Vorremmo ringraziare lo staff e gli scienziati a SBI per il loro supporto nello sviluppo e nella sperimentazione di questi protocolli.

1. Trasfezione di cellule 293TN con i plasmidi di imballaggio e il costrutto di espressione <ol><li> Seme 7,0-8,0 x 10 6 cellule per 293TN 15 cm 2 piastra di coltura in 20 ml di terreno di coltura contenente DMEM supplementato con 4 mM L-glutammina, 4,5 g / l glucosio, e siero fetale bovino (10%) senza antibiotici. Crescere per 18-24 ore a 37 ° C con 5% CO 2 in modo che la densità cellulare raggiunge il 60-80% di confluenza al momento della transfezione. In alcuni casi, potrebbe essere necessario piastre semi diversi di cellule per ottenere un alto titolo sufficiente per la trasduzione delle cellule bersaglio. </li><li> Per ogni piatto di cellule, aggiungere 1,6 ml di siero-free DMEM ad un tubo sterilizzato 2 ml Eppendorff. Aggiungere 45 microlitri pPACKH1 o pPACKF1 e 4,5 microgrammi di costruire il tuo lentivector al DMEM e mescolare pipettando su e giù. </li><li> Aggiungere 55 pl di PureFection nel tubo stesso. Vortex per 10 secondi. Incubare il plasmide-PureFection DMEM f miscela a temperatura ambienteo 15 min. </li><li> Aggiungere il plasmide-PureFection DMEM miscela alla piastra di coltura tissutale e goccia a goccia e agitare delicatamente per disperdere in modo uniforme in tutto il piatto. Ritorna il piatto per l&#39;incubatore e di crescere a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Non è necessario modificare il media dopo trasfezione. Se il costrutto lentivector esprime un gene che codifica una proteina fluorescente GFP come, controllare le cellule sotto il microscopio 12-24 ore dopo la trasfezione. Dovreste essere in grado di vedere le cellule&gt; 90% GFP-positive, indicando che la transfezione ha avuto successo. </li><li> Raccogliere il supernatante di coltura cellulare dopo 48 e 72 ore in una provetta da centrifuga 50 ml sterile. Il supernatante di coltura cellulare contiene ora particelle infettive pseudoviral. (Seguire le linee guida consigliate per lavorare con classe di sicurezza BSL-2.) Centrifugare a 1500 xg per 15 minuti a temperatura ambiente per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante virale in una nuova provetta, assicurando non disturbare il pellet. </li><li> 293TN cellule che sono state usate per il confezionamento virale devono essere smaltiti in un contenitore rischio biologico e non devono essere utilizzati per cicli di confezionamento virale. </li></ol> 2. Concentrazione del surnatante virale <ol><li> Aggiungere 1 volume di freddo (4 ° C) PEG-it soluzione precipitazioni Virus per ogni 4 volumi di lentivirale contenente particelle supernatante. Precipitazione di particelle lentivirali da grandi volumi può essere realizzato con Corning 250 provette per centrifuga in polipropilene ml. Mescolare la soluzione invertendo i tubi diverse volte, ma non vortex la miscela. </li><li> Refrigerare la soluzione a 4 ° C per almeno 12 ore (fino a 4 giorni è accettabile). Non agitare o ruotare i tubi durante la fase di refrigerazione. </li><li> Centrifugare il supernatante / PEG-si miscela a 1.500 xg per 30 minuti a 4 ° C. Dopo centrifugazione, le particelle lentivirali apparirà come un beige o bianco pellet sul fondo del tubo. Versare il supernatant. </li><li> Eliminare tutte le tracce di liquido per aspirazione, facendo attenzione a non disturbare le particelle precipitate lentivirali nel pellet. Tracce di residuo PEG-verrà diluire il virus (riducendo così il titolo), ma non compromette l&#39;integrità delle cellule bersaglio dal PEG-è inerte e non tossico. </li><li> Risospendere e combinare le particelle lentivirali in 1/100 del volume originale usando freddo (4 ° C), fosfato sterile o soluzione salina tamponata con DMEM contenente 25 mM di tampone HEPES. </li><li> Aliquotare in fiale sterili criogenici e conservare a -70 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Titolazione virale e trasduzione delle cellule bersaglio <ol><li> Si consiglia di titolazione delle particelle lentivirali prima trasduzione celle di destinazione d&#39;interesse e calcolando la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per le cellule bersaglio per la coerenza tra esperimenti. Per la titolazione virale, si consiglia di utilizzare le cellule HT1080 come facile da infettare positivo linea di controllo. Plfacilità di notare che il protocollo di titolazione coinvolge trasduzione HT1080 cellule con una piccola aliquota delle particelle lentivirali che hai confezionato. Una volta che il titolo è noto, le cellule bersaglio d&#39;interesse può anche essere trasdotti con le particelle prodotte lentivirali. Un consiglio protocollo titolazione è disponibile all&#39;indirizzo: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Piatto 50.000 cellule bersaglio d&#39;interesse per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in terreni di coltura delle cellule. Utilizzare i mezzi di comunicazione