Riconosciamo Julie Heward per aiutare nella preparazione di hNSCs, e Lavaniya Thanabalasundaram per il suo supporto tecnico con HeLa coltura e trasfezione.

1. HNSC differenziazione su Tridimensionale (3D) Culture NOTA: Isolare e derivare hNSCs, da un tessuto etico approvato, descritto in una pubblicazione precedente 2. Si prega di seguire le linee guida etiche ed istituzionali seguendo questa procedura. 1.1) La cultura 3D Utilizzando 12 pozzetti <ol><li> Utilizzare una tecnica asettica durante tutta la procedura. In un armadio di sicurezza biologica, impalcature reidratare aggiungendo 2 ml / pozzetto di etanolo al 70% preparate con acqua per l&#39;irrigazione (WFIr). Evitare di toccare i ponteggi erogando l&#39;etanolo del 70% il muro di ogni bene. </li><li> Aspirare accuratamente la etanolo al 70% e lavare immediatamente i ponteggi con 2 ml / pozzetto DMEM: F12 per 1 min. Ripetere la procedura di lavaggio due volte. Aspirare accuratamente il DMEM: F12 dopo il lavaggio finale. </li><li> Ponteggi Coat aggiungendo 2 ml / pozzetto di laminina (10 mg / ml) in DMEM: F12. Incubare la piastra a 37 ° C in un CO 2 ronzio 5%incubatrice idified per un minimo di 2 ore. Piastra Lavare con DMEM caldo: F12. </li><li> Seed ogni scaffold con circa 500.000 hNSCs in un volume di 150 ml di RMM + GF. </li><li> Incubare la piastra per 3 ore a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5% per permettere alle cellule di stabilirsi nei ponteggi. </li><li> Aggiungere 3,5 ml di RMM per ciascun bene facendo attenzione a non staccare le cellule da impalcature. </li><li> Incubare la piastra per 7 giorni; sostituire RMM medie (3,5 ml / pozzetto) dopo 1 giorno (prima alimentazione) e dopo 2-3 giorni dalla prima alimentazione. </li><li> Dopo 7 giorni, rimuovere le medie e fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) per immunocitochimica (ICC) o aggiungere 500 ml / pozzetto di reagente di lisi per l&#39;estrazione di RNA totale (piastra di conservare a ≤ -80 ° C o procedere con l&#39;estrazione totale RNA) . </li></ol> 1.2) Misura della Axon Process escrescenza <ol><li> Stain 4% PFA fissato hNSCs differenziati secondo un protocollo standard ICC 20 con β3-tubulina (TUBB3) anticorpo primario rilevato con un anticorpo secondario coniugato fluorocromo. Nuclei delle cellule di contrasto con Hoechst (1 micron). </li><li> Cattura immagini rappresentative di cellule colorate β3-tubulina usando un microscopio a fluorescenza; salvare le immagini come tiff o jpeg. Misura del processo assonale utilizzando uno strumento di misurazione del software (ad esempio, immagine-Pro Plus). </li><li> Aprite l&#39;immagine, opzione di selezionare le misurazioni nella barra degli strumenti, e selezionare la funzione di traccia. </li><li> Per avviare la traccia, selezionare il punto di partenza sul conseguenza assone facendo clic sul pulsante del mouse. Tracciare lungo l&#39;intera lunghezza del escrescenza assone; fare clic destro per terminare ogni traccia. Ripetere per misurare tutto outgrowthswith assone nel campo visivo. </li><li> Esprimere misure come pixel o micron (in attesa di calibrazione impostato). Misure di lunghezza esportare in un programma di foglio di calcolo per l&#39;analisi comparativa e statistica del campione. </li></ol> 2. Mirna espressione utilizzando una Cellule Staminali ePercorsi di sviluppo Focused Array miRNA PCR 2.1) estrazione di RNA totale miRNA <ol><li> Eseguire estrazione miRNA sui ponteggi e campioni cresciuti 2D (differenziato e indifferenziato, il controllo hNSC). </li><li> Scongelare ponteggi, inseriti in una piastra ben 12, se necessario. Combina contenuti reagenti di lisi (500 microlitri) di 2 pozzi nella stessa 1,5 ml provetta Eppendorf, volume finale 1 ml di Lysis reattivo. Fare attenzione a lasciare il palco nel pozzo. </li><li> Per i campioni raccolti in precedenza secche cellulari pellettato 2D cresciuto (differenziate culture hNSC 2D e controllo indifferenziato) aggiungere 1 ml di reagente di lisi e trasferire