Ringraziamo L&#39;impianto Comprehensive Cancer Center analitico Citometria Nucleo Ohio State University, in particolare Katrina Moore, per l&#39;assistenza tecnica FACS. Inoltre riconosciamo il dottor William Pu e il suo gruppo per le loro intuizioni scientifiche. Questo lavoro è stato supportato dal NIH HL091878 (JL) e il centro del cuore all&#39;ospedale dei bambini nazionale.

1 Preparazione di apparecchiature e soluzioni <ol><li> Sterilizzare gli strumenti di dissezione - forbici tessuti pregiati per estrarre i cuori adulti e 2 pinza sottile per la dissezione della regione valvolare - in autoclave in un vassoio strumento coperto. Spray utensili con il 70% di etanolo (EtOH) prima della dissezione. </li><li> Preparare tutte le soluzioni immediatamente prima dell&#39;esperimento e sterilizzare le soluzioni facendoli passare attraverso un filtro sterile 0,2 micron. Tenere soluzioni sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. <ol><li> Sterile Dissociazione Buffer (15 ml totale / campione). Combina 1,2 ml di collagenasi IV, 300 ml 2,5% tripsina e 150 microlitri di siero pulcino. Portare il volume fino a 15 ml con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). </li><li> Sterile ordinamento Buffer (12 ml totale). Combina 25 microlitri 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 12 microlitri DNasi I (RNase-free). Portare il volume fino a 12 ml con HBSS. </li><li> Cultura VEC Media. Mix gro endotelialiwth mezzi secondo le istruzioni del produttore (vedi materiale foglio di calcolo) aggiungendo i componenti aliquotate dal kit a 500 ml di EBM2 media. </li><li> GFP Negativo Cultura supporti (supporti cellule non endoteliali). Mescolare 445 ml di Medium 199 1x con 5 ml di penicillina / streptomicina (pen / strep) (concentrazione finale 1%) e 50 ml di FBS (concentrazione finale del 10%). </li></ol></li></ol> 2 Dissezione della Regione valvolare da topi adulti ed embrioni E14.5 <ul><li> Tutte le procedure sugli animali sono stati approvati ed eseguiti in conformità alle linee guida Hospital Research Institute IACUC dei Bambini Nazionale. </li><li> Topi Tie2-GFP sono stati acquistati da Jackson Laboratories (magazzino numero 003.658) 14 e sono stati mantenuti come genotipi omozigoti su uno sfondo FVB / N, e quindi garantire che tutti GFP espresso off-primavera in cellule endoteliali Tie2-positivi. </li><li> Per FACS ordinamento, preparare una età abbinato samp negativole che non contiene BPA come C57 / BL6 per impostare i parametri di gate GFP per FACS ordinamento. NOTA: Questo protocollo e risultati rappresentativi si basano sull&#39;utilizzo di tre, quattro mesi di età topi adulti o una cucciolata a giorno embrionale (E) 14.5. </li></ul><ol><li> Topi adulti: Subito dopo il sacrificio da CO 2 anossia, usano forbici dissezione per aprire delicatamente la cavità toracica ed esporre il cuore ei polmoni. Dopo l&#39;esposizione, afferrare il cuore con una pinza le grandi arterie e tirare fuori dal corpo. Rimuovere tessuto polmonare, se intatto, e posto il cuore in HBSS freddo a risciacquare. Rimuovere il ventricolo e tirare via atri lasciando il canale atrioventricolare &#39;anello&#39; e regioni aortici intatti. Effettuare una incisione lungo il lato del canale atrioventricolare di aprire il &#39;ring&#39; e esporre le strutture valvolari. Rimuovere il miocardio e le regioni aorta prossimale da prendere in giro delicatamente con una pinza. Identificare i lembi valvolari come bianco, tessuto denso sul miocardio rosa. Deta delicatamenteCH L&#39;corde tendinee dalle valvole atrioventricolari e rimuovere la maggior quantità di miocardio residuo possibile. Siate cauti a non tirare o raschiare i lembi valvolari durante questo processo poiché VEC possono essere sloggiati. Posizionare regioni valvolari tagliati in una provetta Eppendorf da 1,5 ml contenente 1 ml HBSS e tenere su ghiaccio. NOTA: dissezione accurata è fondamentale per eliminare le cellule endoteliali non valvolare che potrebbero contaminare il campione. </li><li> Embrioni: il sacrificio topi femmina 14,0 giorni dopo la spina copulazione si osserva (mattina del tappo di copulazione = 0,5 giorni). <ol><li> Subito dopo il sacrificio, sezionare l&#39;utero (contenente gli embrioni) e lavare in HBSS freddo. Sezionare singoli embrioni dall&#39;utero e rimuovere il sacco vitellino embrionale che circonda ogni embrione. Rimuovere i cuori di ciascuno degli embrioni e seguire passo 2.1. (NOTA: stringendo delicatamente l&#39;embrione con una pinza appena sotto le appendici superiori dovrebbe contribuire a esporre il cuore e rendere più facile la rimozione.