L'isolamento della cellula endoteliale e interstiziale della valvola primaria umana è fondamentale per comprendere il meccanismo alla base della patogenesi della malattia della valvola aortica calcifica. Quando la valvola viene asportata dal tessuto nativo, la vitalità cellulare diminuisce. Quindi abbiamo identificato un metodo che prolunga la vitalità cellulare.
Dopo aver ricevuto i campioni di tessuto valvolare estratti, estrarre la radice aortica e immergere il tessuto in un tubo conico da 50 millilitri contenente una soluzione di risciacquo sterile. Dopo un'incubazione di 10 minuti in un secchiello del ghiaccio su un bilanciere, spruzzare i tubi con etanolo al 70%. In una cappa di coltura di tessuto sterile, trasferire il tessuto in una capsula di Petri e asportare due lembi valvolari.
Posizionare un foglietto illustrativo in una fiala criogenica e congelare il tessuto in azoto liquido per meno 80 gradi Celsius. Per fissare il tessuto per la colorazione del contenuto di calcio, tagliare il secondo foglietto a metà dal nodulo alla cerniera e posizionare entrambi i pezzi di tessuto in una cassetta immersa nel 4% di paraformaldeide. Quindi posizionare l'intera configurazione sul bilanciere a temperatura ambiente per un minimo di due ma non più di quattro ore.
Per isolare le celle interstiziali della valvola, trasferire il foglietto in un nuovo tubo conico da 50 millilitri contenente PBS ghiacciato e posizionare il tubo su un bilanciere per due minuti a temperatura ambiente. Dopo la miscelazione, trasferire il tessuto in un piatto da 60 millimetri contenente da cinque a sette millilitri di soluzione fredda di collagenasi. Utilizzare una pinza per immergere entrambi i lati del foglietto tre o quattro volte nella soluzione prima di incubare il tessuto nell'incubatore di coltura cellulare per cinque o 10 minuti a 37 gradi Celsius con un leggero oscillolio del tessuto tre o quattro volte ogni due minuti.
Alla fine dell'incubazione, trasferire due millilitri di soluzione dal piatto a un tubo conico sterile da 15 millilitri. Posizionando una pinza sul nodulo del volantino, utilizzare un batuffolo di cotone sterile per far scorrere il tessuto dalla pinza alla cerniera mentre si fa roteare il tampone lungo il volantino. Dopo lo strisciamento, sciacquare il tampone nel tubo della soluzione di collagenasi e tamponare l'altro lato del tessuto come appena dimostrato.
Dopo il risciacquo, ripetere il tampone su entrambi i lati del tessuto e utilizzare una pipetta da un millilitro e una soluzione di collagenasi per risciacquare eventuali cellule di rimozione da entrambi i lati della superficie del foglietto nel piatto. Dopo il risciacquo, trasferire tutta la soluzione dal piatto nel tubo contenente le cellule dal tampone e posizionare il tessuto valvolare rimanente in un nuovo tubo conico da 15 millilitri contenente sette millilitri di soluzione sterile di collagenasi. Pellet le cellule endoteliali della valvola isolata mediante centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di mezzo di crescita delle cellule endoteliali vascolari.
Dopo una seconda centrifugazione, risospendere le cellule in un millilitro di terreno di crescita fresco per il conteggio e seminare le cellule a una concentrazione di 5 x 10 alla quinta cellula per centimetro quadrato in piastre a sei pozzetti rivestite di collagene, rinfrescando il terreno ogni tre o quattro giorni. Quando i cerotti delle cellule endoteliali della valvola coprono più dell'80% della piastra, dividere le cellule a una concentrazione di 1,3 x 10 alla quarta cellula per centimetro quadrato, a seconda del loro tasso di crescita. Una volta che le cellule sono state espanse, confermare il loro fenotipo di cellule endoteliali valvolari mediante colorazione immunofluorescente per i marcatori delle cellule endoteliali valvolari di interesse.
Per isolare le cellule interstiziali valvolari, posizionare il tubo contenente il tampone per fogliare il tessuto nell'incubatore di coltura cellulare per 12-18 ore con il tappo leggermente aperto. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta sierologica per dissociare delicatamente il tessuto per garantire il rilascio delle cellule interstiziali della valvola e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere sette millilitri di mezzo di celle interstiziali valvolari al tubo e raccogliere le celle mediante centrifugazione.
Risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di crescita delle cellule interstiziali della valvola fresca per contare e seminare le cellule a una concentrazione di 1,3 x 10 delle quarte cellule per centimetro quadrato in un piatto trattato con coltura tissutale di 60 millimetri di diametro. Dopo uno o due giorni, lavare le colture due volte con PBS e aggiungere terreno fresco alle cellule. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 90%, lavare le colture due volte con DPBS e trattare le cellule con due o tre millilitri di reagente di dissociazione preriscaldato per due o tre minuti a 37 gradi Celsius.
Quando le cellule si sono staccate, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico per la centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet in tre o quattro millilitri di mezzo di crescita delle cellule interstiziali della valvola preriscaldato per il conteggio. Quindi seminare le cellule con un rapporto di uno o due rispetto alla densità di coltura originale e valutare il fenotipo di crescita delle cellule interstiziali della valvola mediante colorazione immunofluorescente come dimostrato. I campioni di tessuto della malattia della valvola aortica calcifica mostrano una morfologia alterata con pesanti noduli di calcificazione rispetto ai campioni di tessuto non calcificato di controllo.
Quando la calcificazione viene valutata dalla colorazione di Von Kossa, si osservano precipitazioni marrone scuro o nero nel tessuto del foglietto malato. La soluzione di conservazione a freddo stabilizza notevolmente le cellule tissutali valvolari asportate con una vitalità di circa il 40% osservata per entrambi i tipi di cellule recuperate fino a 61 ore dopo l'estrazione della valvola. L'analisi morfologica delle cellule endoteliali della valvola rivela cellule inibite della crescita simili a ciottoli, mentre le cellule interstiziali valvolari mostrano una morfologia a forma di fuso simile a quella osservata per i miofibroblasti.
L'immunocolorazione conferma che la maggior parte delle cellule endoteliali e interstiziali valvolari espanse esprime i marcatori tissutali specifici attesi. Ricorda che un tampone delicato ma fermo del foglietto è fondamentale per il rilascio dello strato cellulare endoteliale e che l'incubazione notturna con collagenasi è necessaria per il rilascio della popolazione di cellule interstiziali dall'interno del tessuto denso. Una volta stabilite, le linee cellulari possono essere utilizzate per lo studio meccanico riguardante la patogenesi specifica della malattia della valvola aortica, compresa l'insorgenza della malattia, la progressione e il trattamento.
