Gli autori sono molto grati a Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), che fungeva da narratore, così come Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) e Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) per con il loro aiuto fare il film che accompagna questo manoscritto. Inoltre, vorremmo ringraziare Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) per la lettura critica del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, NIAID.

1 Divisione di celle di produttori per la produzione iniziale di trVLPs <ol><li> Rimuovere media 80-90% confluenti 293 cellule coltivate in 75 centimetri 2 palloni in alta-glucosio modificato mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, e 1x pen / strep (DMEM10 ). Lavare le cellule due volte con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), facendo attenzione a non staccare le cellule, e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA alle cellule. </li><li> Incubare le cellule a temperatura ambiente fino a quando le cellule mostrano una significativa arrotondamento quando osservate al microscopio (circa 30 sec). Staccare le cellule toccando fiasco, e aggiungere 8 ml DMEM10. Risospendere accuratamente le cellule pipettando gentilmente su e giù fino a una sospensione singola cellula si osserva se visto al microscopio. </li><li> Contare le cellule utilizzando un contatore automatico di cellule. Diluire le cellule a 2 x 10 5 cellule per ml in DMEM10. Pipettare 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (4 x 105 cellule per pozzetto). </li><li> Incubare le piastre in un incubatore umidificato coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 2 Trasfezione delle cellule di produttori per la produzione iniziale di trVLPs <ol><li> 24 ore dopo la divisione delle cellule (vedi Figura 5 per una panoramica della tempistica dell&#39;esperimento), pipetta DNA plasmidico 15 (per importi vedi Tabella 1) in una sterile 2 ml esageratamente con punte filtrati. Aggiungere 100 microlitri OptiMEM per bene al DNA. Agitare la miscela brevemente e delicatamente centrifugare i tubi con una microcentrifuga. Se più pozzi devono essere trasfettate con plasmidi identiche, una mastermix per diversi pozzi può essere fatta. </li><li> Agitare brevemente su vortex la fiala con Transit LT1 prima dell&#39;uso. Aggiungere 7,5 ml di transito LT1 per bene al DNA diluito. Vortice delicatamente la miscela, facendo attenzione a non raccogliere il liquido nel coperchio del esageratamente, e incubare per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Mescolare delicatamente la trasfezionecomplesso pipettando su e giù. Aggiungere 100 ml di complessi trasfezione goccia a goccia ad ogni pozzetto. Rock the piastra in avanti / indietro e da un lato all&#39;altro per distribuire i complessi trasfezione. Non agitare la piastra come questo causerà irregolare diffusione dei complessi trasfezione. </li><li> Riportare le cellule per l&#39;incubatrice. </li><li> Dopo 24 ore, rimuovere il surnatante dalle cellule. Aggiungere 4 ml di DMEM con il 5% FBS, 2 mM L-glutammina, 1x pen / strep (DMEM5) alle cellule. Questo passaggio può essere fatto per 3 pozzetti alla volta senza asciugatura dei pozzetti, assumendo i pozzetti contengono campioni identici (altrimenti, a causa della natura auto-amplificazione dei trVLPs in questo sistema, la contaminazione incrociata può diventare un problema e questo passo dovrebbe essere fatto un pozzetto alla volta). </li><li> Riportare le cellule per l&#39;incubatrice. </li></ol> 3 Preparazione delle cellule bersaglio <ol><li> Split 293 celle come descritto nella sezione 1, semina 4 x 10 5 cellule in 2 ml DMEM10 per pozzetto di una6 pozzetti. </li><li> 24 ore dopo la divisione delle cellule bersaglio e 24 ore prima dell&#39;infezione, cellule bersaglio transfect come descritto nella sezione 2 utilizzando il DNA importi nella tabella 1, e 4,5 ml di transito LT1 per pozzetto. </li></ol> 4 L&#39;infezione delle cellule bersaglio e di raccolta di celle Produttore <ol><li> Trasferire il surnatante dalle cellule di produttori di provette da 15 ml. Rimuovere e scartare qualsiasi surnatante residuo utilizzando un tubo di aspirazione. Aggiungere 250 microlitri Glo tampone di lisi per le cellule. </li><li> Surnatante Centrifugare per 5 minuti a 800 xg e temperatura ambiente per cancellare i campioni di detriti cellulari. </li><li> Rimuovere il surnatante da un pozzetto delle cellule bersaglio. Aggiungere con cautela 3 ml di surnatante eliminato cella produttore di celle usando la velocità più lenta pipetta bersaglio. Evitare di pipettare direttamente sulle cellule, al fine di non perturbare il monostrato cellulare. Questo passaggio deve essere fatto un pozzetto alla volta. </li><li> Quando tutti i campioni sono stati