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissociazione delle cellule e preparazione per FACS <ol><li> Utilizzo di puntali sterili, rimuovere HBSS dal tubo eppendorf contenente le regioni valvolari. </li><li> Sostituire con 1 ml di tampone di dissociazione e 4 microlitri DNasi I. </li><li> Ruotare le provette a 37 ° C per 7 minuti. </li><li> Pipettare su e giù 3 volte e poi lasciare che il campione riposare per 15 sec. Raccogliere il surnatante (contenente le cellule dissociate) in una provetta da 15 ml. </li><li> Per fermare la reazione collagenasi, aggiungere 125 ml di siero di cavallo al tubo di raccolta. Tenere tubo di raccolta sul ghiaccio. </li><li> Ripetere passaggi dissociazione (3,2-3,5) nove volte a raccogliere nove frazioni di surnatante. </li><li> Passare la raccolta frazionata attraverso un filtro di nylon 70 micron in un nuovo tubo di raccolta per garantire una sospensione di cellule singole rimuovendo eventuali residui e grumi. </li><li> Gira la sospensione a 400 g per 5 minuti per agglomerare le cellule. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone e Ordinamentotenere in ghiaccio fino al FACS. </li></ol> 4. FACS Ordinamento GFP positive VEC <ol><li> Set porte per avanti e side scatter escludere detriti e catturare singole cellule; escludere doppietti utilizzando discriminazione doppietto gating. Registrare il campione di controllo negativo e definire le impostazioni di gate al fine di confrontare e definire con precisione la popolazione di cellule GFP-positive nel campione Tie2-GFP. </li><li> Analizzare le cellule GFP positive tramite FACS e perfezionare impostazioni del gate. </li><li> Ordina il campione Tie2-GFP e raccogliere sia le cellule GFP-positive e GFP-negativi. Se verranno utilizzate cellule per l&#39;estrazione dell&#39;RNA, ordinare direttamente nel buffer ordinamento. Per le celle di coltura dopo FACS, raccogliere le cellule GFP positive in una provetta sterile contenente 1 ml di media VEC con 1 ml di FBS, e raccogliere le cellule GFP negativi in ​​1 ml di media non-endoteliali con 1 ml di FBS. Utilizzare questa combinazione di siero media / 50% 50% per migliorare la vitalità cellulare. Tenere in ghiaccio fino analisi post FACS. </li></ol> 5. post FACS analisi dells <ol><li> Estrazione RNA: <ol><li> Subito dopo FACS, le cellule positive e negative GFP centrifugare a 1500 xg per 8 min. </li><li> Pipettare con attenzione il surnatante (smistamento buffer) e scartare. </li><li> Risospendere il pellet di cellule (pellet non è visibile per le dimensioni del campione consigliate qui) in 200 ml Trizol. </li><li> Congelare a -80 ° C o iniziare l&#39;estrazione fenolo-cloroformio standard per isolare mRNA totale come precedentemente descritto dal nostro laboratorio 15. </li><li> Utilizzare 50-200 ng di RNA per la sintesi di cDNA utilizzando la Mastermix secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Oggetto cDNA per l&#39;amplificazione PCR quantitativa utilizzando sonde IDT Primetime qPCR contro marcatori di cellule endoteliali del mouse (CD31, Fattore di von Willebrand (vWF)), marcatori valvola di cellule interstiziali (α-actina del muscolo liscio (α-SMA), periostina (Postn)), miociti marcatori (Mhc6, Mhc7) e GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> Coltura murino VEC: <ol><li> Dopo FACS smistamento e raccolta di cellule (punto 4.3), le cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> Pipetta con cautela il surnatante (ordinamento tampone + media) e scartare. </li><li> Risospendere il pellet di cellule GFP-positive in 1 ml di media VEC e il pellet GFP-negativo in 1 ml di media non endoteliali. </li><li> Piatto ciascun campione in un pozzetto di una diapositiva camera di plastica e crescere fino confluenti. Cultura per circa 1 settimana per le cellule GFP negativi a diventare confluenti e più di 2 settimane per le cellule GFP positive per diventare confluenti (da un campione di 3, topi adulti). Modificare i media ogni due giorni. </li></ol></li><li> Colorazione di immunofluorescenza: <ol><li> Rimuovere i supporti dalle cellule e fissare nel 4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT. Lavare le cellule fissate tre volte per 5 minuti ciascuno in soluzione tampone fosfato (PBS). </li><li> Rimuovere pozzi camera da scivolo e blocco in siero bovino 5% di albumina / 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Covarediapositive O / N a 4 ° C con anticorpi primari (CD31, 1: 1.000 o actina del muscolo liscio α-(α-SMA), 1: 100). Lavare 3x per 5 min in PBS. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo secondario (Alexa Fluor-568 di capra anti-Rat) 1: 400 in PBS, aggiungere alle diapositive, e incubare 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini 3x per 5 min in PBS. </li><li> Montare in Vectashield contenenti DAPI e incubare 1 ora a 4 ° C prima della visualizzazione. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+FGF+regulatory+pathways+control+cell+lineage+diversification+of+heart+valve+precursor+cells.">BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells.</a> Developmental biology. 292, 292-302 (2006).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation research. 109, 183-192 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui si descrive per la prima volta, un nuovo metodo per l&#39;isolamento di VEC murini embrionali e adulte di topi Tie2-GFP. Anche se questa linea di topi è stato ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di popolazioni di cellule endoteliali, questo è il primo rapporto che mostra isolamento selettivo di VEC. A causa della fragilità della popolazione VEC, abbiamo sviluppato un protocollo rigoroso che consente l&#39;isolamento di singole cellule di GFP positive (e negative GFP) le cellule da valvole cardiache di topi embrionali e adulte. Rispetto alla pubblicazione originale utilizzando embrioni interi o organi da Tie2-GFP topi 14, abbiamo ottimizzato collagenasi e dissezione misure basate sulla bassa abbondanza di questa popolazione di cellule endoteliali fragile per isolare una popolazione selezionata di cellule. Isolamenti VEC hanno già stati riportati solo in modelli animali di grandi dimensioni con strumenti genetici e biomolecolari limitato. Questi strumenti sono ben stabiliti nei topi e, quindi, l&#39;abilità di isolare VEC murini consente un set esteso di disegni sperimentali da utilizzare per la ricerca delle valvole cardiache. Di conseguenza, un vantaggio significativo di questo approccio è che VEC possono essere isolati temporalmente da topi wild type, e modelli di malattia della valvola e lesioni. Un secondo vantaggio è che VECs possono essere isolati e analizzati quasi immediatamente dopo la dissezione, preservando pattern di espressione che riflettono la situazione in vivo in modo più accurato. Inoltre, questo protocollo isolamento è sufficiente ad eliminare coltura cellulare per l&#39;espansione numero e quindi possibili variazioni fenotipiche indotte dall&#39;ambiente in vitro sono impediti. Nonostante le novità ei vantaggi sperimentali di questo protocollo, ci rendiamo conto che esistono ancora limitazioni. In primo luogo, la dimensione della popolazione VEC entro valvole murini è molto piccolo e quindi, più cucciolate embrionali temporizzate sono necessari al fine di generare RNA sufficiente per l&#39;analisi di espressione genica. Mentre this può essere superato utilizzando più allevatori, potrebbe avere un impatto sulla domanda di alcuni strumenti di analisi post-isolamento. Questa limitazione è stata una sfida particolare per stabilire colture confluenti di VEC GFP-positive, al fine di effettuare analisi più approfondite di fenotipi VEC compresi i profili molecolari e test funzionali. Pertanto riconosciamo che non tutte le difficoltà sono state superate dal nostro approccio, ma questa è una zona di interesse che stiamo cercando di superare. Questo approccio di isolare VEC dalle regioni valvolari introduce la possibilità di contaminazione da Tie-GFP -positive, non valvolare cellule endoteliali della dell&#39;endocardio, o strutture vascolari all&#39;interno del miocardio ventricolare. Ad oggi, distinzione molecolare di VEC da altre popolazioni di cellule endoteliali cardiache non sono stati identificati. Tuttavia una regione enhancer del gene NFATc1 è stato identificato