This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol>
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Le valutazioni delle proprietà contrattili di fibre muscolari scheletriche singole permeabilizzate sono usati per studiare la funzione muscolare in un&#39;ampia varietà di contesti. Alcuni esempi sono gli studi che hanno valutato gli effetti dell&#39;invecchiamento 12, esercitare 10,13,14, 15 voli spaziali, lesioni 2,3,16, trattamenti farmacologici 17,18, malattie 19 e di manipolazione genetica 20,21 sulla struttura e la funzione delle fibre. A causa della capacità di valutare direttamente le prestazioni contrattile miofibrille nella loro configurazione nativa, questa tecnica fornisce una piattaforma interessante da cui formare una comprensione della funzione miofibrillare assente di effetti potenzialmente confondenti che sono presenti quando la trasmissione del segnale neuromuscolare e rilascio di calcio di eccitazione indotta sono inclusi nel sistema studiato. Inoltre, collaudo funzionale di singole fibre può essere utilizzato per integrare proteine ​​contrattili risultati di identificazione come quelliottenuta attraverso immunoistochimica o elettroforesi su gel + Western Blot 22. Una delle funzioni primarie del muscolo scheletrico è quello di generare forza. Conseguentemente sF o, una misura della capacità di forza generatrice intrinseca di un sistema di contrazione, è di grande interesse per fisiologi muscolari. Stime attendibili di sF o richiedono misure accurate di entrambi fibra CSA e F o. Poiché le fibre sono, in generale, non circolare in sezione trasversale, né uniformi in CSA lungo la loro lunghezza, molta cura deve essere presa nella stima CSA. A tal fine, le misurazioni vengono effettuate a diverse posizioni lungo la lunghezza della fibra e, in ogni posizione, da due prospettive separate di 90 °. Misure affidabili di F o richiedono attenzione ai diversi dettagli, tra cui la contabilità per forza passiva, regolando la lunghezza sarcomero per massimizzare sovrapposizione di filamenti spessi e sottili, impiegando una soluzione attivante con una concentrazione di calcio trisultati cappello di attivazione massima, mantenendo la temperatura desiderata sperimentale, e mantenere condizioni ottimali (temperatura e durata) delle fibre precedenti il ​​giorno dell&#39;esperimento. Mentre la procedura descritta descrivono la procedura di valutazione massima forza isometrica, è spesso desiderabile per valutare altri importanti caratteristiche funzionali delle fibre muscolari scheletriche. Ciò può essere ottenuto estendendo il protocollo sperimentale per includere ulteriori manipolazioni meccaniche della fibra. Ad esempio, la misurazione della velocità con cui la fibra accorcia contro una serie di carichi diversi permette di determinare il rapporto forza-velocità, da cui i rapporti forza potenza e velocità-potenza possono essere calcolati 10,23,24. Inoltre, la velocità di accorciamento a vuoto può essere determinato utilizzando il &quot;test slack&quot; 25, che consistono di applicare una serie di passaggi di accorciamento-allentamento indurre e misng il tempo richiesto dalla fibra per eliminare l&#39;allentamento. Un altro parametro cinetica che viene spesso segnalato è k tr, la costante di velocità per la forza di riqualificazione a seguito di una perturbazione meccanica che distacca temporaneamente tutti crossbridges 26. Infine, il rapporto tra la concentrazione di calcio e la generazione forza attiva (la &quot;relazione forza-APC&quot;) è spesso di interesse 18 e può essere determinata esponendo la fibra ad una serie di soluzioni con concentrazioni di calcio che vanno da sotto la soglia di attivazione del contractile Sistema a quelli sufficienti per suscitare massima attivazione e quindi la massima forza (F o). Anche se gran parte del materiale di cui è necessaria per valutare la contrattilità singola fibra, altre apparecchiature non è assolutamente necessario. Il regolatore di lunghezza, per esempio, è essenziale per qualsiasi protocollo sperimentale che richiede allungamento rapida e precisa o accorciamento della fibra,ma non è assolutamente necessaria per valutare la forza isometrica massima (anche se un livello zero forza nel record forza deve ancora essere identificato da alcuni mezzi). I prismi che permettono l&#39;osservazione della fibra dal lato, mentre utile per valutare sezione trasversale, non sono assolutamente necessarie durante il posizionamento della fibra all&#39;interno della camera sperimentale. Inoltre, mezzi alternativi per esporre la fibra alle varie soluzioni sperimentali potrebbe essere impiegato, compresi l&#39;ideazione di un sistema di azionamento manuale di camere o un&#39;unica camera che permette un rapido riempimento e