transFerred, restituire le cellule bersaglio per l&#39;incubatore per consentire la sedimentazione di trVLPs e l&#39;infezione delle cellule bersaglio. </li><li> Dopo 15 min di incubazione a temperatura ambiente nel tampone di lisi Glo, risospendere le cellule di produttori nel tampone di lisi con una micropipetta impostata su 150 microlitri, e trasferire il campione in un 2 ml esageratamente. A questo punto, lisati possono essere congelati a -80 ° C, o direttamente misurati come descritto nella sezione 6. </li><li> 24 ore dopo l&#39;infezione, rimuovere il surnatante dalle cellule bersaglio. Aggiungere 4 ml per pozzetto DMEM5 alle cellule. Questo passaggio può essere fatto per un massimo di tre pozzi alla volta, se i pozzetti contengono campioni identici (altrimenti, a causa della natura auto-amplificazione dei trVLPs in questo sistema, la contaminazione incrociata può diventare un problema, e questo passo dovrebbe essere svolto un pozzetto alla volta). </li></ol> 5 Raccolta di cellule bersaglio per una infezione Ciclo Unico <ol><li> Se solo dovrebbe essere valutato un solo ciclo infettivo, a 72 ore dopo l&#39;infezione rimuovi tegli surnatante dalle cellule bersaglio utilizzando un tubo di aspirazione. </li><li> Raccogliere le cellule in 250 microlitri Glo tampone di lisi, come descritto nella sezione 4 per le cellule dei produttori. </li></ol> 6. Harvest di colpire le cellule e Passaging continuo di trVLPs <ol><li> Se trVLPs devono essere fatte passare continuamente, preparare una nuova serie di cellule bersaglio come descritto nel capitolo 3, in modo che siano pronti per l&#39;infezione da 72 ore dopo l&#39;infezione della prima serie di cellule bersaglio (vedi Figura 5). </li><li> Infect la nuova serie di cellule bersaglio come descritto nella sezione 4 (utilizzando la prima serie di cellule bersaglio in luogo delle cellule di produttori). </li><li> Ripetere questi passaggi ogni 72 ore. </li></ol> 7 Analisi di Reporter attività <ol><li> Se sono stati congelati lisati cellulari, li scongelare a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni hanno raggiunto la temperatura ambiente prima della misura. </li><li> Scongelare la quantità richiesta (40 microlitri per campione) di tampone Renilla Glo (i idealmente congelatin aliquote) a temperatura ambiente. Assicurarsi che il buffer ha raggiunto la temperatura ambiente prima della misura. </li><li> Aggiungi 1/100 volume di substrato Renilla Glo al tampone Renilla Glo per ottenere Renilla Glo reagente, e mescolare nel vortex. Pipettare 40 ml di reagente Renilla Glo in una piastra a 96 pozzetti bianco. </li><li> Aggiungere 40 ml di campione al reattivo Renilla-Glo. Attendere 10 minuti, quindi misurare i campioni in un luminometro con un tempo di integrazione di 1 sec. </li></ol>

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	<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+perceived+threat+differences+posed+by+filovirus+variants.">Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants.</a> Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).</li><li>Falzarano, D., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+leap+ahead+in+filovirus+therapeutics.">Possible leap ahead in filovirus therapeutics.</a> Cell research. , (2014).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+ebola+vaccines.">Current ebola vaccines.</a> Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).</li><li>Beniac, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+ebola+virus+reveals+a+capacity+for+extensive,+modular+polyploidy.">The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy.</a> PloS one. 7, e29608 (2012).</li><li>Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13,+Unit+13B+13,+High-throughput+screening+of+viral+entry+inhibitors+using+pseudotyped+virus.">Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus.</a> Current protocols in pharmacology. , (2010).</li><li>Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forward+genetic+strategy+reveals+destabilizing+mutations+in+the+Ebolavirus+glycoprotein+that+alter+its+protease+dependence+during+cell+entry.">A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry.</a> J Virol. 84, 163-175 (2010).</li><li>Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+transcription+and+replication+strategies+of+marburg+virus+and+Ebola+virus+by+using+artificial+replication+systems.">Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems.</a> J Virol. 73, 2333-2342 (1999).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenomes,+transcription+and+replication+competent+virus-like+particles+and+beyond:+reverse+genetics+systems+for+filoviruses+and+other+negative+stranded+hemorrhagic+fever+viruses.">Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses.