L'uso di cellule isolate della valvola del topo è essenziale per studiare la via di segnalazione che porta alla calcificazione delle valvole nell'uso di cellule geneticamente modificate da topi transgenici. La digestione in due fase è un metodo rapido ed efficiente. La parte più impegnativa di questo protocollo è l'isolamento della valvola aortica da topi di otto settimane.
È meglio esercitarsi sui topi più anziani per visualizzare meglio la valvola aortica. Prima di iniziare l'esperimento, pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e lo spazio di lavoro con 70%etanolo e autoclave gli strumenti chirurgici per 30 minuti. Quando la configurazione iniziale è pronta, inizia con la pulizia del torace e della regione dell'addome di un topo eutanasiato di otto settimane usando l'etanolo.
Usando le forbici, aprire l'addome e il petto del topo, quindi tagliare tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro con piccole forbici chirurgiche. Rimuovere il sangue dal cuore perfondendo 10 millilitri di PBS freddo e tagliare il cuore, mantenendo tre millimetri dell'aorta ascendente. Sotto uno stereomicroscopio, sezionare la valvola aortica tagliando il cuore orizzontalmente al centro dei ventricoli e tagliando il ventricolo sinistro verso l'aorta, quindi sezionare attentamente la valvola aortica.
Mettere insieme le valvole in un piccolo piatto di coltura tissutale di 35 millimetri. Lavare le valvole isolate in un piatto di coltura cellulare da 75 millilitri con cinque millilitri di HEPES freddo da 10 millimolare appena preparato integrato con antibiotici e incubare in cinque millilitri di collagenasi di tipo uno per 30 minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento continuo. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo per cinque minuti, a 150 volte G e lavare il pellet una volta con due millilitri di HEPES da 10 millimolare con vortice ad alta velocità per 30 secondi.
Raccogliere la sospensione risultante dal tubo in un piatto di coltura di 35 millimetri e utilizzare una pinzetta sottile per trasferire con cura i frammenti di tessuto in un tubo fresco. Quindi incubare il pellet in un tubo da 15 millilitri con cinque millilitri di collagenasi di tipo uno a 37 gradi Celsius sotto agitazione continua per 35 minuti. Separare le cellule riutilizzando con una pipetta millilitro e centrifugare a 150 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Pulire le cellule due volte rimospendendo il pellet separato in due millilitri di DMEM completo e centrifugando a 150 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per la placcatura, risospendare il pellet in un millilitro di mezzo completo e aggiungerlo a un pozzo di un piatto di coltura a sei cellule di pozzo in una quantità minima di mezzo. Mantenere le piastre indisturbate a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Dopo tre giorni di incubazione, confermare la crescita vicino ai detriti tissutali osservando le cellule al microscopio. Una volta che 1.000 cellule sono visibili, rimuovere con cura i detriti del tessuto con pinzette autoclavate e cambiare il mezzo. Tripinare le cellule dopo aver raggiunto il 70% di confluenza e trasferirle in un piatto di coltura tissutale da 75 millilitri.
Prima di iniziare il test, pulire la cappa di biosicurezza con 70%etanolo e riscaldare il mezzo DMEM a 37 gradi Celsius. Successivamente, semina 100.000 cellule per condizione in sei piastre di pozzo in DMEM completo e coltura a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo supernatante con il mezzo calcificatore e incubare le cellule per sette giorni a 37 gradi Celsius, sostituendo il mezzo il terzo giorno.
Dopo sette giorni, misurare la concentrazione di calcio in una piastra di 96 pozza di calcio usando il reagente Arsenazo III e registrando l'assorbanza a 650 nanometri. Nell'analisi rappresentativa, vari fenotipi di cellule valvolari sono stati identificati con colorazione immunofluorescente dopo tre o cinque giorni di coltura. La vimentina espressa da Mouse VIC e alfa SMA, i marcatori significativi delle celle valvolari.
Inoltre, la colorazione immunofluorescente CD31 non ha verificato alcuna contaminazione da cellule endoteliali nella coltura VIC. Coltivare VIC con mezzo calcificatore ricco di fosfati stimola una calcificazione nelle cellule, ulteriormente confermata con la colorazione rosso positiva per i nodi di calcio. Il protocollo si basa su un pool di tre o cinque valvole da diversi topi.
L'uso del compagno di lettiera e di tre diverse repliche biologiche è importante per convalidare i risultati. L'uso di cellule della valvola del topo è vitale per comprendere la via molecolare che porta alla stenosi aortica isolando le cellule dai topi transgenici. Questo protocollo è stato usato in precedenza per indagare l'implicazione della via del recettore nella regressione minerale della valvola aortica calcificata.
