The authors have no acknowledgements.

Esperimenti necessari per sviluppare il protocollo sono stati eseguiti secondo le normative nazionali e sono state approvate dal comitato etico della scienza locale (Comitato di Bioetica di Ateneo), che opera all&#39;interno dell&#39;istituzione dell&#39;Università degli Studi di Torino, Torino, Italia. 1. Preparazione <ol><li> Anestesia <ol><li> Posizionare l&#39;animale all&#39;interno della camera isoflurano appropriato per anestetizzare esso. </li><li> Riempire la camera con O 2 e mista gas isoflurano per uso veterinario ad una concentrazione di 2,5% in una camera a gas 2 L e attendere per circa 3 minuti per il ratto addormentarsi. Controllare l&#39;effetto di anestesia da un pinch punta. </li><li> Una volta che l&#39;anestesia ha effetto, rimuovere il topo e si pesa. </li><li> Distribuire uno strato sottile di gel idrosolubili oftalmica sugli occhi dell&#39;animale per proteggerli e per mantenere l&#39;idratazione fisiologica oculare. </li><li> Posare il ratto su una ecografia e la stazione di imaging fotoacustico piano di lavoro. Ioordine n per mantenere l&#39;effetto dell&#39;anestesia, rapidamente posizionare il naso all&#39;interno della maschera appropriata fornendo un flusso costante di anestesia (isoflurano 2% -2,5% di ossigeno 1 L / min). </li></ol></li><li> Rasatura l&#39;animale <ol><li> Stendere uno strato uniforme di crema rimozione dei capelli sulla superficie della testa, con attenzione a coprire aree orecchie e il collo circostanti. Lasciare la crema agire per alcuni minuti e delicatamente togliere con una spatola. Softly rimuovere tutti i residui di crema con una spugna bagnata per pulire accuratamente la pelle. NOTA: La pelliccia animale intrappola aria che influisce negativamente ultrasuoni acquisizione di immagini basato, quindi deve essere necessariamente rimosso per quanto possibile. </li></ol></li><li> Posizionamento l&#39;animale <ol><li> Disporre l&#39;animale in una posizione di spread-eagle. Monitorare i segni vitali, tramite opportuni sensori vitali parametri sul piano di lavoro (se presenti). Magra le zampe sui sensori dopo l&#39;applicazione di alcune gocce di crema elettrodo per uso professionale. NOTA: Durante l&#39;anestesia, affinché i parametri vitali hanno valori come segue: ratto temperatura corporea ≈ 37,5 ° C, battiti cardiaci per minuto (bpm) varia tra 250 e 350 e la frequenza respiratoria è compreso nell&#39;intervallo di 40-80 respiri al minuto . </li><li> Infine fissare gli arti con toppa seta artificiale ipoallergenico. Se necessario, spalmare ancora uno strato sottile di gel idrosolubile oftalmica per proteggere gli occhi dell&#39;animale. </li></ol></li></ol> 2. Acquisizione di immagini dal temporale Point of View <ol><li> Posizionamento l&#39;animale <ol><li> Mantenendo l&#39;animale in posizione prona, ruotare il corpo leggermente sul lato, con un angolo di inclinazione di circa 45 ° rispetto all&#39;asse del corpo sagittale. Usare piccoli rotoli di garza di cotone, come sta per organizzare correttamente allo smaltimento (Figura 2a). </li><li> Sollevare la testa di animale e ruotare leggermente su un lato (Figura 2a). Utilizzare un rullo di cotone come supporto mantenendo l &#39;inserimento muso beneta nella maschera anestesia. </li><li> Inclinare il piano di lavoro con un angolo di circa 30 ° rispetto al piano orizzontale. </li><li> Ruotare il trasduttore di imaging con un angolo di circa 30 ° rispetto al piano verticale. </li></ol></li><li> Ultrasuoni e fotoacustica acquisizione delle immagini anatomiche e vascolare <ol><li> Girare la scansione di immagini in, accedere alla modalità B acquisizione delle immagini e impostare correttamente tutti i parametri di acquisizione di immagini a rispettare eventuali requisiti riportati dell&#39;esperimento (Figura 3a). NOTA: impostare la frequenza di trasmissione centrale più basso possibile (16 MHz, Figura 3b), in modo da avere la massima profondità di penetrazione possibile per il trasduttore. </li><li> Eliminare uno strato uniforme (spessore di circa 1 cm) di acqua ipoallergenico gel trasmissione ultrasuoni solubile sulla testa dell&#39;animale (Figura 2b). Coprire testa trasduttore con un sottile strato di gel stesso e metterlo in contatto con lo strato sulla rat. Utilizzare gel caldo per ridurre al minimo l&#39;ipotermia localizzata. </li><li> Inizia acquisizione di immagini in modalità B e regolare la posizione del trasduttore in tempo reale, identificando riferimenti anatomici e centrando la regione di interesse per il punto centrale del monitor. Assicurati di eliminare le bolle d&#39;aria, a qualsiasi livello intrappolato nello strato di gel, in quanto influenzano negativamente l&#39;acquisizione. </li><li> Posizionare il trasduttore per allinearlo alla asse virtuale che collega l&#39;orecchio all&#39;occhio (Figura 4a) per ottenere una focalizzazione del fascio ottimale. Acquisire diversi punti di vista del volume cerebrale interna, di orario o rotazione in senso antiorario (figura 4b e c). </li><li> Infine fissare il trasduttore su un supporto meccanico per fissare stabilmente la posizione e l&#39;orientamento di sintonizzare in modo fine. </li><li> Assicurarsi che la regione cerebrale di interesse localizza a 10 mm di profondità rispetto alla sorgente trasduttore US-LASER per ricevere un pH ottimalesegnale di risposta otoacoustic (Figura 5). Poi posto l&#39;indicatore di US onda focalizzazione esattamente al centro dell&#39;area analizzata. NOTA: Durante la ricerca di aree di interesse, evitando l&#39;attivazione dell&#39;opzione porta respirazione, al fine di accelerare la procedura di posizionamento. </li><li> Inserisci Modo colore Doppler di visualizzare i vasi sanguigni del cervello interne in modo sensibile alto. </li><li> Una volta che il posizionamento