</a> Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).</li><li>Hoenen, T., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+systems+as+tools+for+the+development+of+novel+therapies+against+filoviruses.">Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses.</a> Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+naive+target+cells+with+virus-like+particles:+implications+for+the+function+of+ebola+virus+VP24.">Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24.</a> J Virol. 80, 7260-7264 (2006).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+novel+ebola+virus-like+particles+from+cDNAs:+an+alternative+to+ebola+virus+generation+by+reverse+genetics.">Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics.</a> J Virol. 78, 999-1005 (2004).</li><li>Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+matrix+proteins+of+Ebola+virus+contribute+to+the+regulation+of+viral+genome+replication+and+transcription.">Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription.</a> Virology. 403, 56-66 (2010).</li><li>Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+(EBOV)+VP24+inhibits+transcription+and+replication+of+the+EBOV+genome.">Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome.</a> J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).</li><li>Spiegelberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-specific+recruitment+of+filovirus+ribonucleoprotein+complexes+into+budding+particles.">Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles.</a> J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).</li><li>Watt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lifecycle+modeling+system+for+Ebola+virus+shows+a+genome+length-dependent+role+of+VP24+on+virus+infectivity.">A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity.</a> J Virol. , (2014).</li><li>Kondratowicz, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+immunoglobulin+and+mucin+domain+1+(TIM-1)+is+a+receptor+for+Zaire+Ebolavirus+and+Lake+Victoria+Marburgvirus.">T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> J Virol. 86, 11779-11788 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il test trVLP tetracistronic descritto in questo manoscritto permette la modellazione del ciclo di vita del virus Ebola su più cicli infettivi. È importante sottolineare che le trVLPs prodotte in questo sistema non contengono le informazioni genetiche per le proteine ​​del nucleocapside NP, VP35, VP30, e L, che insieme costituiscono quasi il 60% del genoma del virus Ebola e sono essenziali per la replicazione virale. Piuttosto, queste proteine ​​devono essere fornite in cellule bersaglio in trans da plasmidi di espressione, e qualsiasi infezione delle cellule non esprimono tutti e 4 di queste proteine ​​è abortivo. È importante sottolineare che non vi è alcuna evidenza di ricombinazione genetica per filovirus, e non ci sono regioni omologhe condivise tra gli minigenome tetracistronic ed i plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside. Pertanto, non vi è alcuna prova né pratico né alcuna base teorica che potrebbe prevedere la possibilità di generare pieno lunghezza genomi di virus Ebola che potrebbero quindi potenzialmente causarela produzione di virus Ebola infettivi, rendendo questo sistema sicuro per l&#39;uso in condizioni BSL2. Ci sono due passaggi critici nel test trVLP tetracistronic che sono influenzati dalle condizioni sperimentali, vale a dire la produzione di trVLPs, e l&#39;infezione di cellule bersaglio con questi trVLPs. Produzione di trVLPs dipende da elevati livelli di replicazione minigenome e trascrizione, che a sua volta dipende da una elevata efficacia di trasfezione. Efficacia trasfezione può essere facilmente valutata includendo un controllo -L, in cui è scambiato il plasmide di espressione di L per un&#39;espressione plasmide codificante eGFP. Tassi di trasfezione in queste condizioni dovrebbero superare il 50% mediante ispezione con un microscopio a fluorescenza 24 ore dopo la trasfezione. Inoltre, le cellule devono essere liberi di micoplasmi, poiché nella nostra esperienza di contaminazione da micoplasma altera drasticamente la replicazione e la trascrizione minigenome (dati non pubblicati). Grazie alla loro elevata transfectability 293 cells sono la linea cellulare di scelta per i saggi trVLP; tuttavia, queste cellule sono relativamente poco sensibili (anche se non completamente rifrazione) per infezione da virus Ebola 16. Espressione di un fattore di attaccamento come Tim-1 aumenta l&#39;infezione di 293 cellule con trVLPs circa 100 volte, ed è cruciale per il successo di questo sistema su più passaggi. Mentre trVLPs tetracistronic non sono auto-replicante per conto proprio, sono auto-replicante in cellule che esprimono le proteine ​​del nucleocapside. Come tale, le precauzioni