1. Preparazione aggregato per la misura della tensione superficiale dei tessuti. Per le cellule aderenti, sferoidi può essere formata utilizzando il metodo goccia o generando un foglio coerente di cellule che possono poi essere tagliato in frammenti di 1 mm. Formazione di aggregati con il metodo goccia pendente: <ol><li> Quasi confluenti colture di cellule aderenti dovrebbe essere cresciuta al 90% di confluenza, monostrati dopo di che devono essere risciacquati due volte con PBS. Dopo aver svuotato bene, aggiungere 2 ml (per 100 piastre mm) del 0,05% tripsina-1 mM EDTA, e incubare a 37 ° C fino a staccare le cellule. Fermare tripsinizzazione aggiungendo 2 ml di terreno completo e delicatamente utilizzare un pipetta da 5 ml per triturare il composto fino a quando le cellule sono in sospensione. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. </li><li> Aggiungere 40 microlitri di una 10 mg / ml soluzione madre DNAsi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Vortex brevemente e centrifugare a 200 xg per 5 minuti. </li><li> Gettare il surnatante e lavare pellet con 1 media tessuto completo cultura ml. Ripeto, poi risospendere le cellule in 2 ml di terreno completo coltura dei tessuti. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati e regolare la concentrazione di 2,5 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Togliere il coperchio da un piatto tessuto 60 millimetri cultura e luogo 5 ml di PBS sul fondo del piatto. Questo fungerà da camera di idratazione. </li><li> Invertire il coperchio e utilizzare una pipetta 20 microlitri di depositare 10 gocce microlitri sul fondo del coperchio. Assicurarsi che gocce sono posti sufficientemente distanziati in modo da non toccare. E &#39;possibile mettere almeno 20 gocce al piatto. </li><li> Invertire il coperchio sulla PBS camera piena basso e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 / 95% di umidità, monitorare le gocce giornaliere e incubare fino a quando i fogli di cellule o aggregati si sono formati. </li><li> Una volta forma fogli, essi possono essere trasferiti a fondo rotondo in vetro shaker palloni contenenti 3 ml di terreno completo e incubate in un bagno d&#39;acqua agitazione a 37 ° C e 5% di CO 2 fino a formare sferoidi. </li></ol> Formazione di aggregati con il metodo strato di cellule: <ol start="9"><li> Sospensioni singola cella sono preparato come descritto sopra, ma la concentrazione è regolata a 1x10 6 cellule / ml. </li><li> Trasferire 3 ml di sospensione cellulare a 10 ml a fondo sferico (Belco, Vineland, New Jersey). </li><li> Incubare fiaschi in un bagno d&#39;acqua rotatorio / agitatore (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 37 ° C, 5% di CO 2 per 4 ore a 120 rpm fino a quando le cellule recuperare tripsinizzazione. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta di vetro a fondo rotondo da centrifuga e centrifugare a 200 g in un sottile pellet. Incubare per altri 24 h fino a quando un foglio di forme coerente. </li><li> Capovolgere delicatamente il tubo di cultura per rimuovere il foglio e versare il contenuto della provetta cultura in una piccola capsula di Petri sterile fibra di vetro. </li><li> Usa bisturi micro per tagliare i fogli in frammenti di varie dimensioni. </li><li> Incubare frammenti a 37 ° C sul bagnomaria rotatorio shaker a 120 rpm sotto il 5% di CO 2 per 2 o 3 giorni o fino a diventare sferica. </li></ol> 2. Misura della tensione superficiale aggregato <ol><li> Il tessuto tensiometro superficie. L&#39;apparato è mostrato in fig. 1 e 2. La cella di compressione (Fig. 3) è composto da due camere. La camera esterna (OC) è collegato ad un 37 ° C acqua pompa di circolazione, e serve a regolare la temperatura della camera interna (IC). Le camere sono costruiti in Delrin fresato e contengono quarzo finestre per la visualizzazione dell&#39;aggregato. Abbassare il montaggio (LA) viti nella base della camera interna ed è usato per 1) la posizione di aggregazione nella camera interna, 2) sigillare il fondo della camera interna, 3) elevare l&#39;aggregato di avviare la compressione, e (4 ) controllare la distanza tra le placche parallele e quindi la compressione dell&#39;aggregato. Il nucleo centrale (CC) del gruppo è regolabile. La punta del nucleo centrale (il piedistallo) è composto liscio Teflon e agisce come la piastra di compressione inferiore (LCP). La piastra di compressione superiore (UCP) è un cilindro in teflon 15mm che pende dal braccio della bilancia (B) da una fiamma raddrizzata filo nichel-cromo (NCW) *. Nel corso di un esperimento, l&#39;aggregato di