è stato impostato in modo appropriato per visualizzare le regioni ricercati, attivare l&#39;opzione porta respirazione per evitare gli effetti indesiderati legati al movimento (Figura 6a). </li><li> Scegliere il desiderato set di parametri di acquisizione in Color Doppler Mode (figura 6b) e acquisire immagini in questa modalità per distinguere sangue velocità del flusso e indicazioni, fino a diversi millimetri di profondità di penetrazione. </li><li> Entrare in modalità pulsata onda Doppler e acquisire le immagini per rilevare pulsazione del sangue dell&#39;arteria e di distinguere tra le arterie avene nd. </li><li> Inserire Modalità Doppler Potenza ed impostare i parametri di acquisizione (Figura 7) per eseguire una quantificazione segnale sulla base del numero di eventi di scattering provocate dal movimento flusso, e quindi valutate differenze nei tassi di flusso. </li><li> Entrare in modalità fotoacustico e correttamente perfezionare parametri di acquisizione (Figura 8 bis) per la raccolta dei dati sul contenuto di emoglobina totale di sangue o laurea ossigenazione in una data area. Producendo eccitazione laser su un intero spettro di lunghezza d&#39;onda (da 680 nm a 970 nm, Figura 8b), l&#39;assorbimento di emoglobina totale presente nei diversi stati chimici all&#39;interno di un tessuto può essere quantificato. Eseguendo raccolta segnale su lunghezze d&#39;onda specifiche singole (Figura 8c), è possibile isolare i contributi dei segnali distinti per l&#39;assorbimento di ossigeno e specie pure de-ossi. </li></ol></li></ol> 3. Imaging dal punto di vista occipitale <ol><li> Posizionamento l&#39;animale <ol><li> Mantenere l&#39;animale in posizione prona, abbassare la testa di animale e utilizzare piccoli rotoli di garza di cotone come laterale sta per organizzare correttamente allo smaltimento. </li><li> Ruotare imaging trasduttore parallelo al piano trasversale della testa di animale (Figura 9). NOTA: In questo modo, l&#39;acquisizione sarà centrato attraverso il forame occipitale alla base del cranio. Variando l&#39;angolo di inclinazione dell&#39;orientamento della sonda (Figura 9), sarà possibile acquisire immagini interne dei vasi in viste differenti a seconda dell&#39;inclinazione impostazione. </li></ol></li><li> Ultrasuoni e fotoacustica acquisizione delle immagini anatomiche e vascolare <ol><li> Inserire la modalità B acquisizione dell&#39;immagine, impostare tutti i parametri di acquisizione di immagini come precedentemente riportato (figura 3) e diffondere i necessari strati di gel ultrasuoni sulla sonda e sulla nuca animali. </li><li> Disporre il trasduttore di rimanere quasi orizzontale, in order essere diretto lungo posteriore ad anteriore all&#39;asse anatomiche del corpo. Puntare verso il lato anteriore del muso e inclinarlo leggermente in avanti. </li><li> Inizia l&#39;acquisizione delle immagini in modalità B e Modalità Color Doppler (figure 3 e 6). Registrare correttamente il trasduttore di posizione e rimuovere le bolle d&#39;aria dal gelcoat come precedentemente descritto. Se possibile, fissare il trasduttore su una posizione ferma per controllare l&#39;orientamento in modo fine e scegliere il miglior angolo di inclinazione per acquisire immagini delle regioni anatomiche desiderate. </li><li> Visualizza i vasi sanguigni del cervello interni in modalità Doppler Potenza, impostando opportunamente i parametri di acquisizione (Figura 7). </li><li> Localizzare arterie intensamente pulsate di Pulsed modalità Doppler Wave. Distinguerle dalle vene, che al contrario sono caratterizzati da bassi livelli di flusso sanguigno pulsazione. </li><li> Prelevare il sangue flusso di dati velocità e direzioni in Color Doppler Mode, attraverso un adeguato adattamento acqParametri uisition (Figura 6). </li><li> Completa emodinamica cerebrale set di dati di caratterizzazione profonda, aggiungendo informazioni sangue chimico ottenuto tramite l&#39;acquisizione fotoacustico (Figura 8). Eseguire questa valutando in particolare la quantità di parametri ematici come la percentuale di saturazione O 2 e il contenuto totale di emoglobina (HBT), che sono generalmente misurata impostando il laser di eccitazione lunghezza d&#39;onda a 750 e 850 nm (Figura 8c). </li></ol></li></ol> 4. Fine di acquisizione e di rimozione degli animali NOTA: correttamente considerare tutto il tempo dedicato al processo di acquisizione dell&#39;immagine (dal punto 1 al punto 3), che viene sottoposto a principali limitazioni relative alla dose di anestetico apposto sull&#39;animale. <ol><li> Salvare tutti i dati acquisiti, ruotare il laser pulsa fuori uscendo dalla modalità di acquisizione fotoacustico e allontanare il trasduttore. </li><li> Pur mantenendo la animal sotto l&#39;effetto dell&#39;anestesia, inizia a pulire rimuovendo delicatamente il gel protettivo dagli occhi con un batuffolo di cotone bagnato. Utilizzare una spatola e diversi tovaglioli di carta per rimuovere completamente il gel per ultrasuoni dalla testa e il muso, poi pulirli con una spugna umida. Fare attenzione a non danneggiare la pelle rasata delicata. </li><li> Estrarre il cerotto adesivo utilizzato per fissare gli arti e staccare dai sensori che monitorano i parametri fisiologici. Rapidamente trasferire l&#39;animale dal piano di lavoro acquisizione una gabbia diversa. </li><li> Host l&#39;animale in una piccola gabbia per il recupero dall&#39;anestesia. Assicurarsi che gli animali non devono condividere la gabbia durante questa fase per evitare aggressioni </li><li> Posizionare la gabbia di recupero sotto una luce a infrarossi per mantenere il caldo animale. Attendere che ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Controllare le condizioni di salute generali degli animali, prima di passare alla camera allevamento degli animali. </li></ol>