svuotamento delle soluzioni. Infine, mentre le temperature sperimentali sub-fisiologiche come 15 ° C sono comunemente utilizzati per migliorare la riproducibilità delle misurazioni meccaniche 1,2,3,5,8,12,17,27, è possibile generare dati validi ad altre temperature 23 , 28 purché gli effetti della temperatura sulla proprietà della soluzione (concentrazione di calcio, pH, etc.) sono presi in considerazione. </p&gt; Le composizioni delle soluzioni di prova sono tra gli aspetti più critici delle tecniche fibre permeabilizzate qui descritte. Considerazioni riguardanti composizione della soluzione sono complesse e al di là della portata di questo articolo. Le soluzioni descritte al punto 5 della sezione di protocollo sono stati progettati con particolare attenzione alla rapida attivazione delle fibre permeabilizzate sul suo trasferimento da pre-attivazione per attivare soluzioni, pur mantenendo una forza costante ionica, la composizione cationica, e osmolarità 6,29. Altri approcci alla composizione della soluzione sono stati impiegati con notevole successo da parte di altri gruppi di ricerca e di solito fare uso di costanti di legame pubblicati e strumenti computazionali 27,30,31. Le concentrazioni di ioni calcio nelle varie soluzioni attivanti è particolarmente importante negli studi che coinvolgono l&#39;attivazione submassimale come valutazioni forza-PCA. Per gli esperimenti in cui le fibre sono completamente attivati, come quelli descrivered qui, la concentrazione di calcio nella soluzione attivante supera tipicamente da un margine comodo quella necessaria per ottenere la massima forza, rendendo la sua precisa conoscenza meno critica. L&#39;aggiunta di creatina fosfato è importante per la bufferizzazione fluttuazioni ATP e ADP intramyofibrillar che altrimenti essere associati con attività contrattile. La creatina chinasi è necessaria per catalizzare il trasferimento di fosfato da creatina fosfato a ADP. In condizioni sperimentali che determinano elevati tassi di turnover ATP, compresi lavorare ad alte temperature o di misura accorciamento ad alta velocità in fibre veloci 32, creatina chinasi deve essere aggiunto alla soluzione per integrare la creatina chinasi endogena che rimane legata alla fibra. Per le condizioni sperimentali meno impegnative, il sistema di rigenerazione ATP è meno critica 27. Limitazioni della tecnica singola fibra permeabilizzate sono i seguenti. I dati generati da queste prove definiscono laproprietà contrattili dell&#39;unità miofibrillare specifico che è stato attaccato alla apparato sperimentale. Di conseguenza, questo cattura solo una piccola parte dell&#39;intera fibre multinucleate da cui è stato ottenuto il segmento che, a sua volta, rappresenta una piccola frazione del numero totale di fibre all&#39;interno del muscolo. Gli investigatori dovrebbero pertanto considerare attentamente il campionamento necessaria per supportare tutte le conclusioni tratte dagli esperimenti. Inoltre, la valutazione dell&#39;impatto di un intervento allenamento sulla funzione fibra presume che le fibre valutati sono stati effettivamente assunti durante l&#39;allenamento. Sebbene il protocollo cerca di imitare il naturale ambiente intracellulare della fibra, il processo permeabilizzazione sarcolemma è aspecifica e necessariamente permette costituenti intracellulari solubili a diffondersi liberamente nelle soluzioni balneari. Un&#39;ulteriore conseguenza della permeabilità della membrana è un cambiamento nell&#39;equilibrio osmotico evidenziato da un rigonfiamento in volume delle fibre 33. Ilfibra gonfiore aumenta la distanza tra actina e miosina conseguente ridotta sensibilità al calcio del sistema myofilament 34,35, ma può essere invertito con l&#39;introduzione di grandi composti osmoticamente attivi 34. Una limitazione finale da considerare è la conseguenza della tecnica utilizzata per collegare fibre all&#39;apparato sperimentale. Ciò richiede invariabilmente distorcere il rapporto spaziale all&#39;interno del sistema filamento in e in prossimità dei punti di attacco, con frequentando deficit funzionali. In particolare, le regioni della fibra alla e adiacente ai punti di aggancio sono funzionalmente compromesse e contribuendo così serie artefatta elasticità al sistema di misura. In sintesi, abbiamo descritto un mezzo per valutare la capacità di generare forza delle fibre muscolari scheletriche permeabilizzate chimicamente in vitro. Anche se il focus di questo articolo è stato sulla valutazione di massima forza isometrica generating capacità delle fibre muscolari scheletriche umane, l&#39;approccio sperimentale può essere modificato ed esteso per determinare una serie di parametri e relazioni cinetici in una vasta gamma di specie di mammiferi, o in altro modo.