devono essere prese per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti contenenti diverse trVLPs (ad esempio, con differenti mutazioni nel minigenome). Da un punto di vista più tecnico, a causa della grande differenza tra segnali positivi e negativi in ​​questo test (circa 4 log), cross-talk tra i campioni quando si misura l&#39;attività luciferasi può essere un problema; Tuttavia, questo può essere facilmente evitato lasciando un pozzetto vuoto tra ogni campione nellaPiastra a 96 pozzetti utilizzata per misurare l&#39;attività della luciferasi. Ci sono una moltitudine di possibili applicazioni per trVLPs tetracistronic. Ovviamente, essi sono adatti per studiare l&#39;ingresso di particelle Filovirus, dal momento che trVLPs infettive hanno la tipica struttura filiforme di filovirus infettive 14, e contengono gli stessi componenti virali come particelle Filovirus. È importante sottolineare che non contengono componenti di altri virus, come è il caso quando si utilizzano virioni pseudotyped o particelle virus-simili, come ad esempio particelle retrovirali recanti GP 1,2, o virus ricombinanti, come il virus della stomatite vescicolare ricombinante che esprime GP 1,2 . Il requisito per fattori di fissaggio utilizzando 293 cellule come cellule bersaglio in questo sistema può essere sfruttata per schermo e per indagare il ruolo di tali fattori di attaccamento, mentre i ruoli di altri fattori cellulari, come quelli coinvolti nella replicazione del genoma e trascrizione nonché morfogenesi e budding, può essere indagato utilizzando la tecnologia RNAi. L&#39;effetto di mutazioni in proteine ​​virali sul ciclo di vita del virus può anche essere studiato, anche se si deve tenere a mente che, mentre VP40, GP 1,2, e VP24 sono espressi dopo la trascrizione virale, espressione delle altre proteine ​​virali si ottiene dall&#39;espressione plasmidi, in modo che gli effetti dovuti alla sovraespressione di queste proteine ​​devono essere presi in considerazione. Inoltre, occorre prestare attenzione che le mutazioni nel minigenome non alterano significativamente la lunghezza della minigenome, in quanto attività di giornalista è direttamente influenzata dalla minigenome lunghezza 15. Infine, dal momento che minigenomes tetracistronic sono analoghi genoma virale che portano geni virali, e vengono replicati dal complesso polimerasi virale, dovrebbe anche essere possibile studiare l&#39;evoluzione di questi geni in risposta alle mutazioni in condizioni BSL2. Così, mentre ulteriori studi sono ancora necessari in questa direzione, dovrebbe essere possibile, ad esempio, per introdurre subottimalemutazioni nei geni all&#39;interno delle minigenome e poi trVLPs passaggio fino mutazioni gratuiti emergono. Una limitazione del dosaggio trVLP tetracistronic che deve essere tenuto a mente è il fatto che, mentre i modelli la maggior parte del ciclo di vita del virus, la trascrizione primaria nelle cellule bersaglio non è modellato da questo sistema, dal momento che le cellule bersaglio devono esprimere le proteine ​​del nucleocapside a trans in modo che i trVLPs a replicare. Se la trascrizione primaria deve essere valutato, è possibile utilizzare ingenui cellule bersaglio 10; tuttavia, in questo caso nessun replicazione del genoma avviene nelle cellule bersaglio, e nessun ulteriore trVLPs infettive vengono prodotti, interrompere l&#39;infezione. Questo è un problema principale che non può essere superato senza rendere le trVLPs completamente auto-replicante, includendo i geni per le proteine ​​del nucleocapside nel minigenome, che di fatto li trasformano in infettive virus Ebola ricombinanti. Infatti, ebolun virus che esprimono luciferasi o altri giornalisti sono stati generati e possono essere utilizzati per valutare e studiare la replicazione del genoma e trascrizione 17,18; tuttavia, il loro uso è limitato ai laboratori BSL4. Inoltre, deve essere tenuto a mente che, mentre VP40, GP 1,2, e VP24 sono espressi da un analogo genoma virale, la loro posizione nella minigenome (2 °, 3 ° e 4 ° unità trascrizionale) non è identico a la loro posizione nel genoma virale (3 °, 4 ° e 6 ° unità trascrizionale), che potrebbe influenzare i loro livelli di espressione assoluti, e anche i loro livelli di espressione relativa l&#39;uno rispetto all&#39;altro. Nel complesso, il saggio trVLP tetracistronic rappresenta il sistema di modellazione del ciclo di vita più completa per il virus Ebola ad oggi disponibili, e permette la modellazione di replicazione del genoma e la trascrizione, la morfogenesi delle particelle e in erba, così come attaccamento e encercare all&#39;interno delle cellule bersaglio su più cicli infettivi. Come tale, ha un enorme potenziale per l&#39;uso nelle indagini sulla biologia del virus Ebola in condizioni BSL2.