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Spese di pubblicazione di questo articolo sono stati sponsorizzati da Visual Sonics.

Il protocollo presentato è stato ottimizzato per fornire altamente efficace prestazioni di imaging cerebrale nei piccoli animali. Le immagini possono essere acquisite in diverse modalità, seguendo appunto le indicazioni circa i parametri di acquisizione e il posizionamento del trasduttore sul cranio forami. In particolare, il posizionamento sul lato temporale è la più critica, poiché gli Stati Uniti e il laser dobbiamo essere centrata nel modo più preciso possibile penetrare correttamente il forame, che è più piccolo di quello occipitale. Tuttavia, grazie a questa impostazione sperimentale, caratteristiche emodinamiche legate ai concorsi fisiologiche o patologiche sono accessibili e possono essere valutati anche in regioni cerebrali profonde, che sono solitamente difficili da caratterizzare. Poiché acquisizione dell&#39;immagine successo dipende dalla precisione del posizionamento trasduttore, questa dipendenza deve essere attentamente presi in considerazione perché può influire sulle prestazioni di imaging. Per esempio,alcune strutture anatomiche di interesse potrebbero non essere del tutto compresi nel piano di imaging acquisizione e la loro identificazione da immagini che offrono solo una visione parziale potrebbe risultare non ottimale. Inoltre, l&#39;acquisizione di immagini e US PA eseguito in una modalità tridimensionale (Modalità 3D) non sarebbe compatibile con l&#39;impostazione sperimentale descritto in precedenza, in quanto richiede il trasduttore a muoversi lungo un percorso automatizzato predefinito. Infine, a causa della variabilità naturale anatomica, la dimensione delle aperture cranio può variare significativamente tra gli animali, avendo così ripercussioni imprevedibili sul processo di acquisizione. Questo fatto rende la qualità dell&#39;immagine dipende dalle caratteristiche di ogni individuo. Di conseguenza, l&#39;impossibilità di applicare questa strategia ad alcuni animali deve essere considerato nella progettazione del protocollo sperimentale. In particolare, un notevole interesse è destinataria emodinamica, grazie al suo ruolo fondamentale nel determinare labiodistribuzione di farmaci o altre molecole esogene dopo somministrazione sistemica 28-29. Le implicazioni applicative nel campo dell&#39;imaging molecolare sono molti, che vanno dalla validazione di agenti di contrasto di imaging blood pool di studi drug delivery immagine monitorata richiedono ultrasuoni indotta BBB apertura 30. Tutti questi scopi di ricerca sarà certamente beneficiare della invasività del protocollo, visto che, senza ulteriori interventi chirurgici, il rischio di morte o di effetti collaterali indesiderati è sostanzialmente ridotto e monitoraggio a lungo termine sugli stessi modelli animali è fattibile. In sintesi, il protocollo presentato consentirà al professionista di immagine in modo efficiente e interpretare correttamente la topografia anatomica e il pattern vascolare normali o patologici tessuti cerebrali in modelli animali di ricerca uso. Mentre i metodi attuali sono principalmente limitati a tomografiche di imaging corticale 25-27, questa impostazione dà l&#39;opportunità to illustrare diversi processi che influenzano profondamente la fisiologia del cervello, fondendo i vantaggi offerti da entrambi immagini Uniti e PA.