e dimostrato di etichettare specificamente VEC che non faresottoposti EMT, e le altre popolazioni di cellule endoteliali all&#39;interno del cuore 18. Come modello Cre (NFATc1 encre) è disponibile, gli studi futuri potrebbero utilizzare la specificità di questa linea per minimizzare i rischi di contaminazione. Oltre alle cellule positive Tie2-GFP non valvolare, c&#39;è sempre la possibilità di contaminazione da miociti nel punto in cui i lembi valvolari si attaccano alla regione anulare del setto e pareti miocardiche murali. In dati non riportati qui, inizialmente abbiamo iniziato gli studi per isolare VEC dalle regioni valvolari sezionati utilizzando perline anticorpi coniugati rivestiti con anti-GFP e anti-CD31. Anche se questo approccio ha avuto successo per isolare le cellule endoteliali, abbiamo sperimentato significativa aggregazione di cellule da tipi di cellule adiacenti, non endoteliali e quindi VIC e cellule miocardiche contaminati nostro campione sperimentale. Questo è stato evitato utilizzando l&#39;analisi FACS come parametri sono stati impostati per isolare solo sospensione singola cellas e analisi PCR per rilevare l&#39;espressione di geni specifici miociti è controllata per questa limitazione (Figura 3). Mentre il nostro contaminazione può essere ritenuto come minimo, rimane un potenziale complessità sperimentale che potrebbero essere evitati in futuro con la doppia selezione di GFP e marcatori di superficie specifici delle cellule endoteliali. Usando questo protocollo, abbiamo VEC successo isolate da topi embrionali e adulte e gli esempi forniti di come questo approccio può essere utilizzato per l&#39;isolamento di RNA e la coltura di cellule di popolazioni di cellule GFP positive e negative GFP. Tuttavia, questo approccio non è limitato a queste applicazioni e può essere utilizzato per una pletora di approcci molecolari, cellulari e funzionali. Inoltre, il fondo Tie2-GFP può essere allevato con modelli genetici di topo che permettano di studi comparativi delle popolazioni VEC nella salute e nella malattia. Lo sviluppo di questa nuova metodologia, per la prima volta, consentire studi miratiesaminando il contributo di VEC nello sviluppo della valvola e la manutenzione e potrebbe svelare i meccanismi precedentemente sottovalutati della malattia della valvola endotelio-dipendente.

La valvola maturo è composto da tre strati stratificati di matrice specializzata extracellulare (ECM) intervallati da cellule interstiziali valvolari (VIC) e incapsulato da un singolo strato di cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) 1. Il ruolo della ECM è quello di fornire tutte le necessarie proprietà biomeccaniche di resistere continui cambiamenti in vigore emodinamico durante il ciclo cardiaco. Il fatturato del ECM valvola nella valvola adulti è strettamente regolata da VIC, che sono in gran parte quiescente e fibroblasti-come, in assenza di malattia. Oltre alla popolazione VIC, cellule endoteliali valvole cardiache (VEC) formano un endotelio ininterrotta sulla superficie delle cuspidi della valvola 2. Mentre l&#39;importanza di ECM e VIC per la struttura e la funzione della valvola sono stati descritti da noi e gli altri, il ruolo di VEC è meno noto. Tuttavia, questa relativamente piccola popolazione di cellule è critico per la formazione valvola nell&#39;embrione ed è descritto come disfunzionale nella valvolamalattia. Formazione di valvola cardiaca in embrione inizia quando un sottoinsieme di cellule endoteliali all&#39;interno delle regioni canale e del tratto di efflusso atrioventricolare subire endoteliale alla trasformazione mesenchimale (EMT) e formano gonfiori conosciuti come cuscinetti endocardici 1,3. Le cellule mesenchimali recentemente trasformate all&#39;interno di queste strutture poi si differenziano in VIC e formano le valvole maturi. Una volta EMT è completa, le cellule endoteliali che circondano i cuscini, chiamati VEC, formano uno strato di cellule endoteliali ininterrotto che protegge la valvola maturo contro i danni. Inoltre, VEC percepiscono l&#39;ambiente emodinamico e hanno dimostrato a livello molecolare comunicare con VIC sottostanti per regolare ECM omeostasi 1,3. Nelle valvole malate, il monostrato VEC viene interrotto in associazione con i cambiamenti anormali nell&#39;organizzazione