Virus Ebola sono l&#39;agente eziologico di una grave febbre emorragica nell&#39;uomo e nei primati non umani con tassi caso di mortalità fino al 90% in epidemie umane 1. Mentre ci sono stati progressi significativi negli ultimi anni nello sviluppo di vaccini e trattamenti specifici (recensiti 2,3), questi non sono approvati per uso umano. Particelle del virus Ebola hanno un caratteristico aspetto filiforme con una lunghezza di circa 1 micron e un diametro di 96-98 nm 4. Si forma un nucleocapside il nucleo delle particelle virali e composto da 1) il non-segmentato genoma RNA a singolo filamento negativo-senso, che codifica i geni 7 Ebolavirus (Figura 1), 2) la nucleoproteina NP, che encapsidates il genoma, 3 ) il complesso polimerasi virale costituito dalla polimerasi L e VP35 suo cofattore, e 4) l&#39;attivatore trascrizionale VP30. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la proteina VP24 è anche associato con nucleocapsides 4. Il nucleocapside è circondato dallo spazio matrice in cui la proteina di matrice VP40, che è responsabile per la morfogenesi e la gemmazione dei virioni, si trova. Particelle virali sono ulteriormente avvolti, e inclusi in quella busta è l&#39;unica proteina di superficie GP 1,2, che è responsabile per il fissaggio virione e voce. Lavora con virus Ebola infettivi deve essere eseguita in un laboratorio di massimo contenimento sotto livello di biosicurezza (BSL) 4 condizioni, che limita questo lavoro per un paio di strutture in tutto il mondo. Al fine di studiare la biologia di questi virus o per sviluppare nuove terapie in condizioni BSL2, i ricercatori si basano sia su iperespressione delle proteine ​​ricombinanti del virus Ebola, o sui sistemi di modellazione del ciclo di vita, entrambi i quali possono essere lavorato con in assenza di virus Ebola infettivo. Espressione ricombinante di proteine ​​del virus Ebola si sia raggiunta da plasmidi di espressione o vettori virali. Un caso particolare di questa strategia è ilgenerazione di virioni o particelle virus-simili sulla base di virus diversi dal virus Ebola (più comunemente retrovirus o stomatite vescicolare virus) in presenza di ricombinante espresso GP 1,2, che porta alla generazione di particelle pseudotyped, che può essere utilizzato per studiare il processo di inserimento di filovirus e schermo per gli inibitori di ingresso 5. In alternativa, i virus ricombinanti (ad esempio, virus della stomatite vescicolare) che codificano il virus Ebola GP 1,2 invece del loro glicoproteina possono essere generati e utilizzati per lo studio entry virus sotto livello di biosicurezza 2 Condizioni di 6. Sistemi di modellazione del ciclo di vita sono forme di sistemi di genetica inversa che caratterizzano l&#39;uso di analoghi troncati genoma del virus Ebola (minigenomes), che vengono inizialmente prodotti a partire da cDNA e poi replicati e trascritti da proteine ​​del virus Ebola fornite in trans. Il primo sistema minigenome per il virus Ebola è stato sviluppato più di 15 anni fa 7, E da allora è stato utilizzato per lo studio del genoma replicazione e la trascrizione (rivisto in 8,9), il virus Ebola. In questo sistema un minigenome monocistronic costituito da un singolo gene reporter affiancato dal terminale regioni non codificanti del genoma del virus Ebola (chiamato il capo e rimorchio) (Figura 1) è espresso in cellule di mammifero (solitamente mediante trascrizione utilizzando T7 RNA polimerasi) insieme con le proteine ​​virali L, VP35, VP30 e NP. Il minigenome è encapsidated da NP, e poi replicato e trascritto dalle altre proteine ​​del nucleocapside che utilizzano segnali cis-acting localizzate nel leader e rimorchio, che conduce all&#39;attività giornalista che riflette questi due aspetti del ciclo di vita del virus (Figura 2). Al fine di modellare ulteriori passaggi del ciclo di vita virale, la trascrizione e la replicazione-competenti particelle virus-simili sistemi (trVLP) sono stati sviluppati, che si basano su sistemi minigenome classici, ma presentano l&#39;unaespressione ltre delle altre proteine ​​virali VP24, VP40 e GP 1,2 da plasmidi di espressione 10,11. La presenza di VP40 porta alla formazione di trVLPs, recanti GP 1,2 sulla loro superficie, e portare un nucleocapside-minigenome contenente al suo interno. Questi trVLPs possono essere utilizzati per infettare cellule bersaglio, che sono stati o pretransfected con plasmidi di espressione per L, VP35, VP30 e NP, per facilitare la replicazione e la trascrizione del minigenomes portati nelle cellule bersaglio all&#39;interno trVLPs 11, o sono cellule bersaglio naive (cioè senza espressione plasmide-driven delle