Sono necessarie strategie per descrivere minuziosamente le caratteristiche di emodinamica cerebrali nel sistema nervoso centrale di piccoli animali per far avanzare il campo delle neuroscienze 1-3. La tecnica presentata dimostra come eseguire acustico non invasivo e di imaging fotoacustico sul cervello piccolo animale al fine di esaminare la biologia vascolare, disposizioni e la funzione. Tecniche di imaging ottico consentono la localizzazione degli eventi legati all&#39;attività neurale 2,4-5 e contemporaneamente acquisire segnali generati da emoglobina sia negli stati ossigenati e non ossigenato 6. Tuttavia, a causa dell&#39;assorbimento fotonico e dispersione, imaging ottico puro soffre di scarsa risoluzione spaziale e tissutale limitata profondità di penetrazione 7-8. Al contrario, l&#39;acustica offrono la possibilità di effettuare l&#39;imaging profondo con risoluzione spaziale spaziale più alta, ma è ostacolato da speckle e limitato contrasto 9-11. Combinando le caratteristiche della fotonica with ultrasuoni, tecnica fotoacustica migliora sia l&#39;imaging e le potenzialità diagnostiche dei singoli metodi 12-16. L&#39;imaging fotoacustico del cervello ha il potenziale per chiarire domande multiple in neurobiologia, tuttavia, la calotta cranica che protegge naturalmente l&#39;encefalo, drammaticamente limita sia la penetrazione nei tessuti 17-19 fotonica e ultrasuoni. Inoltre, le ossa promuovere dispersione della luce e del suono con conseguente perdita di sensibilità e di immagine aberrazioni 17-18. Di conseguenza, ultrasuoni cervello e di imaging fotoacustico possono essere facilmente eseguiti su animali neonati prima ossificazione 20, ma l&#39;anatomia profonda e fisiologia del cervello adulto sono chiaramente accessibili solo dopo craniotomia 21,22. Purtroppo, l&#39;intervento necessario per la rimozione cranio è tecnicamente difficile ei suoi effetti può essere dannosa per alcuni scopi sperimentali rendendo così difficile per monitorare la progressione della malattia neurale nelstesso animale nel tempo. Pertanto, un metodo non invasivo per immagine profonda biologia cerebrale in piccoli modelli animali è altamente desiderabile. Nella letteratura metodo di fotoni riciclatore 17 è riportato come un modo per ridurre la perdita cellulare e aumentare la trasmittanza attraverso il cranio intatto, migliorando il segnale fotoacustico a rumore (SNR) e il contrasto del bersaglio. Il protocollo presentato si propone di fornire un metodo affidabile per acustica cerebrale sottocorticale e di imaging fotoacustico sulla ricerca uso roditori (in particolare sui ratti) senza chirurgia invasiva. La procedura si basa sull&#39;uso di dispositivi di trasduzione portatili per ultrasuoni ad alta frequenza e di imaging fotoacustico. In contrasto con la tecnologia di imaging tomografico 23, portatile e trasduttori direzionali 24 consentire la selezione di specifiche regioni cranio con spessori ridotti, naturalmente, chiamato fessure o scissures. I principali fessure (forami) presenti sul vertebrato unnimal cranio sono necessarie per individuare i fasci nervosi, serbatoi o altre strutture di raccordo circuiti interni encefalo ad altre parti del corpo. I principali fessure si trovano nelle aperture ossa di diverse dimensioni che possono essere sfruttate come passaggi specifici per ultrasuoni e laser. Tale immagini mirata riduce gli effetti di riflessione delle onde causate da interfacce ossa e aumenta la sensibilità aumentando la profondità di penetrazione delle immagini. In questa prospettiva, il trasduttore di immagini può essere predisposta per essere perpendicolare alle fessure poste sul temporale e sul lato occipitale del cranio (figura 1), al fine di convergere massimo ultrasuoni e raggi fotonici su queste aree. Questo orientamento sia migliora la qualità del segnale e forza il segnale per procedere attraverso un sottile strato osseo rispetto ad altri orientamenti cranici. Pertanto, le onde trasmesse e riflesse subiscono un minor grado di dispersione, consentendo la raccolta di segnali provenienti da intense profondostrati di tessuto. In contrasto con le procedure precedenti, questa impostazione sperimentale richiede testina di rasatura proprio animale, mentre non è necessario un altro intervento chirurgico. Con la proposta di protocollo, l&#39;imaging viene eseguita a relativamente alta risoluzione spaziale, rivelando sia, strutture anatomiche di riferimento specifico e vasi sanguigni più profonde di quanto lo stato attuale dei metodi d&#39;arte, il tutto mentre la pelle di animale e del cranio rimangono intatti. Immagini coronali e assiali unici possono essere acquisiti sfruttando diverse modalità di acquisizione di immagini ad ultrasuoni (B, Power Doppler, Color Doppler, modalità onda pulsata) in parallelo all&#39;imaging fotoacustica. Un repertorio esteso di parametri può essere estratto da queste immagini, consentendo rappresentazione di parenchimale e vascolare a fianco di un intera collezione di caratteristiche che influenzano le dinamiche di circolazione sanguigna. Questo protocollo può essere utilizzato per immagini caratteristiche di base parenchima corticali in Alta Frequenza modalità Ultrasuoni B modalità, le arterie carotidi basilari e interni (BA e ICA, rispettivamente) che compongono il circolo di Willis, cerebrale media (MCA) e altri dettagli dell&#39;apparato circolatorio. Inoltre, il sangue flusso quantificazione, significa velocità di flusso, la descrizione del movimento direzionale e dati di saturazione di ossigeno può essere raccolto dal corticale a regioni cerebrali profonde. Questa nuova strategia ha un grande potenziale per una varietà di applicazioni e soddisfa la necessità urgente di procedure affidabili per rappresentare funzioni cerebrali profonde che sono cruciali in diverse patologie. Inoltre, a causa della sua minima invasività, protocollo presentato può abilitare miriade studi di imaging possibili sul sistema nervoso centrale, in particolare quelli che richiedono monitoraggio a lungo termine o coinvolge modelli animali patologici delicati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="979">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:464px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">High frequency ultrasound and photoacoustic imaging station (VEVO LAZR 2100 system)&#160;</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)&#160;&#160;</td>
			<td>FUJIFILM VisualSonics Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt 
			Sht.dpuf</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ultrasound Transmission Gel (Aquasonic 100)</td>
			<td style="width:180px;">PARKER LABORATORIES INC.</td>
			<td style="width:119px;">01-08</td>
			<td>http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">Sprague-Dawley rats</td>
			<td style="width:180px;">&#160;Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:464px;">Three helathy 6-weeks old Sprague-Dawley rats were purchased by Charles River Laboratories and kept in standard housing (12 h light-dark cycles) with a standard rodent&#160; chow and water available ad libitum. Provided by: http://www.criver.com/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive parenchymal, vascular and metabolic high-frequency ultrasound and photoacoustic rat deep brain imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