che le cellule sono normalmente coltivate dentro crescere le cellule durante la notte nelle loro specifiche condizioni di coltura. Le cellule devono essere tra il 50 al 70% confluenti il ​​giorno di trasduzione. </li><li> Il giorno di trasduzione, aspirare i mezzi dalle cellule. Combinare mezzo di coltura con TransDux ad una concentrazione finale di 1 x (per esempio, 2,5 TransDux pl a 500 pl di mezzo di coltura). Poi trasferire il TransDux ce-ll mezzo di miscela di coltura in ciascun pozzetto. </li><li> Pipettare il volume appropriato di virus che corrisponde alla MOI ottimale per le cellule bersaglio in ciascun pozzetto. Se la MOI ottimale è sconosciuto, si consiglia di provare una gamma di MOI diversi (ad esempio un MOI di 1, 2 e 5 per facili da infettare-colture tissutali, e un MOI di 1, 10 e 20 per più di difficile -infettare le cellule primarie). Se la concentrazione delle particelle lentivirali non è nota (come determinato mediante un protocollo di titolazione virus), diversi volumi di virus può essere processato, come pl 1, 2 e 5 di virus. Virus può rimanere in contatto con le cellule bersaglio fino a 72 ore. </li><li> Ulteriori esperimenti con le cellule trasdotte-di-interesse bersaglio può essere iniziata 72 ore dopo la trasduzione, una volta che il costrutto virale è integrato nel genoma della cellula ospite. Modificare il medium e il passaggio celle di destinazione d&#39;interesse in base alle loro specifiche esigenze. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; trasfezione di cellule 293TN La densità iniziale delle cellule 293TN critiche per imballaggio virale. Cellule 293TN deve essere compresa tra 60% -80 confluenti il giorno di trasfezione (Figura 2). Se le cellule 293TN sono inferiori al 60% confluenti, permettere loro di crescere per qualche ora in più prima di tentare la transfezione. Se le cellule confluenti sono 293TN&gt; 80%, devono essere ripiastrate prima della transfezione. Se si utilizza un GFP lentivector esprime, almeno il 90% delle cellule 293TN dovrebbero fluorescenza verde 24 ore dopo la trasfezione, indicando una trasfezione con successo (Figura 3). Se meno del 90% delle cellule sono GFP-positive, non procedere alla fase successiva, perché questo indica che la trasfezione non ha avuto successo, i titoli virali e sarà basso. Invece, piastre nuove cellule 293TN e ricominciare da capo, facendo in modo che le cellule 293TN sono la densità delle cellule corretto prima di trasfezione. Cellule 293TN può tirare fuori le piastre di coltura di tessuto 48-72 ore dopo la trasfezione. Ciò non influisca negativamente sulla produzione di particelle lentivirali. Titolazione con cellule HT1080 Titoli virali può essere calcolata utilizzando il kit globale SBI di Titolazione Ultrarapid secondo le istruzioni del produttore. Questo sistema utilizza qPCR per misurare l&#39;integrazione della sequenza virale WPRE dal vettore lentivirale in HT1080 cellule e lo confronta con una curva standard, sulla base di una sequenza genomica di riferimento per misurare accuratamente unità infettive per ml (Figura 4). Trasduzione delle cellule bersaglio Se si utilizza particelle lentivirali che esprimono un marcatore GFP costitutivamente attiva, le cellule GFP positive iniziative dovrebbe prendere forma entro 12-24 ore di trasduzione, se la reazione di trasduzione sta lavorando. Espressione di GFP dovrebbe continuare anche dopo il costrutto lentivirale integra stabilmente in tegli ospitare genoma della cellula. Se trasduzione con MOI differenti, la fluorescenza GFP dovrebbe corrispondere approssimativamente la MOI, in cui MOI bassi mostrano fluorescenza GFP inferiore e superiore MOI mostrano un aumento di fluorescenza GFP (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Panoramica del disciplinare di produzione virale. I plasmidi di confezionamento lentivector e PPACK vengono mescolati e co-transfettato in cellule 293TN. Dopo 48 -72 ore, il surnatante virale viene raccolto, e le particelle virali vengono fatte precipitare con PEG-esso. Dopo la titolazione delle particelle lentivirali, possono essere utilizzati per trasdurre celle di destinazione d&#39;interesse. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Contrasto di fase di cellule 293TN. Cella Density deve essere compresa tra 60-80% confluenti il ​​giorno di trasfezione. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immagine fluorescente di cellule GFP-positive 293TN 24 ore dopo la trasfezione con Purefection, pPACKH1, e un lentivector codifica GFP costrutto. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Risultati qPCR WPRE e la curva standard ottenuta utilizzando il kit globale SBI di Titolazione Ultrarapid per calcolare MOI e titolo corrispondente confezionati particelle virali. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Immagini di Figura 5. Fluorescenti di HT1080 cellule trasdotte con quantità crescenti di lentivirus. Le immagini sono da 72 ore dopo la trasduzione.