il contenuto in 1,5 ml provetta. </li><li> Omogeneizzare ogni campione con una siringa da 1 ml e una breve 20 a 25 gauge. Far passare il lisato attraverso l&#39;ago utilizzando una siringa da 1 ml fino a 5 volte fino ad ottenere un lisato omogenea. </li><li> Aggiungere 200 ml di cloroformio in ogni provetta Eppendorf e tappare saldamente. Tubi Inverti e vortex permescolare il contenuto. </li><li> Centrifugare ogni 1,5 ml provetta contenente omogeneizzato per 15 minuti a ≥12,000 x g. </li><li> Trasferire la fase acquosa superiore di ciascun campione (evitare di trasferire ogni interfase, rosa liquido colorato) ad una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 750 ml di etanolo al 100%. Miscelare bene per capovolgimento. </li><li> Pipetta fino a 700 ml di ogni campione di prova, comprese eventuali precipitato, in un mini colonna in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a ≥8,000 xg per circa 30 secondi a temperatura ambiente. Gettare il flow-through. Ripetere questa operazione utilizzando il resto del campione. </li><li> Eseguire un digest DNA per 15 min. </li><li> Aggiungere 700 microlitri di buffer RWT alla mini colonna e centrifugare per circa 30 secondi a ≥8,000 x g. Gettare il flow-through. </li><li> Lavare mini colonna aggiungendo 500 microlitri di buffer RPE e centrifugazione per circa 30 secondi a ≥8,000 x g. Gettare il flow-through. Ripetere wash.Centrifuge a ≥12,000 xg per 1 min per asciugare ulteriormente la membrana. </li><li> Eluire RNA totale in una provetta Eppendorf da 1,5 ml aggiungendo 40 ml di acqua RNase-free alla mini colonna e centrifugando per 1 min a ≥8,000 x g. Misurare concentrazione totale RNA con l&#39;ausilio di uno spettrofotometro adeguato. </li></ol> 2.2) miRNA cDNA Preparazione <ol><li> Preparare la master mix trascrizione inversa. Ogni campione richiede 4 ml di tampone 5x miScript Hispec, 2 ml di 10x nucleics mix, 2 microlitri miScript inversa mix trascrittasi. </li><li> Aliquota 8 ml di master mix in un tubo di PCR, aggiungere il volume richiesto di RNA totale (250 ng), e aggiungere acqua senza RNase ad un volume finale di 20 ml. </li><li> Incubare per 60 min a 37 ° C.Incubate per 5 minuti a 95 ° C per inattivare miScript trascrittasi inversa Mix. </li><li> Aggiungere 200 acqua priva di RNasi microlitri per ogni reazione di 20 microlitri inversa trascrizione, conservare a -20 ° C, o procedere con real-tiMi Pcr immediatamente. </li></ol> 2.3) Cellule staminali e dello sviluppo Pathways focalizzata miRNA PCR Array <ol><li> Preparare la componenti mix PCR in una provetta da 15 ml con l&#39;aggiunta di 1375 ml di 2x SYBR master mix verde, 100 ml miRNA cDNA preparazione, 275 ml di 10x miScript Primer universale, e 1000 ml di acqua RNase-free (volume totale 2.750 ml). </li><li> Trasferire PCR componenti mix su un carico serbatoio PCR. Rimuovere con attenzione il 96 pozzetti PCR schiera dalla confezione sigillata. </li><li> Aggiungere 25 ml componenti PCR mix in ogni pozzetto del Array PCR utilizzando una pipetta a 8 canali, o una pipetta 12 canali utilizzando solo 8 punte. Cambiare puntali seguenti ogni semina per evitare la contaminazione incrociata tra i pozzetti. </li><li> Sigillare piastra con pellicola adesiva ottica, e centrifugare per 1 min a 1000 xg a temperatura ambiente (15-25 ° C) per rimuovere bolle. Ispezionare visivamente la piastra dal basso per garantire l&#39;assenza di bolle sono presenti nei pozzetti. </li><li> Posizionare la 96 pozzetti PCR array in tempo reale cycler. </li><li> Programmare il tempo reale cycler conseguenza: 1 ciclo a 95 ° C per 10 minuti, e 45 cicli di 15 secondi a 95 ° C, e 1 min a 60 ° C impostata una singola (raccolta dei dati di fluorescenza). </li><li> Esportare i valori Ct per tutti i pozzetti di un vuoto foglio di calcolo Excel per l&#39;utilizzo con la PCR Array Data Analysis Template Excel e software web-based. NOTA: Il software è disponibile in <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Analisi computazionale per miRNA target Previsione e Validazione di Target mRNA da Reporter plasmidi Transfection e Ddual luciferasi Assay. 