Questo metodo permette di immagine sia per strutture di riferimento anatomici e vasi sanguigni specifici relativamente alta risoluzione spaziale, più profondo della tecnica attuale con la pelle degli animali e del cranio intatto. Nelle nostre condizioni sperimentali la profondità del segnale PA è di 4,5 mm e la risoluzione assiale è 75 micron con un FOV 23 x 15,5 cm. Esperimenti con fotoacustico Tomografia modalità 19 hanno mostrato un valore della risoluzione &lt;1 mm. L&#39;intervallo di valori SNR è da 21,6 dB a 23,8 dB (ottenuti da 5 punti diversi selezionati casualmente sul tessuto cerebrale e sfondo). Accostando il trasduttore sul lato temporale cranio, immagini cerebrali possono essere acquisite come sezioni trasversali o coronali sulla base dell&#39;angolo di posizionamento selezionato del trasduttore con un punto di imaging laterale risultante di vista (figura 4). Epidermide, ossa del cranio e materiale parenchimale sono ben rappresentati in ultrasuoni B-Mode, in quanto sono molto diversi in termini di acimpendence oustic (Figura 10). Anche se la loro configurazione dipende dal punto di vista scelto, alcuni siti di riferimento anatomici sulla parenchima sono riconoscibili, come fessure separano cervello porzione interna dalla corteccia e la forma caratteristica di tratto ottico (Figura 10). Inoltre, un gran numero di navi sono visibili sia in modalità di imaging ad ultrasuoni e fotoacustico. Intersezioni caratteristici della carotide interna Arteria (ICA) con altri principali grandi vasi che corrono lungo la superficie laterale esterna del cervello dell&#39;animale possono essere facilmente riconosciuti. Grandi percorsi vascolari, come la ICA, forniscono un massiccio afflusso di sangue per soddisfare l&#39;esigenza neuronale consistente di energia e ossigeno. L&#39;ICA, nasce dalla carotide comune (CCA), corre sulla parte laterale della testa a parecchi millimetri di profondità, va al di là tutti i suoi siti di biforcazione e, infine, raggiunge la porzione di testa frontale. Questo flusso sanguigno principale diffonde tra intermediate dimensioni vasi, prima di essere incanalata in arteriole sempre più piccoli per nutrire finalmente neuroni. Dal punto di vista temporale, è possibile risalire al modello interno dell&#39;arteria cerebrale, che si biforca in navi dirette al lato anteriore e laterale del cervello. Immagini coronali e trasversali possono essere acquisiti con diversa inclinazione del trasduttore rispetto alla direzione dell&#39;asse virtuale unisce l&#39;occhio e il padiglione auricolare dell&#39;animale (Figura 4). Inclinando il trasduttore secondo le proiezioni descritte nella Figura 4, è possibile ottenere immagini di risolte cerebrale media (MCA) che deriva da ICA e ulteriori divide in due o più rami, che finalmente circondano lobi corticali (figure 11 e 12). I migliori sono stati ottenuti per visualizzazioni MCA con l&#39;inclinazione sonda come mostrato nella Figura 4c e ICA come mostrato in Figura 4b. L&#39;elaborazione acustica basata Doppler-rivela piccoli rami, mentre informazioni direzionali della corrente sanguigna è disponibile grazie all&#39;acquisizione Color Doppler (Figura 13). Caratteristica arteria MCA è confermato da onda pulsata tecnica ultrasonica (figure 14 e 15). Segnale fotoacustico di emoglobina contenuta in circolanti globuli rossi può essere rilevato e analizzato per raccogliere dati sul suo stato ossidativo molecolare e per calcolare la saturazione di ossigeno nel sangue (figure 16 e 17). Contenuto di ossigeno ematico può essere correlato ai dati sonori per confermare la discriminazione del sangue arterioso dal sangue venoso. Puntando il trasduttore verso il forame occipitale, la visione viene proiettata sul piano assiale testa (Figura 9) e questo piano dell&#39;immagine può essere regolata su angoli di inclinazione variabile. In questo caso, il punto di imaging vista posteriore del cervello potrebbe essere connotato da una<html> profondità di penetrazione elevata, a causa della grande voce occipitale. Il Circolo di Willis, una caratteristica configurazione dell&#39;imbarcazione nel cervello profondo, può essere localizzato ed esaminato applicando tutte le tecniche di cui sopra. Dell&#39;arteria basilare (BA), in esecuzione sul lato ventrale del cervelletto, alla fine porta a dell&#39;encefalo e si biforca simmetricamente in due rami. Questi due rami sul cervello ventrale sparsi e poi si uniscono di nuovo insieme, quindi la creazione di una struttura ad anello (Circolo di Willis). Questo circolo profondo basale è il seminterrato vascolare da cui tutti i vasi sanguigni di medie dimensioni presentano, come le arterie posteriore, medio e anteriore cerebrale (PCA, MCA e ACA, rispettivamente), che sono i principali effettori di un massiccio afflusso di sangue al cervello . In Color Doppler modalità, l&#39;identificazione di rami medie dimensioni è fattibile e permette la chiara visualizzazione di segmenti vascolari curvi (come la PCA) entrare nel circolo di Willis (Figura 18). nt &quot;&gt; Il tessuto parenchimale cerebrale stato anche registrato con PA in modalità occipitale proiezione (Figura 19) per mostrare la caratterizzazione vascolare nel grafico spettrale (Figura 20). Con questo spettro è possibile distinguere il segnale derivato da vasi arteriosi e venosi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig1highres.jpg" /> Figura 1: Posizione di forami cranio e rispettivo punto di vista per l&#39;acquisizione delle immagini La testa di ratto di profilo (a) ei siti in cui il dispositivo di imaging trasduttore può essere posizionato per essere giustapposti su forame temporali (freccia viola) e il forame occipitale. (freccia gialla) sul profilo (b). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig2highres.jpg" /> Figura 2: lo smaltimento degli animali per un&#39;immagine temporale acquisition. (A) La disposizione dell&#39;animale sul piano di lavoro per l&#39;acquisizione delle immagini: dopo testina di rasatura, l&#39;animale viene posto in posizione prona con il corpo leggermente inclinata su un lato in modo da esporre il lato temporale della testa. Il piano di lavoro può essere eventualmente dotato di un dispositivo di riscaldamento per mantenere il corpo caldo dell&#39;animale durante l&#39;acquisizione. Alcuni rulli di cotone possono essere utilizzati per ottenere la posizione, mentre cerotti adesivi fissare le zampe dei sensori per il monitoraggio dei segni vitali. (B) uno strato consistente di gel ultrasuoni copre l&#39;area della testa su cui verrà posizionato il trasduttore durante l&#39;imaging. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3: i parametri di acquisizione per l&#39;imaging B-Mode. (A) Un screenshot illustrativo che mostra il pannello di segnalazione importanti parametri di acquisizione utilizzati per l&#39;imaging cerebrale in B-MODE. (B) È importante sottolineare che la frequenza di trasmissione è stato impostato su valori bassi (16 MHz) per migliorare la penetrazione nei tessuti degli Stati Uniti. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig4highres.jpg" /> Figura 4: acquisizione dell&#39;immagine trasversale dal forame temporale (a) Il riferimento virtuale asse che unisce il padiglione auricolare per l&#39;occhio e il movimento di inclinazione (freccia rossa) per variare l&#39;inclinazione trasduttore e il piano di acquisizione dell&#39;immagine; (b) antiorario movimento rispetto al. asse di riferimento ear-to-eye e inclinazione variabile del trasduttore di posizione; c) il movimento in senso orario rispetto al riferimento all&#39;asse ear-to-eye e inclinazione variabile del trasduttore di posizione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig5highres.jpg" /> Figura 5: la profondità di messa a fuoco ottimale per USe l&#39;acquisizione di immagini PA. Mentre cerca per l&#39;area di interesse, la profondità di messa a fuoco delle immagini (rappresentato da un triangolo giallo) deve essere fissato a circa 10 mm di profondità dalla sorgente / laser US, al fine di ottenere una prestazione ottimale delle immagini. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig6highres.jpg" width="300" /> Figura 6: i parametri di acquisizione di immagini a colori Modalità Doppler. (A) Prima di iniziare l&#39;acquisizione di immagini a colori in modalità Doppler, l&#39;opzione di gate respirazione può essere attivata, per evitare l&#39;artefatto generato da movimenti respiratori fisiologici. (B) Un schermo esemplificativa mostra importanti parametri di acquisizione impiegate per l&#39;imaging del cervello in Color Doppler Mode. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig7highres.jpg" width="300" /> Figura 7: Acquisizione<html> parametri per l&#39;imaging modalità Doppler alimentazione. Un screenshot illustrativo che mostra importanti parametri di acquisizione utilizzati per l&#39;imaging del cervello in modalità Doppler Potenza. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig8highres.jpg" /> Figura 8: parametri di acquisizione per l&#39;imaging modalità fotoacustico. (A) Il pannello di segnalazione importanti parametri di acquisizione impiegate per l&#39;imaging del cervello in modalità fotoacustico. (B) Acquisizione di uno spettro fotoacustico, basato su un laser di eccitazione che va da 680 nm a 970 nm, con un intervallo di lunghezza d&#39;onda di 5 nm (riferimento come step dimensione). (parametri c) acquisizione impiegati per singola onda Modalità fotoacustico a 750 nm e 850 nm, per la discriminazione dei segnali de-ossigenato e ossigenate emoglobina rispettivamente. <html> fig9highres.jpg &quot;/&gt; Figura 9:. Acquisizione dell&#39;immagine trasversale dal foro occipitale (a) posizionamento trasduttore sul collo dell&#39;animale (freccia gialla) e il piano di imaging risultante trasversale praticamente sezioni testa sulla direzione caudo-rostrale; (b) vista posteriore del posizionamento trasduttore e piano di acquisizione dell&#39;immagine. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig10highres.jpg" /> Figura 10:. Acquisizione B-Mode dal forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti anatomici Epidermide (a), del cranio (b) e parenchima (c) può essere facilmente distinguibili, ma anche altri riferimenti anatomici possono essere rilevate, come la fessura ( d) che circonda la porzione cerebrale profonda ventrale e la caratteristica forma del tratto ottico (e). ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig11highres.jpg" /> Figura 11: Power Doppler acquisizione modalità attraverso forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari MCA alzando dalla ICA sul lato cervello temporale.. Per ottenere questa visione, immagine trasversale è stata acquisita puntando trasduttore sulle forame temporali e ruotandola in senso antiorario. <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig12highres.jpg" /> Figura 12: Power Doppler acquisizione modalità attraverso forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari MCA alzando dalla ICA sul lato cervello temporale.. Per ottenere questa visione, immagine trasversale è stata acquisita puntando trasduttore sulle forame temporali e ruotandolo in senso orario. Figura 13: Color Doppler acquisizione modalità attraverso forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari MCA alzando dalla ICA sul lato cervello temporale.. Informazioni direzionale del flusso sanguigno è espressa mediante una barra di scala colori, distinguendo tra movimenti flusso diretto verso il dispositivo trasduttore e lontano da esso. <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig14highres.jpg" /> Figura 14: acquisizione Wave Mode pulsata attraverso forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari conferma delle proprietà arterie di sangue che circola all&#39;interno dei vasi che sono stati identificati come ipoteticamente arterie:. Wave Mode pulsata fornisce informazioni sulla variazione del flusso velocità, che può essere correlato per effetto pulsazione cardiaca (più intense nelle arterie che nelle vene). <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig15highres.jpg" /> Figura 15: Pulsed onda acquisizione modalità attraverso forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari identificazione da Wave Mode pulsata dei vasi sanguigni, come le vene, in cui l&#39;effetto pulsazione cardiaca sul flusso velocità è trascurabile.. <img alt="Figura 16" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig16highres.jpg" /> Figura 16: Modalità di acquisizione fotoacustico attraverso forame temporali per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari. Vasi interni parenchimali nel lato del cervello temporale visualizzato da B-Mode (sinistra) e Single-wave modalità fotoacustico (a destra). I colori della barra di scala riflettono diversi valori di intensità di segnale fotoacustico, indotte da una eccitazione laser eseguita a una lunghezza d&#39;onda selezionata. In order di individuare le vene e le arterie, le lunghezze d&#39;onda di eccitazione può essere impostato a 750 e 850 nm, che rappresentano i valori per ottenere rispettivamente i picchi di emissione fotoacustico per l&#39;emoglobina deossigenata e ossigenata. <img alt="Figura 17" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig17highres.jpg" /> Figura 17: Modalità di acquisizione fotoacustico attraverso forame temporali di discriminazione emoglobina ossigenata e de-ossigenato. Navi interne nel lato del cervello temporale visualizzato da B-Mode (a sinistra) e la modalità fotoacustico Oxy-Hemo (a destra). I colori della barra di scala riflettono diversi valori percentuali di saturazione di ossigeno dell&#39;emoglobina nel sangue. <img alt="Figura 18" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig18highres.jpg" /> Figura 18: acquisizione Modo colore Doppler attraverso forame occipitale per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari.Segmenti vascolari curve creando la struttura del basamento del Circolo di Willis, che si trova nella parte ventrale del cervello. <img alt="Figura 19" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig19highres.jpg" /> Figura 19: fotoacustico e B-Mode acquisizione attraverso forame occipitale per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari. Nell&#39;immagine in B-mode si possono evidenziare le Strutture Anatomiche individuabili con la PROIEZIONE occipitale e Nella Corrispondente Acquisizione con Modalità fotoacustica con rilevamento spettrale di tra 670 nm a 980 nm (con step di 5 nm). <img alt="Figura 20" src="/files/ftp_upload/52162/52162fig20highres.jpg" /> Figura 20: fotoacustico e B-Mode acquisizione attraverso forame occipitale per l&#39;individuazione di riferimenti vascolari. In this immaginare Vienne rappresentato Lo spettro una corrispondentente alle tre ROI tracciate un Livello del parenchima cerebellare; in Particolare Sono tracciate un Livello di tre Strutture vascolari, la cui tipologia si Differenzia un Livello dell&#39;andamento spettrale (ROI fuxia e celeste corrispondono a Strutture vascolari venose; ROI gialla una corrispondente at a Struttura vascolare arteriosa).