cellule (A) è posizionato sulla piastra inferiore e cresciuto finché non tocca la piastra superiore. La piastra superiore è collegato al braccio della bilancia (B). Compressione dell&#39;aggregato cause spostamento del braccio della bilancia. L&#39;equilibrio è un Cahn / Ventron modello 2000 electrobalance registrazione, che opera secondo il principio dell&#39;equilibrio nullo. Il fulcro del braccio della bilancia ha un armatura all&#39;interno di un campo magnetico permanente. Quando l&#39;equilibrio è in funzione, si modula continuamente la corrente che passa attraverso l&#39;assemblea elettromagnetiche, che a sua volta mantiene il braccio della bilancia in posizione orizzontale. Quando un oggetto è sospeso dal braccio della bilancia, la tensione, che l&#39;equilibrio si applica a tenere il braccio nella horizoposizione ntale, è proporzionale al peso dell&#39;oggetto. Questa tensione misura la forza esterna di compressione applicato al aggregata. La forma aggregata è monitorata mediante osservazione visiva attraverso una x 25 stereoscopio Nikon SMZ10A accoppiato ad un computer dotato di un frame grabber. Al fine di minimizzare l&#39;adesione di aggregati cellulari alle piastre di compressione, sia le piastre di compressione inferiore e superiore sono stati rivestiti con poli (2-idrossietilmetacrilato) {poli (HEMA)}, un materiale polimerico a cui le cellule non aderiscono 16. * Il filo è fiamma raddrizzata per impiccagione di 15 pollici di lunghezza del filo da uno stand storta e un piccolo clip di fissaggio raccoglitore fino alla fine. Un becco Bunsen è poi correre su e giù la lunghezza del filo fino a quando il filo si illumina di rosso. Il filo raddrizzato possono poi essere tagliati nella lunghezza appropriata. Un gancio piccolo è formato piegando il filo circa ¼ di pollice a partire dalla fine con due lame di rasoio. L&#39;altra estremità viene quindi inserito nella canna della piastra di compressione inferiore. </li><li> Compressione aggregata. <ol><li> La camera interna è piena di pre-riscaldato CO 2-indipendente terreni di coltura (Gibco / BRL, NY). </li><li> Aggregati di dimensioni variabili da circa 200-300 μ sono posizionati sulla piastra di compressione più basso (Fig. 4A). Aggregati sono caricati da aspirando un aggregato in terreni di coltura a metà strada la punta di una pipetta Pasteur dotata di un bulbo in silicone, trasferendo la pipetta alla camera interna, e il posizionamento della punta della pipetta al di sopra del LCP. L&#39;aggregato è quindi delicatamente espulso sul LCP premendo delicatamente il bulbo. In alternativa, l&#39;aggregato è lasciato cadere per gravità sul LCP. </li><li> La piastra di compressione superiore (UCP) è posizionato sopra l&#39;aggregato e il permesso di stabilirsi, che istituisce un pre-compressione apparente baseline peso UCP. </li><li> Il LCP viene poi portata fino a quando l&#39;aggregato viene compressa contro l&#39;UCP (Fig. 4B). Regolare l&#39;altezza del nucleo interno del dispositivo sarà inferiore di controllo diversi gradi di compressione. La compressione è monitorata attraverso l&#39;osservazione attraverso un microscopio da dissezione dotato di una telecamera CCD. </li><li> Immagini aggregato vengono catturati, digitalizzati e analizzati utilizzando ImageJ. Apparente variazione di peso UCP è continuamente registrati su un registratore a nastro di carta, la realizzazione di equilibrio forma sia indicata con il livellamento-off della tensione di uscita della bilancia Cahn. Ogni aggregato è sottoposto a 2 gradi diversi di compressione. </li></ol></li><li> Calcolo della tensione superficiale aggregato. A forma di equilibrio, la cohesivity di un aggregato di cellule compressa tra piastre parallele a cui non aderisce possono essere ottenute presso il Young-Laplace l&#39;equazione (Fig. 5), dove σ è cohesivity, F è la forza che agisce per comprimere l&#39;aggregato , πr 3 2 è l&#39;area della superficie dell&#39;aggregato su cui viene esercitata forza F e R 2 e R 3 sono, rispettivamente, il raggio dell&#39;equatore dell&#39;aggregato compressi e il raggio di un arco definizione del suo profilo normale alla superficie alla compressione piatti e si estende tra loro (Fig. 6). Misurare la forza di compressione e geometria alla forza ed equilibrio la forma e l&#39;applicazione di queste misure per la Young-Laplace equazione genera valori numerici della tensione apparente superficie del tessuto. Dopo aver raggiunto l&#39;equilibrio e il calcolo di σ 1, aggregati vengono decompressi e ha permesso di avvicinare un equilibrio secondo e σ 2 è calcolato come