3.1) Analisi computazionale per la previsione miRNA target <ol><li> Sfoglia PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, disponibile online algoritmo per l&#39;identificazione di miRNA bersaglio mRNA di previsione. </li><li> Clicca su &quot;clicca qui per la previsione PicTar su vertebrati&quot;. Una nuova pagina si aprirà. </li><li> Nella nuova pagina, interfaccia web PicTar, scegliere specie nel menu a tendina e inserire miRNA di interesse nella casella di miRNA ID. Clicca ricerca di obiettivi di miRNA. </li><li> Osservare un elenco di mRNA bersaglio ordinati per punteggio aPicTar. NOTA: PicTar calcola un punteggio che riflette la probabilità che un determinato UTR sarà destinata dal miRNA selezionati, e si basa sulla complementarità delle sementi, termodinamica e una previsione combinatoria per obiettivi comuni in gruppi di co-espressi miRNA 22. </li><li> Allo stesso modo recuperare l&#39;elenco di mRNA bersaglio utilizzando DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, e TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternativa on line disponibile algoritmi. </li><li> Compilare una tabella comparativa di miRNAs sulla base di classifica ottenute utilizzando diversi strumenti software. PicTar classifica in base al punteggio, DianaLab per la precisione (sulla base di rapporto segnale-rumore e un punteggio di precisione per la valutazione della significatività dei risultati previsti), e TargetScan da PCT aggregato (basato sulla complementarità delle sementi, termodinamico energia libera di legame, conservazione su diverse specie), vedi tabella 1. </li></ol> 3.2) Validazione dei target mRNA da Reporter plasmidi Transfection e Dual Luciferase Assay. NOTA: 3 &#39;UTR reporter luciferasi per la validazione del target mRNA è stato descritto in precedenza 25. <ol><li> Transfection <ol><li> Seme cellule HeLa con una densità di 10 5 cellule / pozzetto in 24-pozzetti. </li><li> Dopo 24 ore, co-trasfezione le cellule HeLa con 1,5 ml di reagente di trasfezione eo 100 ng di NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTR plasmide, nonché imita 20 nM miRNA (HSA-miR-96-5p per SOX5 3217; UTR, e HSA-miR-7-5p, e HSA-miR-17-5p per NR4A3 3 &#39;UTR, rispettivamente) per bene. </li><li> Pozzetti di controllo Co-trasfezione con NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid e fluorocromi etichettata siRNA controllo negativo. La trasfezione di pozzetti di controllo con fluorocromi etichettata siRNA controllo negativo consente la valutazione di efficienza di trasfezione e rappresenta mimica miRNA 3&#39;UTR bind specificità. </li></ol></li><li> Misurazione del doppio luciferasi Attività <ol><li> Misurare Firefly e Renilla attività luciferasi 24 ore dopo la trasfezione. Togliere terreno di coltura cellulare. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro I aggiungendo 50 ml di substrato I in 10 ml di soluzione di I; mescolare accuratamente. Aggiungere 300 ml di soluzione di lavoro che in ogni 24 bene. </li><li> Trasferire il contenuto di ogni 24 e in 3 pozzetti di una piastra bianca 96, 100 ml ciascuna. Attendere 10 min e misurare Firefly luciferasi in set luminometro per l&#39;acquisizione luminescenza. </li><li> Preparare solut lavoroion II aggiungendo 50 ml di substrato II in 10 ml di soluzione II; mescolare accuratamente. Aggiungere 100 ml di soluzione di lavoro che in ogni 96 e già contenente 100 ml di soluzione di lavoro I. </li><li> Attendere 10 min e misurare Renilla luciferasi in set luminometro per l&#39;acquisizione luminescenza. Calcolare il rapporto della luminescenza della luciferasi Firefly al luciferasi Renilla. </li></ol></li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

Tutti gli autori sono dipendenti, magazzino e / o titolari di stock option in ReNeuron Ltd o della sua controllante. Questo studio è stato sostenuto da ReNeuron (RENE.L).