La funzione primaria del muscolo scheletrico è di generare forza. Forza muscolare è suscitato in vivo attraverso una complessa sequenza di eventi che comprende i potenziali nervose motorie azione, la trasmissione neuromuscolare, potenziali d&#39;azione delle fibre muscolari, il rilascio di calcio intracellulare, e l&#39;attivazione del sistema di proteine ​​regolatrici e contrattili. Poiché la generazione di forza è il risultato finale di questa sequenza, un deficit in forza potrebbe essere causato da guasto di una o più delle singole fasi. Una caratteristica fondamentale della preparazione di fibre permeabilizzate è che elimina la maggior parte dei passaggi necessari per la generazione di forza in vivo, con solo le funzioni di regolamentazione e contrattili associati con l&#39;apparato miofibrillare residuo. L&#39;investigatore si assume il controllo della consegna di attivare calcio e di energia (ATP), e viene ricompensato con un sistema semplificato che consente la valutazione dei isolate strutture normative e contrattili nella loro co nativonfiguration. Le misurazioni della forza utilizzando fibre muscolari scheletriche permeabilizzate sono quindi preziosi nel valutare alterazioni della funzione muscolare osservata in vivo. Per esempio, abbiamo usato questa tecnica per caratterizzare la capacità di forza generatrice di fibre da miostatina topi deficienti 1 e per valutare la causa della debolezza muscolare persistente esposto seguente rotatori cronica della cuffia lacrime 2,3. Metodologia fibra permeabilizzate moderna può essere fatta per primi studi autorevoli 4,5 ed è attualmente in uso da parte di un certo numero di gruppi di ricerca. Sebbene le tecniche sono state descritte in letteratura, che non sono ancora stati presentati in formato video. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di illustrare una versione aggiornata, tecnica valida e affidabile per misurare la capacità massima forza generatrice di singole fibre da campioni muscolari scheletriche permeabilizzate chimicamente. Per realizzare ciò, un segmento singola fibra (qui indicata come ̶0; fibre &quot;) viene estratto da un fascio pre-permeabilizzate di fibre e posto in una camera sperimentale contenente una soluzione rilassante, la caratteristica principale che è una concentrazione di calcio che è &lt;10 nM. La fibra viene quindi collegato ad una estremità ad una forza-trasduttore e all&#39;altra estremità ad un regolatore di lunghezza. Con la fibra presso una lunghezza ottimale sarcomere, viene trasferito a una soluzione attivante che ha una concentrazione di calcio sufficiente per provocare la massima forza di attivazione e quindi massima contrazione isometrica. Dati Force sono acquisiti, archiviati e analizzati utilizzando un personal computer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Sano, permeabilizzate chimicamente singole fibre dovrebbero apparire uniformi in forma e avere una spaziatura striatura coerente se visto sotto alto ingrandimento. Fibre che sono inflessibile quando manipolato con le pinze o hanno evidenti danni strutturali devono essere eliminate. Alto ingrandimento immagini digitali scattate durante la fase 15 vengono analizzati per 5 misure di diametro accoppiati lungo la parte centrale della fibra. Fibra CSA calcola assumendo una sezione trasversale ellittica e una media di 5 misurazioni individuali CSA come illustrato nella Figura 7A. Figura 7B serve anche a illustrare come dimensioni fibra in una vista può essere significativamente diverso rispetto a dimensioni associato nel altra vista (cioè, incrociata sezioni non sono, in generale, rotondo). Rappresentativi forza tracce di fibre lente e veloci umani sono illustrati nelle figure 8A e 8B, rispettivamente. Voltage uscita della forza-trasduttore è acquisito durante un test e convertito forzare (mN) utilizzando software di acquisizione e analisi (LabVIEW). Figura 9 illustra l&#39;approccio utilizzato per valutare la forza attiva massima (F o), che è calcolato sottraendo la forza richiesta per mantenere la fibra alla lunghezza ottimale sarcomere mentre in uno stato rilassato (forza passiva, F P), dalla massima forza isometrica sviluppato durante l&#39;attivazione della fibra massimale (forza totale, F T). Poiché l&#39;uscita del trasduttore di forza che corrisponde alla forza zero è, in generale, diverso per ciascuna delle diverse stanze da bagno, brevemente allentare la fibra sia nel pre-attivazione e attivare soluzioni di catturare il livello zero forza nel disco