sopra descritto. </li><li> Conferma di liquidità aggregata. La tensione superficiale calcolato di un aggregato liquido, quando viene sottoposto a due diverse compressioni rimarrà costante. In tali aggregati il rapporto tra σ 2 / σ 1 sarà uguale a 1 e sarà inferiore al rapporto tra la forza applicata ad ogni compressione successive (F 2 / F 1). Al contrario, la tensione superficiale calcolato di un aggregato elastica obbedisce la legge di Hooke e aumentare proporzionalmente alla forza applicata. Per gli aggregati elastico il rapporto tra σ 2 / σ 1 non sarà uguale a 1, ma sarà invece l&#39;approccio al rapporto di F 2 / F 1. La tensione superficiale del liquido aggregati anche essere indipendente dalle dimensioni aggregate 2,17. Misure unica in cui tensione superficiale è indipendente dalla forza applicata e le dimensioni vengono utilizzati per calcolare σ media per ciascuna linea cellulare. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Di seguito una tabella di risultati TST tipici per aggregati di fibroblasti della prostata di ratto (RPF) e nel ratto cellule muscolari lisce della prostata (RPSMC). Come si può vedere in fig. 7 aggregati di cellule RPF hanno una tensione superficiale di 22,8 ± 1,1 dyne / cm. Inoltre, i valori medi di tensione superficiale misurati dopo la compressione 1 e dopo la compressione 2 erano statisticamente identiCal se confrontato con un paired t-test. Abbiamo anche confrontato i rapporti di σ 2 / σ 1 e F 2 / F 1 per assicurare che questi aggregati non obbedire alla legge di Hooke, come farebbero se si comportassero come solidi elastici. Come dimostrato nella tabella 1, il rapporto tra σ 2 / σ 1 in effetti l&#39;approccio 1.0. Inoltre, il rapporto di F 2 / F 1 era significativamente maggiore di σ 2 / σ 1 (paired t-test, P &lt;0,05), confermando che questi aggregati non obbedire alla legge di Hooke e di fatto si comportano come liquidi. In RPSMCs contrasto obbedito legge di Hooke. Come è evidente nella tabella 1, il rapporto tra σ 2 / σ 1 è significativamente maggiore di 1 e non era statisticamente differente da quello di F 2 / F 1. Per dimostrare ulteriormente a liquido come il comportamento, abbiamo esplorato la relazione tra tensione superficiale (σ) e al volume totale. Come si può vedere in fig. 8, il volume è indipendente dal sigma per le cellule RPF (linea di regressione rosso, r 2 = 0.002), mentre sembra che vi sia qualche dipendenza della sigma sul volume per RPSMCs (linea di regressione blu, r 2 = 0,146). Questi dati confermano ulteriormente che aggrega RPF si comportano in un liquido-come il modo, mentre quelli di RPSMCs sembrano comportarsi più come solidi elastici. Solo quelli Misure ottenute da aggregati comportarsi come liquidi sarebbe stato usato per calcolare la tensione superficiale. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Panoramica del tensiometro superficie del tessuto. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Una visione più dettagliata della camera tensiometro (pannello di destra). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Schematica della camera di tensiometro. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Immagini di non compresso (A) e compresso (B) aggregati. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. L&#39;equazione di Laplace. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Schema di una goccia di liquido compresso tra due piastre parallele alla quale aderisce male, all&#39;equilibrio della forma. R 1 e R 2 sono i due raggi principali di curvatura, all&#39;equatore la goccia e in un piano che passa il suo asse di simmetria, rispettivamente. R 3 è il raggio della zona circolare la goccia di contatto sia con piastra di compressione. H è la distanza tra le piastre di compressione superiore e inferiore. X è un lato di un triangolo rettangolo con ipotenusa R 2 si estende ad un punto di contatto tra la superficie della goccia e sia la piastra di compressione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dyne / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dyne / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> σ 1,2 (dyne / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / 1 σ </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 e F 2 F 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Figura 7. Misurazioni TST e la conferma di liquidità aggregata per aggregati di fibroblasti della prostata di ratto e cellule muscolari lisce. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Relazione tra sigma e il volume degli aggregati di RPF (linea rossa) e RPSMCs (linea blu).