Lo sviluppo di nuovi test in vitro per valutare e migliorare la differenziazione delle cellule staminali ha sempre rappresentato una sfida per lo studio delle loro funzionalità e capacità terapeutiche. A lungo termine e l&#39;attaccamento stabile di hNSCs, necessaria per lo sviluppo di un robusto 3D in vitro la differenziazione, è stata affrontata analizzando diversi substrati 3D con caratteristiche diverse in termini di materiali e strutture. Come parte dello sviluppo test abbiamo anche valutato concentrazione ottimale di semina cellulare e identificato l&#39;obbligo per i ponteggi da laminina rivestite. Sebbene i nostri hNSCs possono differenziarsi spontaneamente upon 4-OHT e il fattore di crescita di rimozione, l&#39;implementazione di un sistema di coltura 3D mostrato un miglioramento significativo nella loro capacità di differenziazione come misurato da assonale processo rispetto a hNSCs 2D differenziato standard. Per studiare l&#39;effetto di differe 3D indottantiation sull&#39;espressione hNSC miRNA abbiamo usato un array di PCR. Rispetto ai chip di microarray standard di matrice PCR offre i vantaggi di una quantificazione diretta e validazione di miRNA di interesse. Sebbene l&#39;array PCR è limitata in termini di numero totale di miRNA per elemento, per esempio qui meno di 96, può essere adattato per includere specificamente miRNA di interesse, nel nostro caso precedentemente riportato nello sviluppo delle cellule staminali. L&#39;espressione del pathway concentrata miRNA è stata profilata in 3D e 2D hNSCs differenziati rispetto a hNSCs indifferenziati. I più significativamente down-regolato miRNA sono stati selezionati e analizzati per valutare i loro presunti mRNA bersaglio con l&#39;intento di determinare la loro funzionalità e interpretazione biologica mediante algoritmi disponibili online (DIANA Lab, PicTar, e TargetScans). Un singolo miRNA può riconoscere centinaia di obiettivi e per questo motivo abbiamo convalidato interazioni miRNA con 3 &#39;UTR mRNAsthat possono essere candidati idonei in unregolazione xonal. NR4A3, un obiettivo della HSA-miR-7, e miR-17 famiglie, è un membro della famiglia dei recettori nucleari NR4A che, a seconda del loro livello di espressione, sono coinvolti nella differenziazione, sopravvivenza, apoptosi e la regolamentazione del assone ippocampale guida 26. Analogamente SOX5, un obiettivo di HSA-miR-96, è segnalato per controllare la progressione del ciclo cellulare in progenitori neurali 27 lunghezza assone 28, migrazione, differenziazione post-migratori, e proiezioni di neuroni 29. Sia SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come bersaglio mRNA diretta di HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17, rispettivamente, dal doppio saggi luciferasi giornalista. Doppia luciferasi (lucciola e Renilla) si basa su due differenti geni reporter nella stessa plasmid e offre un sistema perfezionato che consente di normalizzazione per effetti causati dalla trasfezione subottimale e effetti citotossici rispetto ad un unico sistema plasmide luciferasi. Come parte del nostro sviluppo test abbiamo anche ottimizzato il nostro trasfezione conditions per ottenere un&#39;elevata efficienza. Il protocolsdescribed qui può essere sfruttata per ottimizzare ulteriormente e caratterizzare la differenziazione in vitro hNSC che possono beimplemented protocolli intransplantation per gli studi pre-clinici e future applicazioni cliniche.