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	<li>Cann, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNA Viruses. A Practical Approach. , (2000).</li><li>Gould, D. J., Favorov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases.">Vectors for the treatment of autoimmune diseases.</a> Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfer,+integration,+and+sustained+long-term+expression+of+the+transgene+in+adult+rat+brains+injected+with+a+lentiviral+vector.">Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).</li><li>Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Dull, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Federico, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lentivirus Gene Engineering Protocols. , (2003).</li><li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors.">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).</li><li>Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells.">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).</li><li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool.">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Mol. Cell Biochem. , (2011).</li></ol>

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Questo imballaggio virale e trasduzione del protocollo di cellule bersaglio è stato ottimizzato per l&#39;utilizzo con i reagenti SBI di imballaggi virali. Sostituzione di altri reagenti possono influenzare l&#39;esito del protocollo. Questo protocollo è solo stato ottimizzato per la produzione lentivirale e può non essere adatto per la produzione di altri tipi di virus o pseudoviruses. Il successo di imballaggio virale dipende diversi passaggi chiave. Le cellule 293TN esprimono il SV40 antigene T grande, che è assolutamente necessaria per la secrezione delle particelle lentivirali nel supernatante di coltura cellulare. La densità con cui le cellule sono 293TN al momento della transfezione è particolarmente importante per il reagente PureFection sufficiente per trasferire il lentivector e plasmidi confezionamento nelle cellule. Aggiungere la miscela PureFection alla piastra di coltura tissutale in un goccia a goccia modo seguito dal fondo agitando la piastra è importante per la dispersione dei plasmidi imballaggioe lentivector costruire durante tutte le celle. La mancata distribuire opportunamente i vettori possono causare insufficiente particelle lentivirali essere prodotte. La reazione imballaggio virale può essere scalato per la produzione di virus titolo alto, basato sulla superficie delle piastre di coltura dei tessuti. Si può scegliere di tessuto diversi piatti di coltura di cellule piastra 293TN per costrutto che deve essere confezionato. Concentrazione dei surnatanti virale è particolarmente utile nella creazione di alta titolo virus. Surnatante virale da piastre multiple di cellule possono essere combinati e concentrati per l&#39;uso in esperimenti in vivo, o per cellule che sono difficili da trasdurre. Titolazione delle particelle prodotte lentivirali è importante per calcolare un accurato MOI da utilizzare per la trasduzione delle cellule bersaglio. Sapendo che la MOI è stato utilizzato in una trasduzione dato consente risoluzione nel caso in cui la trasduzione non è riuscita. Ad esempio, utilizzando un MOI che siatroppo bassa può causare cellule bersaglio pochissimi esprimono il costrutto d&#39;interesse. Utilizzo di un MOI che è troppo elevato, tuttavia, può causare cellule bersaglio che mostrano segni di stress. L&#39;obiettivo è di utilizzare un MOI che massimizza l&#39;espressione del costrutto-di-interesse preservando la salute delle cellule. Mentre si consiglia una qPCR protocollo basato titolazione che misura copie integrate lentivirale del costrutto in cellule HT1080, titolazione altri approcci possono essere utilizzati, come p24 ELISA o stima della percentuale di cellule positive-GFP. Trasduzione delle cellule bersaglio successo dipende anche da diversi fattori chiave. TransDux è un reagente infezione unico che consente alte efficienze di trasduzione, ma che non è tossico per le cellule. TransDux può