proteine ​​del virus Ebola) 10. Ciò si traduce in attività di giornalista nelle cellule bersaglio, che riflette la replica dei minigenomes nelle cellule produttori, morfogenesi e la gemmazione di trVLPs, loro entrata in cellule bersaglio, e 1) nel caso di cellule bersaglio pretransfected anche del genoma replicazione e la trascrizione secondario ( cioè trascrizione di proteine ​​virali produced nelle cellule bersaglio) nelle cellule bersaglio, o 2) nel caso di cellule bersaglio naive anche la trascrizione primaria (cioè trascrizione di proteine ​​virali portati all&#39;interno delle cellule bersaglio entro trVLPs) (Figura 3). È importante sottolineare che questi sistemi sono solo stati utilizzati per modellare un singolo ciclo infettivo, e si basano su sovraespressione di tutte le proteine ​​virali, che nel caso di VP24 e VP40 è particolarmente problematico, dal momento che queste proteine ​​hanno dimostrato di essere forti regolatori negativi della replicazione del genoma e la trascrizione quando sovraespresso da plasmidi 12,13. Inoltre, le preparazioni trVLP prodotte in questi sistemi contengono un&#39;alta percentuale di particelle non infettive, ponendo sfide per l&#39;analisi biochimica di trVLPs infettive 14. Per superare questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato un sistema minigenome tetracistronic che, oltre ad un gene reporter, contiene anche i geni che codificano per VP40, GP 1,2 eVP24 (Figura 1). Simile al sistema minigenome monocistronic classico, questo sistema porta alla produzione di trVLPs che possono infettare cellule bersaglio (Figura 4) 15. Tuttavia, a differenza del sistema minigenome classica, VP40, GP 1,2, e VP24 sono prodotte dopo genoma virale trascrizione piuttosto che essere sovraespresso da plasmidi. Come risultato, la cinetica ei livelli di espressione di queste proteine ​​molto più strettamente imitano quelli trovati durante il ciclo di vita virale, e di conseguenza il rapporto di infettivi per trVLPs non infettive è aumentata di circa 500 volte in questo sistema 15. Inoltre, con questo sistema è stato possibile continuo passaggio tetracistronic trVLPs-minigenome contenenti, modellando molteplici cicli infettivi. Come tale, trVLPs tetracistronic sono attualmente il sistema di modellazione del ciclo di vita più completo a disposizione per studiare la biologia del virus Ebola in condizioni BSL2. Qui, fornendo informazioni dettagliate sull&#39;utilizzo of tale sistema, nonché sui risultati attesi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

Virus Ebola causano gravi febbri emorragiche nell&#39;uomo e nei primati non umani, con casi di tassi di mortalità fino al 90%. Non esistono vaccini autorizzati o trattamenti specifici per la malattia causata da questi virus, e lavorare con virus Ebola infettivi è limitato al livello di biosicurezza 4 laboratori, limitando notevolmente la ricerca su questi virus. Sistemi di modellazione del ciclo di vita del modello del ciclo di vita del virus sotto il livello di biosicurezza 2 condizioni; Tuttavia, fino a poco tempo tali sistemi si sono limitati a entrambi i singoli aspetti del ciclo di vita del virus, o un singolo ciclo infettivo. Minigenomes Tetracistronic, che consistono di virus Ebola regioni non codificanti, un gene reporter, e tre geni del virus Ebola coinvolti nella morfogenesi, erba, e l&#39;entrata (VP40, GP 1,2, e VP24), possono essere utilizzati per produrre la replicazione e la trascrizione -competent particelle virus-simili (trVLPs) contengono queste minigenomes. Questi trVLPs possono continuamente infettare le cellule che esprimono l&#39;Ebolaproteine ​​responsabili per la replicazione del genoma e la trascrizione, che ci permette di modellare in modo sicuro più cicli infettivi sotto livello di biosicurezza 2 Condizioni di virus. È importante sottolineare che i componenti virali di questo sistema sono esclusivamente derivati ​​da virus Ebola e non da altri virus (come, per esempio, il caso in sistemi che utilizzano virus pseudotyped) e VP40, GP 1,2 e VP24 non sono iperespresso in questo sistema , il che rende l&#39;ideale per studiare la morfogenesi, in erba e l&#39;ingresso, anche se altri aspetti del ciclo di vita del virus, come la replicazione e la trascrizione del genoma possono essere modellati con questo sistema. Pertanto, il dosaggio trVLP tetracistronic rappresenta il sistema di modellazione del ciclo di vita più completo disponibile per i virus Ebola, e ha un enorme potenziale per l&#39;uso nelle indagini sulla biologia dei virus Ebola in futuro. Qui, fornendo informazioni dettagliate sull&#39;uso di questo sistema, nonché sui risultati attesi.