La ricerca sulle cellule staminali ha un ruolo centrale nella medicina rigenerativa, che si estende anche le discipline di ingegneria dei tessuti, biologia cellulare dello sviluppo, terapie cellulari, terapia genica, e biomateriali (scaffold e matrici). Le cellule staminali sono importanti sia in organo riparazione dei tessuti Sviluppoe; capire come le cellule staminali funzionano è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti a base di cellule staminali nuovo 1. CTX0E03 è un clonale, cellule staminali neurali umane condizionalmente immortalato (hNSC) Linea 2 isolati dal primo trimestre corteccia fetale umano. CTX0E03 ha definito le caratteristiche di qualità che sono essenziali per il settore bancario cella clinica in buone pratiche di fabbricazione (GMP) 3. HNSCs possono differenziarsi spontaneamente in neuroni, glia, e oligodendrociti e hanno dimostrato di migliorare i deficit neurologici quando trapiantati in un modello di roditore di focale ischemia 2,4,5. Il CTX0E03 hNSCs sono attualmente in studi clinici per l&#39;ictus Disabillità (NCT01151124 6 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNA hanno una media di 22 nucleotidi di lunghezza e hanno dimostrato molecole regolatrici 7, non codificano proteine, ma piuttosto legare 3 prime untranslated regione (3&#39;UTR) di mRNA, regolando la loro stabilità e la traduzione in proteine. MiRNA sono segnalati per partecipare alla regolamentazione di un certo numero di processi cellulari, tra cui lo sviluppo, la proliferazione e la differenziazione 8. Molti miRNA sono stati implicati nella regolazione del destino e la specifica delle cellule staminali neurali 9. In bidimensionale (2D) cultura ambiente standard complessità dell&#39;ambiente in vivo non corrisponde, e quindi l&#39;induzione e regolazione di hNSC differenziazione non è ottimale. In vivo, le cellule sono circondate da un tridimensionale (3D) microambiente tre composta da altri cellule e ligandi extracellulari, tra cui moltitipi di collagene, laminina, e altre proteine ​​della matrice (matrice extracellulare, ECM). Hanno riferito Studi precedenti che la topografia architettonica dei materiali che mimano ECM e il loro fenotipo cellulare geometria influenza e il destino 10-15. Un certo numero di commercialmente disponibili scaffold 3D sono disponibili; abbiamo usato un ponteggio polistirene altamente porosa progettato con un&#39;architettura ben definita ed uniforme in una membrana di spessore 200 micron che fornisce uno spazio 3D in cui le cellule possono invadere e differenziarsi 16-18. Ivi saggi di differenziazione 2D e 3D sono utilizzati per valutare axonprocess escrescenza. Inoltre, si descrive un metodo per profilare l&#39;espressione miRNA di una linea di grado hNSC clinica per studiare ulteriormente gli effetti dei miRNA sulla sua differenziazione. I metodi qui illustrati sono basati su quelli originariamente descritti in 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

Le cellule staminali neurali (NSC) sono in grado di auto-rinnovamento e la differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti sotto specifici microambienti locali. Qui, vi presentiamo una serie di metodi utilizzati per tridimensionale (3D) la differenziazione e l&#39;analisi miRNA di una cellula staminale neurale umana (hNSC) linea clonale, attualmente in studi clinici per la disabilità ictus (NCT01151124 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs sono stati ricavati da un etico approvato primo trimestre corteccia fetale umano e condizionale immortalati con integrazione retrovirale di una singola copia del c-mycER TAM costruire. Descriviamo come misurare processo assonale di hNSCs differenziati sulle impalcature 3D e come quantificare i cambiamenti associati nella espressione dei miRNA con matrice PCR. Inoltre rappresentiamo analisi computazionale, con l&#39;obiettivo di selezionare miRNA target putativi. SOX5 e NR4A3 sono stati identificati come idonei bersaglio putativo miRNA di selezionati in modo significativo down-regolanod miRNA in hNSC differenziata. Validazione del target Mirna è stata effettuata su SOX5 e NR4A3 3&#39;UTRs da dual trasfezione plasmide reporter e doppio test luciferasi.

