.792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificato al livello di genere in GreenGenes (il 50% della soglia di confidenza) </td><td align="center"> 289.899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> Tabella 2 Numero di letture prodotte da una corsa tipica per 36 campioni ambientali multiplexing su una Ion Torrent 314 chip.

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Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

83.2K Views.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

L&#39;analisi metagenomica di insilato

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Ricerca

Genetica

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

Assemblaggio di genoma ibrido De Novo per la generazione di genomi completi di batteri urinari utilizzando tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Biochimica

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Immunologia e infezioni

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Biologia

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...