Trasfezione di cellule 293 produttori con plasmidi di espressione che codifica le proteine ​​del virus Ebola nucleocapside NP, VP35, VP30, e L, un minigenome tetracistronic e gli accessori T7 polimerasi risultati in minigenome la replicazione e la trascrizione e l&#39;attività giornalista che è facilmente rilevabile a 72 ore (Figura 6 ). È importante sottolineare che l&#39;attività di giornalista ha osservato (10 5,6 unità di luminescenza relativa (RLU)) supera quello di un controllo negativo in cui l&#39;espressione plasmide codifica L è stato omesso dalla trasfezione (10 3 RLU) da più di 2 registri. Il basso livello di attività osservata anche in assenza di L è molto probabilmente dovuto ad un promotore criptico nel plasmide minigenome. Le cellule bersaglio infettate con trVLPs dal supernatante di cellule di produttori effettivamente mostrano alquanto aumentati livelli di attività giornalista rispetto alle cellule di produttori, e raggiungono valori tra 10 6 e 10 7 RLU, a seconda del passaggio. Al contrario, wuando il surnatante delle cellule di produttori di controllo -L è diversi passaggi su cellule bersaglio (che esprimono tutte le proteine ​​del nucleocapside, tra cui L), attività di giornalista non supera il rumore del luminometro (circa 10 2 RLU) di sfondo. Il test trVLP tetracistronic può essere utilizzato per studiare il ciclo di vita del virus Ebola. Per esempio, infezione di cellule 293 con trVLPs dipende dalla presenza di fattori di attaccamento come Tim-1 16, che deve essere fornita in trans in queste cellule. Di conseguenza, in un saggio trVLP tetracistronic un calo dell&#39;attività giornalista nelle cellule bersaglio di circa 100 volte è osservata in assenza di Tim-1 (Figura 7A). Il ruolo delle proteine ​​specifiche (virali o cellulari) nel ciclo di vita del virus può anche essere valutata utilizzando la tecnologia RNAi insieme con questo approccio. A titolo di esempio, RNAi-mediata down-regulation dei risultati L in un calo dell&#39;attività giornalista di circa 100 volte, riflettendo il ruolo centrale di L inla replicazione e la trascrizione (Figura 7B) 7. Inoltre, è possibile modificare direttamente la minigenome per valutare l&#39;effetto delle mutazioni sul ciclo di vita del virus. Ad esempio, quando VP24-espressione del minigenome è abolita con l&#39;introduzione di 3 codoni di stop immediatamente a valle del codone di inizio, l&#39;attività giornalista in cellule di produttori non è radicalmente cambiata; Tuttavia, l&#39;attività reporter cellule bersaglio si riduce di circa 20 volte dopo un passaggio, e 400 volte dopo due passaggi, indicando un ruolo di VP24 nella produzione di trVLPs infettive (Figura 7C) 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Struttura del genoma del virus Ebola, nonché minigenomes monocistronic e tetracistronic. Regioni codificanti per la proteina del virus Ebola sono mostrati in rosso (NP,VP35, VP30, e L), giallo (VP40 e VP24) o blu (1,2 cassette GP). Regioni non codificanti (NCR) sono mostrati in verde, con le regioni e leader del rimorchio indicati. Il pedice indica che NCR virale è stato usato per unire le regioni codificanti. La regione codificante per il reporter (rep) è mostrato in viola. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Monocistronic test minigenome. Cellule vengono trasfettate con plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside del virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigenome monocistronic (mg) e la polimerasi T7. Il minigenome è inizialmente trascritto dalla polimerasi T7 (a) in un RNA minigenome unencapsidated nello stesso orientamento del genoma virale (vRNA), che viene poi encapsidated da NP (b). Questo encapsidated vRNA viene replicato tramite un RNA minigenome complementare (cRNA) intermediata (c), e poi trascritto in mRNA Reporter (d) che vengono tradotti in proteine ​​giornalista (e). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 trVLP test con un minigenome monocistronic. Cellule vengono trasfettate con plasmidi di espressione per i componenti del dosaggio minigenome (i virus di Ebola nucleocapside proteine ​​NP, VP35, VP30, L, una minigenome monocistronic e la polimerasi T7) e VP40, GP 1 , 2 e VP24. Ciò porta alla formazione di trVLPs che incorporano nucleocapsidi-minigenome contenente (f). Questi trVLPs possono poi infettare le cellule bersaglio (g), che sono o pretransfected con plasmidi di espressione per NP, VP35, VP30, e L (in alto), con conseguente replicazione e trascrizione secondario (d) conduce all&#39;espressione giornalista (e), o ingenuo cellule bersaglio (in basso), con conseguente trascrizione primaria del minigenomes (h), che può consentire di espressione giornalista (e). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 trVLP test con un minigenome tetracistronic. Cellule vengono trasfettate con plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside del virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigenome tetracistronic (mg) e la polimerasi T7. Trascrizione iniziale (a), incapsidazione (b), la replicazione del genoma (c) e la trascrizione (d) e traduzione (e) verificarsi in un test minigenome monocistronic. Tuttavia, oltre al giornalista mRNA, mRNA per VP40, GP 1,2 e VP24 sono anche trascritto dal minigenome tetracistronic, causando la formazione di trVLPs (f). Queste trVLPs infettare le cellule bersaglio che sono state pretransfected con plasmidi di espressione per le proteine ​​del nucleocapside NP, VP35, VP30 e L, così come il virus Ebola cellulareFattore attaccamento Tim-1, con conseguente replicazione del genoma e trascrizione, e la produzione di trVLPs che possono essere utilizzati per infettare cellule bersaglio freschi. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Timing di un test trVLP tetracistronic per 3 passaggi consecutivi. I giorni di semina cellule (s), trasfezione le cellule (t), infettare le cellule (i), cambiamento medio (c) e la raccolta delle cellule e trVLPs (h) sono indicato per tre passaggi consecutivi (indicato dalle frecce). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 tipici livelli di attività giornalista osservata in un test di trVLP tetracistronic. Un test trVLP tetracistronic è stata effettuata più di 5 passaggi a seguito del protocolo delineato in questo manoscritto. Come controllo negativo l&#39;espressione plasmide codifica L è stato omesso (-L) dalla trasfezione delle cellule di produttori p0. Cellule bersaglio in passaggi da P1 a P5 sono state trasfettate con plasmidi di espressione per tutte le proteine ​​del nucleocapside, tra cui L. Il rumore del luminometro fondo è indicato come una linea tratteggiata. Medie e deviazioni standard dei 4 repliche biologiche da 3 esperimenti indipendenti sono mostrati. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 Valutare l&#39;impatto di vari fattori virali e cellulari sulla ciclo di vita virale utilizzando trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 come fattore allegato. Cellule bersaglio che sono stati pretransfected con plasmidi di espressione che codificano per le proteine ​​del nucleocapside e con o senza un plasmide codificante per Tim-1 (descritto in 15) sono stati infettati con tettrVLPs racistronic. 72 ore dopo l&#39;infezione attività di giornalista nelle cellule bersaglio P1 è stato determinato. Medie e deviazioni standard delle 4 repliche biologiche da 4 esperimenti indipendenti sono mostrati. (B) Effetto di RNAi atterramento di L sulla replicazione e la trascrizione del genoma. Cellule bersaglio che sono stati pretransfected con plasmidi di espressione per i componenti nucleocapside, Tim-1 e miRNA diretti contro L (anti-L) o una proteina estranea (anti-GFP) (descritto in 15) sono stati infettati con trVLPs tetracistronic. 72 ore dopo l&#39;infezione attività di giornalista nelle cellule bersaglio P1 è stato determinato. Medie e deviazioni standard delle 5 repliche biologiche da 2 esperimenti indipendenti sono mostrati. (C) Effetto di mutazioni nel minigenome su trVLP infettività. Un test trVLP tetracistronic è stata eseguita utilizzando una wild-type minigenome (4cis-WT) o un minigenome in cui 3 codoni di stop erano state introdotte subito dopo il codone di inizio di VP24, abolire o esprimendof questa proteina ma introduce solo modifiche minime al minigenome in quanto riguarda la lunghezza, composizione in acidi nucleici, strutture secondarie ecc attività Reporter in p0, p1 e p2 è stata misurata 72 ore dopo la trasfezione / infezione. Mezzi e deviazioni standard di 3 repliche biologiche da 3 esperimenti indipendenti sono mostrati. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> Celle di produttori (P0) </td><td style="width:180px;"> Le cellule bersaglio (p1 e superiori) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td height = &quot;19&quot; style = &quot;height: 19px;&quot;&gt; pCAGGS-L </td><td> 1.000 </td><td> 1.000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNA-RLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-TIM1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> Tabella 1 DNA ammonta per la trasfezione. La quantità di ciascun plasmide richiesto per la trasfezione di cellule di produttori e bersaglio è mostrata in ng per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Tutti i plasmidi sono descritti in Watt et al 15.

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Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Lavora con virus Ebola infettivi è limitato al livello di biosicurezza 4 laboratori. Tetracistronic-minigenome contenente la replicazione e la trascrizione del virus-competente come particelle (trVLPs) rappresentano un sistema di modellazione del ciclo di vita che ci permette di modellare in modo sicuro più cicli infettivi sotto livello di biosicurezza 2 condizioni, basandosi esclusivamente sulle componenti del virus Ebola.

Modellazione il ciclo di vita Ebola Virus Sotto livello di biosicurezza 2 condizioni con particelle virus-simili contenenti Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Lavora con virus Ebola infettivi è limitato al livello di biosicurezza 4 laboratori. Tetracistronic-minigenome contenente la replicazione e la trascrizione del virus-competente come particelle (trVLPs) rappresentano un sistema di modellazione del ciclo di vita che ci permette di modellare in modo sicuro più cicli infettivi sotto livello di biosicurezza 2 condizioni, basandosi esclusivamente sulle componenti del virus Ebola. 

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

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Immunologia e infezioni

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Analisi della accessibilità al solvente dei residui di cisteina in<em&gt; Mais Rayado Fino virus</em&gt; Particelle virus-simili Prodotto in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Piante e Cross-linking di peptidi a VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) BSL-4 di laboratorio: 1. livello di biosicurezza 4 Suit Laboratorio Suite entrata e di uscita Procedure

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produzione di particelle pseudotipizzate per studiare la patogenicità coronavirus in un ambiente di livello 2 di biosicurezza

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...