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates.">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin.">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li><li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Misurare la coesione aggregato da TST è relativamente semplice. Vi sono, tuttavia, passaggi chiave che deve essere padroneggiato al fine di generare dati TST utilizzabile; 1) aggregati deve essere &quot;sano&quot;. Questo può essere controllato facendo in modo che la formazione di aggregati inizia con le cellule che sono alla confluenza ottimale prima di distacco. Formato aggregato e l&#39;ora in cultura deve essere controllato anche a minimizzare lo sviluppo di un core necrotico all&#39;interno dell&#39;aggregato, 2)...

<ul><li> acqua bagno / agitatore (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml a fondo sferico (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

Su misurazioni rigorose degli intercellulare energia di legame può essere effettuato solo con metodi fondati principi termodinamici in sistemi all&#39;equilibrio. Abbiamo sviluppato superficie tensiometry tessuto (TST) specificamente per misurare l&#39;energia libera della superficie di interazione tra le cellule. I concetti alla base biofisica TST sono stati precedentemente descritti in dettaglio 1,2. Il metodo si basa sull&#39;osservazione che le cellule reciprocamente coesa, se mantenuta in agitazione cultura, si assemblano spontaneamente in cluster. Nel corso del tempo, questi cluster si completano a formare sfere. Questo arrotondamento comportamento simula il caratteristico comportamento dei sistemi liquidi. Intercellulare energia di legame è misurata comprimendo aggregati sferici tra piatti paralleli in un design personalizzato tensiometro tessuto superficiale. La stessa equazione matematico utilizzato per misurare la tensione superficiale di una goccia di liquido viene utilizzato per misurare la tensione superficiale del tessuto 3D-come aggregati sferici. L&#39;equivalente cellulare della tensione superficiale liquido intercellulare energia di legame, o più in generale, cohesivity tessuti. Studi precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che la tensione superficiale dei tessuti (1) predice come due gruppi di cellule embrionali potranno interagire tra loro 1-5, (2) può influenzare fortemente la capacità dei tessuti di interagire con biomateriali 6, (3) può essere modificato non solo attraverso la manipolazione diretta di caderina-based coesione intercellulare 7, ma anche per la manipolazione di molecole chiave ECM come FN 8-11 e 4) si correla con potenziale invasivo di cancro al polmone 12, fibrosarcoma 13, 14 e tumore al cervello tumore alla prostata linee cellulari 15. In questo articolo andremo a descrivere l&#39;, particolare dell&#39;apparato i passaggi necessari per generare sferoidi, per caricare il sferoidi nella camera di tensiometro, di avviare la compressione aggregati, e per analizzare e convalidare le misure di tensione superficiale del tessuto generato.

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Descriviamo un metodo di misurazione dell&#39;energia di legame, esprimibile come la tensione superficiale dei tessuti, tra le cellule all&#39;interno del tessuto 3D-come aggregati. Le differenze di tensione superficiale del tessuto hanno dimostrato di correlare con l&#39;invasività del polmone, dei muscoli, e tumori al cervello, e sono determinanti fondamentali di stabilire relazioni spaziali tra i diversi tipi di cellule.

Misura della coesione aggregata da parte del tessuto superficiale Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. Descriviamo un metodo di misurazione dell'energia di legame, esprimibile come la tensione superficiale dei tessuti, tra le cellule all'interno del tessuto 3D-come aggregati. Le differenze di tensione superficiale del tessuto hanno dimostrato di correlare con l'invasività del polmone, dei muscoli, e tumori al cervello, e sono determinanti fondamentali di stabilire relazioni spaziali tra i diversi tipi di cellule.

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Bioingegneria

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparazione di membrane Light-responsive da un innesto superficie combinata e Postmodifica processo

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adattamento del processo Electrospinning per fornire tre ambienti unici per un Tri-livello<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della parete delle vie aeree

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.