ECM e biomeccanica alterati 4,5. Inoltre, studi in modelli murini suggeriscono che la disfunzione VEC è la causa di fondo della valvola disease 1,6-9. Come VEC svolgono un ruolo importante nello sviluppo della valvola, la manutenzione, e la malattia, è importante che noi definiamo pienamente i loro fenotipi temporali, al fine di avanzare il campo e capire i meccanismi della malattia. Precedente lavoro di molti laboratori si è isolato con successo VEC da suini e ovini modelli 10-12. A causa delle grandi dimensioni di queste valvole, isolamenti attraverso tampone e / o digestione enzimatica, seguita da un numero di diversi metodi di isolamento, tra cui la separazione delle cellule tallone magnetica e singola cella espansione clonale è stata efficace per generare popolazioni puri 11-13. Tuttavia, questi modelli possono essere restrittivi causa l&#39;annotazione incompleta dei suini e ovini genomi che limitano la disponibilità di strumenti molecolari oltre ai costi elevati. Pertanto sperimentazione di suini e ovini VEC dopo l&#39;isolamento può essere restrittivo. Modelli murini sono preferibili a causa delle molte possibilità di manipula genetica, ma fino ad oggi, sono stati riportati zione e strumenti molecolari in embrione e l&#39;adulto non isolamenti VEC in piccoli modelli animali. Ciò è probabilmente dovuto alla difficoltà di lavorare con campioni di tessuto di piccole dimensioni che comprendono una popolazione di cellule minoranza che attualmente privi di identità unica di marcatori VEC-specifici, evitando così metodi di isolamento a base di anticorpi. In questo articolo, riportiamo un nuovo metodo per l&#39;isolamento diretto di VEC murini nelle fasi embrionali e adulte. Questo protocollo sfrutta topi Tie2-GFP, che esprimono GFP in tutti i tipi di cellule endoteliali e sono stati ampiamente utilizzati per studiare popolazioni di cellule endoteliali 14. Tuttavia, la novità di questo studio è che questi topi, per la prima volta sono stati utilizzati per isolare cellule endoteliali dalle valvole. Con attenta dissezione del tessuto valvola e una serie di nove digestioni enzimatiche seguiti da FACS ordinamento, VEC possono essere isolati e utilizzati per varie tecniche sperimentali including estrazione e cultura RNA, direttamente dopo l&#39;ordinamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Tie2 cellule GFP-co-localizzano con marcatori di cellule endoteliali nelle valvole cardiache embrionali e adulte. Al fine di confermare la specificità di espressione Tie2-GFP in VEC da topi embrionali e adulte, immunofluorescenza è stata eseguita per determinare co-localizzazione con il marcatore delle cellule endoteliali, CD31 in sezioni di tessuto preparate da E14.5 e 3 mesi di età adulta Tie2-GFP topo, utilizzando metodi precedentemente pubblicate dal nostro laboratorio 16. Come mostrato in Figura 1, VECs co-esprimono GFP (Figura 1 A, B, E, F) e CD31 (Figura 1 C, D, E, F) sia adulto (Figura 1 B, D, F) e embrionale ( Figura 1 A, C, E) le fasi, quindi convalida il nostro modello per il successivo isolamento VEC. Analisi FACS identificato popolazioni di cellule GFP-positive e GFP-negativi distinti in valvole cardiache embrionali e adulte isolate da topi Tie2-GFP. Selvaggio ttopi YPE C57 / BL6 sono stati usati per impostare i parametri GFP e circa il 2% delle singole cellule-gated da topi Tie2-GFP mostrano un arricchimento significativo in cellule GFP-positive mediante analisi FACS in entrambi i campioni embrionali e adulte (Figura 2). Sulla base di studi di co-localizzazione illustrate nella Figura 1, queste cellule sono considerati VECs e producono una media di 61.800 cellule totali (campioni vanno da 39,000-77,000 cellule / campione) in campioni adulti (n = 3), e 8,928 cellule (8,015- 11.000 cellule / lettiera) da una cucciolata di embrioni E14.5. Analisi PCR conferma arricchimento di marcatori di cellule endoteliali in cellule GFP-positive e valvola di marcatori di cellule interstiziali di cellule GFP-negativi isolati da topi Tie2-GFP. Analisi dell&#39;espressione genica di popolazioni di cellule GFP positivi e negativi per qPCR seguenti FACS Mostra profili molecolari distinti. Rispetto alle popolazioni di cellule GFP negativi isolati da embrioni Tie2-GFP e adults, le cellule GFP positive sono arricchite per l&#39;espressione