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Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Non invasiva parenchimale, vascolare e metabolica ad alta frequenza ad ultrasuoni e fotoacustico Rat profonda Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

non-invasive-parenchymal-vascular-metabolic-high-frequency-ultrasound

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Views.  University of Turin. The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Video: Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Ricerca

Neuroscienze

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Non-invasive Assessment of Changes in Corticomotoneuronal Transmission in Humans

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor learning. There exists a number of noninvasive electrophysiological methods investigating the excitability and plasticity of this pathway. However, most methods are based on quantification of compound potentials and neglect that the corticospinal pathway consists of many different connections that are more or less direct. Here, we present a method that allows testing excitability of different fractions of the corticospinal transmission. This so called H-reflex conditioning technique allows one to assess excitability of the fastest (monosynaptic) and also polysynaptic corticospinal pathways. Furthermore, by using two different stimulation sites, the motor cortex and the cervicomedullary junction, it allows not only differentiation between cortical and spinal effects but also assessment of transmission at the corticomotoneural synapse. In this manuscript, we describe how this method can be used to assess corticomotoneural transmission after low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation, a method that was previously shown to reduce excitability of cortical cells. Here we demonstrate that not only cortical cells are affected by this repetitive stimulation but also transmission at the corticomotoneuronal synapse at the spinal level. This finding is important for the understanding of basic mechanisms and sites of neuroplasticity. Besides investigation of basic mechanisms, the H-reflex conditioning technique may be applied to test changes in corticospinal transmission following behavioral (e.g., training) or therapeutic interventions, pathology or aging and therefore allows a better understanding of neural processes that underlie movement control and motor learning.

The aim of the present study was to assess changes in transmission at the corticomotoneuronal synapses in humans after repetitive transcranial magnetic stimulation. For this purpose, an electrophysiological method is introduced that allows assessment of pathway specific corticospinal transmission, i.e. differentiation of fast, direct corticospinal pathways from polysynaptic connections.

Valutazione non invasiva dei cambiamenti nella trasmissione corticomoturonale negli esseri umani

The corticospinal pathway is the major pathway connecting the brain with the muscles and is therefore highly relevant for movement control and motor ...

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Modulazione non invasiva e mappatura robotica della Corteccia motoria nel cervello in via di sviluppo

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

Lesioni neuronali mirate per la disconnessione non invasiva dei circuiti cerebrali

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A problem encountered in experimental studies using murine models of SAH is that methods for in vivo monitoring of cerebral vasospasm in mice are lacking. Here, we demonstrate the application of high frequency ultrasound to perform transcranial Duplex sonography examinations on mice. Using the method, the internal carotid arteries (ICA) could be identified. The blood flow velocities in the intracranial ICAs were accelerated significantly after induction of SAH, while blood flow velocities in the extracranial ICAs remained low, indicating cerebral vasospasm. In conclusion, the method demonstrated here allows functional, noninvasive in vivo monitoring of cerebral vasospasm in a murine SAH model.

The aim of this manuscript is to present a sonography-based method that allows in vivo imaging of blood flow in cerebral arteries in mice. We demonstrate its application to determine changes in blood flow velocities associated with vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage (SAH).

Analisi del vasospasmo cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea con ultrasuoni duplex transcranici ad alta frequenza

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A ...

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ultrafast doppler angiography. As brain perfusion is strongly linked to local neuronal activity, this technique allows the whole-brain 3D mapping of task-induced regional activation as well as resting-state functional connectivity, non-invasively, with unmatched spatio-temporal resolution and operational simplicity. In comparison with fMRI (functional magnetic resonance imaging), a main advantage of fUS imaging consists in enabling a complete compatibility with awake and behaving animal experiments. Moreover, fMRI brain mapping in mice, the most used preclinical model in Neuroscience, remains technically challenging due to the small size of the brain and the difficulty to maintain stable physiological conditions. Here we present a simple, reliable and robust protocol for whole-brain fUS imaging in anesthetized and awake mice using an off-the-shelf commercial fUS system with a motorized linear transducer, yielding significant cortical activation following sensory stimulation as well as reproducible 3D functional connectivity pattern for network identification.

This protocol describes the quantification of volumetric cerebral hemodynamic variations in the mouse brain using functional ultrasound (fUS). Procedures for 3D functional activation map following sensory stimulation as well as resting-state functional connectivity are provided as illustrative examples, in anesthetized and awake mice.

Attivazione 3D dell'intero cervello e mappatura della connettività funzionale nei topi utilizzando l'imaging ecografico funzionale transcraniale

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...