essere usato invece di polibrene, che spesso è tossica per le cellule bersaglio. L&#39;inclusione di TransDux nella trasduzione delle cellule bersaglio aiuta a neutralizzare le cariche sulle particelle virali e permette il virus nella cellulas. Poiché TransDux non è tossico per le cellule, si può consentire alle particelle lentivirali di rimanere in contatto con le cellule per un massimo di 72 ore (il momento in cui i costrutti virali hanno integrato nel genoma della cellula ospite), aumentando così la probabilità particelle virali entrare nella cellula. Per alcuni di difficile trasdurre cellule, trasduzioni può essere ripetuta in giorni successivi per aumentare l&#39;efficienza di trasduzione. Ad esempio, la trasduzione delle cellule al giorno 1, permettere alle cellule di riposare il giorno 2, e quindi le celle trasdurre nuovamente al giorno 3. È importante attendere 72 ore dopo la trasduzione ultima selezione prima dell&#39;inizio, ulteriori esperimenti o caratterizzazione delle cellule bersaglio. Efficiente imballaggio virale dipende anche dalle dimensioni del costrutto lentivirale, tra il 5 &#39;e le regioni 3&#39;LTR. Questa sezione del costrutto lentivirale deve essere di circa 9 kb o meno, che corrisponde alla dimensione del genoma HIV nativo. Superiore a 9 kb può depiega il titolo delle particelle prodotte pseudoviral. La nuova tecnologia, come ad esempio piggyBac vettori trasposoni, consentono affidabile, l&#39;integrazione stabile di transgeni fino a 100 kb attraverso una singola trasfezione. Questo approccio può essere utilizzato per costrutti che superano il limite di dimensione per vettori lentivirali, nei casi in cui è possibile trasfettare cellule bersaglio, e fornisce l&#39;ulteriore vantaggio di non richiedere una fase di confezionamento virale 9,10. Le particelle prodotte pseudoviral che utilizzano questo protocollo sono contagiosi, in quanto possono infettare più tipi di cellule di mammifero. I prodotti utilizzati in questo protocollo, però sono di terza generazione BIOSAFE nel senso che producono non-replicativa e di auto-inattivanti pseudoviruses. Pertanto, una volta all&#39;interno delle cellule bersaglio trasdotte o animali, le cellule bersaglio o gli animali non sono infettive o contagiose. Sostituzione di altri plasmidi lentivector che non sono di terza generazione BIOSAFE è possibile sebbene non sia raccomandato da un biosicurezzaprospettiva. Il protocollo di produzione virale e la successiva trasduzione delle cellule bersaglio deve essere effettuata sotto livello di biosicurezza 2, secondo le linee guida NIH 11, ei ricercatori devono sempre indossare un camice da laboratorio e guanti quando si maneggiano le particelle virali. Usate cellule produttrici 293TN, tubi di particelle virali, e pipette monouso devono essere smaltiti in un apposito contenitore a rischio biologico. Pipette di vetro riutilizzabili e devono essere decontaminati con candeggina e autoclave per ridurre l&#39;esposizione del personale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM medio alte concentrazioni di glucosio </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> Celle 293TN </td><td> SBI </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> SBI </td><td> LV500A-1 </td><td> Per HIV-based lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> SBI </td><td> LV100A-1 </td><td> Per FIV basati lentivectors </td></tr><tr><td> Qualsiasi vettore lentivirale </td><td> SBI </td><td> Vario </td><td> cDNA, sHRNA, i microRNA, trascrizione giornalisti </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> SBI </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-it </td><td> SBI </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Globale kit Titolazione Ultrarapid </td><td> SBI </td><td> LV961A-1 </td><td> Non descritto in questo protocollo, ma necessaria per titolo le particelle virali </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> SBI </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

packaging hiv- or fiv-based lentivector expression constructs &amp; transduction of vsv-g pseudotyped viral particles