sperimentale. Normalizzazione della massima forza attiva da fibra CSA viene utilizzato per generare il valore più informativo di forza specifica (SF o). Poiché prende in considerazione la CSA della fibra, SF o </sub&gt; fornisce una misura della capacità intrinseca forza generatrice dell&#39;apparato contrattile della fibra, consentendo così confronti funzionali tra fibre di dimensioni diverse. Va tuttavia osservato che le misurazioni CSA non sono in grado di distinguere la proporzione della fibra occupata da filamenti contrattili contro la proporzione occupata da altre strutture subcellulari. Caratteristiche tipiche di sano, fibre adulti di Claflin et al. 2011 10 per l&#39;uomo, Mendias et al. 2011 1 per mouse e Gumucio et al. 2012 2 per ratto sono dettagliati in tabella 3. Tutti i dati riportati nella tabella 3 sono stati generati utilizzando il tecniche descritte in questo articolo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Umano (Vasto laterale) </strong&gt; </td><td> Topo (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Ratto (Sottospinato) </td></tr><tr><td colspan="2"> Maschio </td><td colspan="2"> Femminile </td><td> Maschio </td><td> Maschio </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (Non digitato) </td><td> (Non digitato) </td></tr><tr><td> CSA (micron 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (Mn) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Caratteristiche tipiche di fibre, adulti sani dal vasto umano lateralis 10, mouse estensore lungo delle dita 1 e ratto infraspinato 2 muscoli. Lunghezze sarcomero ottimali sono stati fissati a 2,7 micron per le fibre umane 7,8 e 2,5 micron sia per mouse (36, 37) e le fibre di ratto (38). Gamme Sperimentale L F (25 ° e 75 th quartili) erano 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm e 1,32-1,59 mm rispettivamente per uomo, topo e ratto. Intervalli mostrati indicano il 25 e 75 th quartili e n è il numero di fibre testate. I problemi più comuni emersi durante i test includono una scivolata cappio di sutura, che si traduce in una forza response con un &quot;catturare&quot; come quello illustrato in Figura 10A, e uno spessore rottura parziale o totale della fibra, che si traduce in una risposta forza che restituisce bruscamente verso o per (break) zero, mentre la fibra è ancora immersa in soluzione attivazione (Figura 10B). Se un lapsus, strappo o rottura si verifica nel corso di un esperimento, la fibra deve essere eliminata e esclusi i dati, pur mantenendo un record di fallimenti in fibra può anche essere informativo 11. Un altro risultato negativo che possono verificarsi è l&#39;attivazione prematura della fibra mentre nel pre-attivazione della soluzione (Figura 10C). Attivazione parziale nella soluzione pre-attivante suggerisce un notevole contaminazione incrociata bene (cioè, un aumento non intenzionale della concentrazione di calcio nel pre-attivazione ben). In questo caso, tutte le vasche devono essere aspirati e risciacquati con acqua deionizzata. Asciugatura le superfici divisorie tra le camere è anche raccoded come umidità o condensa in queste aree può portare a traspirazione di soluzione tra bagni. La decisione di includere o escludere i dati dipende in ultima analisi l&#39;attenzione sperimentale e devono pertanto essere considerati quando si progetta lo studio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: ciclo di sutura (10-0 monofilamento di nylon di sutura). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissezione Bundle forcipe sono in mano sinistra, le forbici di microdissezione sono nella mano destra. Linea rossa indica l&#39;orientamento favorevole del polso e forbici con gli assi longitudinali delle fibre. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) Apparecchio di prova con i componenti etichettati. (A) camere sperimentali con fondo trasparente. (B) Lunghezza-controller. (C) Forza-trasduttore. (D) sorgente luminosa. (E) di lunghezza controllore xyz auto micrometrica con display digitale. (F) unità Fase micrometrica con display digitale. (G) Forza trasduttore auto xyz micrometro. (H) Piattaforma per lo schermo l&#39;obiettivo di laser-diffrazione calibrato. Tavolo isolamento (i) Vibrazione. (B) Close-up vista delle camere sperimentali. Di superficie (j) allegato in acciaio inox che si estende dal controller lunghezza. Di superficie (k) allegato in acciaio inox che si estende dalla forza-trasduttore. (L) Side-view prisma. (M) alloggiamento per moduli di raffreddamento termoelettrici. (N) termocoppia per la segnalazione di te da cameramperature. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificato 100 microlitri punta pipetta utilizzato per trasferire la fibra da piatto dissezione a camera sperimentale. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montaggio singola fibra su dispositivi sperimentali (A) loop di sutura preparati infilate su superfici di fissaggio in acciaio inox. (B) fibra trasferito alla camera sperimentale. (C) Fiber ancorata alle superfici di fissaggio di acciaio inossidabile dalla prima coppia di anelli di sutura con eccesso suture rimosso. (D) Seconda coppia di anelli di sutura filettati sulla sommità di loop prima sutura e legato in posizione. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: lunghezza sarcomero è valutata dalla proiezione di un modello di interferenza laser su uno schermo di destinazione calibrato (a) sorgente laser.. (B) Mirror. (C) schermo di destinazione. Pattern di interferenza (d) Laser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (A) Determinazione della zona della fibra in sezione ed in lunghezza ottimale sarcomero (umana = 2,7 um). Assumendo una sezione trasversale ellittica, CSA è calcolato per ciascuna delle cinque posizioni lungo la parte mediana fibra e la media dei cinque misurazioni individuali è segnalato come fibra CSA. 2a rappresenta top diametro vista ed è<html> un asse dell&#39;ellisse, 2b rappresenta vista laterale diametro ed è l&#39;altro asse dell&#39;ellisse. (B) immagini fibra Rappresentante illustrano ciascuna delle cinque misurazioni del diametro corrispondente, sia nella vista dall&#39;alto e laterale. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: Rappresentante forza tracce di sano vasto umano lateralis fibre muscolari (A) Tipo 1 fibre (CSA: 5710 micron 2, F o: 0.89 milioni di euro e sF o: 156 kPa).. (B) Tipo fibra 2a (CSA: 9510 micron 2, F o: 1.66 mN e SF o: 174 kPa). Fibra miosina a catena pesante è stato determinato attraverso l&#39;utilizzo di separazione elettroforetico e argento-colorazione tecniche 22. OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Calcolo della forza attiva massima (F o) (a), vista espansa della risposta forza fibra durante il-gioco che induce il movimento di lunghezza controller avviato in soluzione pre-attivazione.. F P è la forza richiesta per mantenere una lunghezza sarcomero di 2,7 micron con la fibra a riposo. (B) Vista estesa di lunghezza-controller di movimento-gioco che inducono. Si noti che F o F = T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: slittamento (A) cappio di sutura, evidenziato da un &quot;fermo&quot; in vigore traccia durante l&#39;aumento di forza. Controllare per essere sicuri i cicli siano sicuri prima di attivare la fibra. (B) rottura della fibra durante l&#39;attivazione. Può essere dovuta a integrità fibra poveri o trattamento fibra aggressivo durante sutura posto ciclomento. (C) l&#39;attivazione della fibra parziale prematura a causa della contaminazione di camera di pre-attivazione con Ca 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analisi delle proprietà contrattili delle fibre muscolari chimicamente dalla pelle, o permeabilizzate, scheletriche offre un potente strumento con cui valutare la funzione muscolare a livello della cellula muscolare singolo. In questo articolo descriviamo una tecnica valida e affidabile per preparare e testare permeabilizzate fibre muscolari scheletriche in vitro.

Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K Views.  University of Michigan Medical School.  Analisi delle proprietà contrattili delle fibre muscolari chimicamente dalla pelle, o permeabilizzate, scheletriche offre un potente strumento con cui valutare la funzione muscolare a livello della cellula muscolare singolo. In questo articolo descriviamo una tecnica valida e affidabile per preparare e testare permeabilizzate fibre muscolari scheletriche in vitro. 

Video: Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Misura della coesione aggregata da parte del tessuto superficiale Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Ricerca

Bioingegneria

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Ingegneria tessuti muscolo scheletrico di cellule murine progenitrici mioblasti e di applicazione di stimolazione elettrica

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparazione di membrane Light-responsive da un innesto superficie combinata e Postmodifica processo

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.