Nella figura 1 viene visualizzata la ricerca e quantificazione di hNSC differenziazione su scaffolds 3D rispetto alle culture tradizionali superficie piana (2D) e expressedas assoni misurazioni processo escrescenza. Nella figura 2 è representedthe flusso di lavoro e risultati per la quantificazione miRNA utilizzando cellule staminali e percorsi di sviluppo focalizzati matrice miRNA PCR per indagare l&#39;espressione differenziale dei miRNA in hNSCs differenziate 2D e 3D rispetto al controllo di indifferenziata. A seguito di analisi comparativa tra miRNA hNSCs differenziati e indifferenziati, e analisi computazionale per la previsione di destinazione, SOX5 e NR4A3 (Nor1) sono stati identificati come presunti mRNA bersaglio. Per studiare l&#39;interazione diretta tra i miRNA ei loro sito putativo sul 3&#39;UTR dell&#39;mRNA abbiamo usato 2 plasmidi disponibili in commercio che contengono sia SOX5 o sequenza NR4A3 3&#39;UTR inserito a valle del lucciola luciferasi gene reporter, un<html> nd contenente nello stesso plasmide renilla luciferasi gene per la normalizzazione. I risultati rappresentativi di 3 &#39;UTR attività luciferasi down-regolazione è presentato in figura 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figura 1:. Differenziazione delle hNSCs su impalcature 3D, e la misurazione della crescita degli assoni processo es (A) seguito colorazione ICC standard per β3-tubulina (verde) e nuclei di contrasto con Hoechst (blu) microfotografie rappresentativi sono stati acquisiti e misurazione dei processi assoni erano eseguita con l&#39;ausilio di un software di analisi di immagine. (B) Schemi di segnalazione la misura del processo di estensione assonale eseguita in hNSCs differenziati 2D e 3D per 1 (1W) o 3 settimane (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figura 2:. Workflow Schema di miRNA profiling in hNSCs differenziate RNA totale, tra cui miRNA, è stato estratto da entrambi hNSCs differenziati sulle impalcature 3D e culture 2D standard o di controllo indifferenziata. 250 ng di RNA totale sono stati retro-trascritto con un metodo che facilita la conversione selettiva dei miRNA maturi in cDNA adatto per miRNA quantificazione con la differenziazione delle cellule umane e lo sviluppo miScript miRNA PCR array. La geo-media di SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, e RNU6-2 è stato utilizzato per l&#39;analisi dei dati in base al metodo 2 -ΔΔct. Cambiamenti significativi sono stati definiti come +/- 1,5 ripiegare e regolazione fino a una stain misura statisticamente significativa. I dati sono stati analizzati utilizzando il software web-based disponibile presso risultati sono espressi come clustergram. Modificato da Figura 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figura 3: convalida del target miRNA previsto mRNA utilizzando un doppio test rapporto luciferasi. (A) diagramma rappresentante di una duplice plasmide giornalista luciferasi utilizzato come strumento per convalidare sequenza 3&#39;UTR come bersaglio diretto di un miRNA. (B) Micrografia Rappresentante mostrando efficienza di trasfezione. (C) &#160; Segnali, espressi come attività relativa luciferasi, da umano 3 &amp; #39; giornalisti UTR ofSOX5 e NR4A3 geni erano significativamente abbattuti in presenza di HSA-miR-96, e HSA miR-7-e 17 imita miRNA rispettivamente. Modificato dalla figura 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Gene bersaglio </td><td> Siti target / geni trovati </td><td> Precisione </td><td> Punto </td><td> Aggregato P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302A </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei miRNA mRNA previsione di destinazione. Tavolo Rappresentante dei miRNA, bersaglio geni predittivi, e l&#39;analisi di algoritmi (prevedereion / partitura / aggregati forniti utilizzando rispettivamente Diana Lab, PicTar, e TargetScan). Modificato dalla tabella 3 19.

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K Views.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Video: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Infezione del Virus di Zika delle cellule staminali neurali del cervello fetale umano colto per analisi Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Rendering tridimensionale e l'analisi di Immunolabeled, chiarito reti vascolari Villous placentare umani

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...