Come standard di vettori plasmidici, è possibile per trasfettare lentivectors in forma plasmide in cellule a basso-medio efficienza per ottenere l&#39;espressione transiente di effettori. Costrutti di espressione di imballaggio lentivirali in particelle pseudoviral, tuttavia, consente fino al 100% trasduzione, anche difficile trasfezione le cellule, come primario, staminali, e cellule differenziate. Inoltre, la consegna lentivirale non produce le risposte cellulari specifiche tipicamente associati con trasfezioni chimici, quali la morte cellulare risultante dalla tossicità del reagente di trasfezione 1, 2. Quando trasdotta in cellule bersaglio, il costrutto lentivirale integra nel DNA genomico e fornisce espressione stabile del forcina RNA piccolo (shRNA), gene cDNA, microRNA reporter o 3, 4. Le cellule bersaglio esprimono stabilmente la molecola effettrice può essere isolato utilizzando un marcatore selezionabile contenuta nel costrutto vettore di espressione come puromicina o GFP. Dopo la psparticelle eudoviral infettare cellule bersaglio, non possono replicarsi all&#39;interno di cellule bersaglio perché i geni virali strutturali sono assenti e le ripetizioni terminali lunghe (LTR) sono progettati per essere auto-inattivante sulla trasduzione 5, 6. Ci sono tre componenti principali necessari per imballaggio efficiente lentivirale 1, 5, 6, 7. <ol><li> Il vettore di espressione lentivirale che contiene alcuni degli elementi genetici necessari per il confezionamento, l&#39;integrazione stabile del costrutto di espressione virale nel DNA genomico, e l&#39;espressione del effettrice o reporter. </li><li> I plasmidi di imballaggio lentivirali che forniscono le proteine ​​essenziali per la trascrizione e confezionamento di una copia di RNA del costrutto di espressione ricombinanti in particelle pseudoviral. Questo protocollo utilizza il plasmidi PPACK (SBI) che codificano per gag, pol, e riv dal genoma di HIV o FIV e proteine ​​di virus stomatite vescicolare g (VSV-G) per la proteina di rivestimento virale. </li><li> 293TN produrre<html> r (cellule derivate da cellule HEK293) che esprimono la SV40 antigene T grande, che è richiesto per la produzione ad alto titolo lentivirale e un gene di resistenza a neomicina, utile per riselezionare le celle per la manutenzione. </li></ol> Una panoramica del protocollo produzione virale può essere visto in Figura 1. Produzione virale inizia co-trasfezione di cellule produttrici 293TN con il vettore di espressione lentivirale ed i plasmidi confezionamento. Particelle virali vengono secreti nei media. Dopo 48-72 ore i mezzi di coltura cellulare viene raccolta. Detriti cellulare viene rimosso dal supporto di coltura cellulare, e le particelle virali vengono precipitati tramite centrifugazione con PEG-per concentrazione. Prodotte particelle lentivirali vengono poi titolati e può essere utilizzato per trasdurre cellule bersaglio. Dettagli di titolazione virale non sono inclusi in questo protocollo, ma si possono trovare all&#39;indirizzo: ank &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando i prodotti specifici indicati. Altri reagenti possono essere sostituiti, ma gli stessi risultati non può essere garantita.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Vettori di espressione lentivirali sono i veicoli più efficaci per esprimere stabilmente diverse molecole effettrici o costrutti reporter nel dividere e non la divisione delle cellule di mammiferi e di interi organismi. Qui forniamo un protocollo su come confezionare costrutti di espressione lentivector particelle pseudoviral e di trasdurre cellule bersaglio utilizzando le particelle pseudoviral.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

packaging-hiv-or-fiv-based-lentivector-expression-constructs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

34.9K Views.  System Biosciences. Vettori di espressione lentivirali sono i veicoli più efficaci per esprimere stabilmente diverse molecole effettrici o costrutti reporter nel dividere e non la divisione delle cellule di mammiferi e di interi organismi. Qui forniamo un protocollo su come confezionare costrutti di espressione lentivector particelle pseudoviral e di trasdurre cellule bersaglio utilizzando le particelle pseudoviral.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

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Immunologia e infezioni

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produzione di particelle pseudotipizzate per studiare la patogenicità coronavirus in un ambiente di livello 2 di biosicurezza

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Valutazione della neutralizzazione sierica contro SARS-CoV-2 con virus pseudotipizzati

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Autore in primo piano: Studio delle interazioni ospite-virus con virus pseudotipizzati 

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...