di marcatori di cellule endoteliali CD31 e vWF, (Figura 3). Inoltre, l&#39;espressione di marcatori miociti (MYH6, MYH7) in queste popolazioni di cellule è molto bassa, dimostrando minimo la contaminazione di cellule non endoteliali. Al contrario, le cellule GFP negativi isolate da topi adulti Tie2-GFP e E14.5 embrioni sono arricchiti per valvola cellule interstiziali (VIC), marcatori di cellule positive α-SMA e periostina (POSTN) relativi alla GFP. Arricchimento di questi marcatori è maggiore nelle cellule GFP negativi isolati da campioni E14.5 rispetto agli adulti a causa del fenotipo quiescente di VIC adulti e quindi bassa espressione di marcatori attivati. Cellule GFP-positive isolate dal Tie2-GFP topi adulti possono essere coltivate in vitro. La capacità di cultura GFP cellule negative e positive GFP isolati da campioni adulti è stata esaminata la based sulla morfologia cellulare e la colorazione immunoistochimica. Utilizzando protocolli precedentemente descritti da noi 17 illustra la Figura 4 che le cellule GFP positive appaiono round morfologia (figura 4A) e co-express GFP con il marker delle cellule endoteliali CD31 dopo due settimane in coltura (Figura 4C). Al contrario, le cellule non endoteliali sono negativi per la GFP, visualizzare una morfologia mesenchimale-like (Figura 4B) ed esprimere il VIC marcatori α-SMA dopo nove giorni (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1.-Tie2 cellule GFP-positive co-localizzano con CD31 in valvole cardiache embrionali e adulte. Immunofluorescenza per mostrare associazione di (Tie2-) espressione GFP (A, B) con il marcatore delle cellule endoteliali, CD31 (C, D) in le svolantini eptal della valvola mitrale a E14.5 (A, C, E) e adulti (B, D, F) fasi. La regione valvola è evidenziato in A, C, E. (E, F) fusione di immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. VEC Tie2-GFP-positive possono essere identificate da FACS. Rispetto ai controlli C57 / BL6 di pari età (A, C), le valvole isolate da embrioni Tie2-GFP (B) e adulti (D) contengono una GFP distinta popolazione di cellule positive, come indicato in verde. Eventi GFP-negativo, mostrati in rosso sono stati raccolti come controllo. I numeri tra (B) e (D) indicano la% media di GFP-pcellule ositive dal numero totale di eventi ordinati per FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. cellule GFP-positive sono arricchiti per i marcatori delle cellule endoteliali mentre le cellule GFP-negativi esprimono geni associati con le cellule interstiziali valvolari. Rappresentante qPCR di marcatori di cellule endoteliali (CD31, Fattore di von Willebrand (vWF)) e adulti (MYH6) e fetali ( MYH7) marcatori miociti in cellule GFP-positive isolate dalle regioni valvolari di E14.5 (A) e adulti (B) topi Tie2-GFP. Nota arricchimento di marcatori di cellule endoteliali e livelli molto bassi di geni miociti-associata. (C, D) Fold chaNGES in espressione di marcatori di cellule interstiziali valvolari α-SMA e Postn in cellule GFP-negativi isolati da E14.5 (C) e adulti (D) topi Tie2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4.-Tie2 cellule GFP-positive mantengono l&#39;espressione di marcatori di cellule endoteliali in vitro. Seguito FACS, GFP positive (A, C) e negativo (B, D) le popolazioni di cellule provenienti da topi adulti sono stati coltivati ​​fino confluenti e sottoposti alla fase di imaging contrasto (A, B) e immunostaining fluorescente (C, D). Cellule GFP-positive esprimono CD31 (rosso) (C) dopo10 giorni di coltura. Al contrario, l&#39;espressione della GFP non è stato rilevato nella popolazione di cellule negativo, che macchiato positivo per α-SMA, un marker di VIC attivati ​​(D).

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Video: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

Isolamento delle celle della valvola interstiziale del topo per studiare la calcificazione della valvola aortica in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

Isolamento di cellule valvolari primarie umane per la modellazione di malattie in vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolamento delle cellule endoteliali dai capillari linfatici dermici murini

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Autore in primo piano: Isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...