Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society, il tedesco Cancer Research Center, l&#39;Università di Tubinga, e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (concessione n. 0.312.040). Ringraziamo Eduard Hermann per averci aiutato ad automatizzare l&#39;analisi dei dati curva forza e il Dr. Jakob Suckale un&#39;attenta lettura di questo manoscritto.

1. Preparazione di doppi strati lipidici supportati (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparazione di lipidi miscela e multilamellari vescicole Sospensioni <ol><li> Preparare i seguenti buffer in anticipo. <ol><li> Preparare tampone PBS a concentrazioni di 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, e 137 mM NaCl, pH 7,2. </li><li> Preparare SLB (bistrato lipidico supportato) tampone a concentrazioni di NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Preparare una soluzione di 1 M CaCl 2. </li></ol></li><li> Sciogliere le seguenti lipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata: ad esempio, di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, sfingomielina (SM) a 25 mg / ml e colesterolo (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Prendere 18,38 ml di DOPC, 17,10 ml di SM e 11.30 ml di Chol per ottenere una soluzione con 1 mg di lipidi totali in rapporto 2: 2: 1 DOPC: rapporto molare Chol: SM. Variare i volumi di conseguenza, basandosi sul concentrations dei lipidi preparate in 1.1.2. Tuttavia, mantenere il rapporto molare di 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, come cambiando il rapporto molare cambierà le caratteristiche di fase della membrana 25. </li><li> Mescolare la soluzione completamente nel vortex. Aggiungere un colorante fluorescente lipidico a 0,05 moli% se si desidera visualizzare il doppio strato con un microscopio a fluorescenza. Nota: La famiglia di dialkylcarbocyanines a catena lunga, come ha fatto, DII e DiO abbracciano una vasta gamma di lunghezze d&#39;onda e possono essere utilizzati in posizione ideale per etichettare membrane lipidiche. In alternativa, i lipidi fluorescente, come rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterolo possono essere utilizzati. In ogni caso, la concentrazione del colorante deve essere ottimizzato in base all&#39;impostazione microscopia, tenendo presente che alte concentrazioni di fluoroforo legato al lipide possono modificare il comportamento lipidica 19. </li><li> Asciugare il cloroformio con N 2 gas (o qualsiasi gas inerte disponibili come Ar e He). </li><li> Ulteriore t seccoegli lipidico miscela sotto vuoto per almeno 1 ora. Nota: Se si conserva questa miscela lipidica, eliminare l&#39;aria con gas inerte (N 2, Ar o He) e conservare a -20 ° C. Aliquota lipidi-in-cloroformio in eccesso in piccole fiale marrone. Asciugarli in un modo simile come la miscela di lipidi, spostare l&#39;aria con gas inerte (N 2, Ar o He) e conservare a -20 ° C. </li><li> Sciogliere i lipidi essiccati in tampone PBS ad una concentrazione di 10 mg / ml. </li><li> Vortex la miscela vigorosamente per circa 20 secondi a 1 minuto per ottenere una sospensione torbida, contenente vescicole multilamellari. Assicurarsi che il non ci sono film lipidici sporgenti ai lati del flacone. </li><li> Distribuire la sospensione in 10 aliquote microlitri (1 mg di lipidi rende 10 aliquote). </li><li> Conservare a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> Preparazione di unilamellari vescicole Nota: I vari formati di vescicole unilamellari possono essere preparate con il metodo sonicazione o il metodo di estrusione. Sonicazione utilizza sound energia per agitare la miscela e separare gli strati della sospensione multilamellare. Questo è indicato da ripulire della sospensione nebuloso. Estrusione costringe le vescicole multilamellari passare attraverso un filtro a membrana con dimensione dei pori definito. <ol><li> Metodo Sonicazione <ol><li> Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB. </li><li> Trasferire il composto in piccoli (2 ml) fiale di vetro ricoperti e sigillare con Parafilm. </li><li> Sonicare la miscela a temperatura ambiente in un bagno sonicatore per 10 minuti o fino a quando diventa chiaro per produrre piccole vescicole unilamellari (SUV, inferiore a 50 nm di diametro). </li></ol></li><li> Metodo di estrusione <ol><li> Prendete i 10 ml di sospensioni lipidiche multilamellari e aggiungere 150 ml di tampone SLB. </li><li> Trasferire la sospensione in un tubo criogenico. </li><li> Congelare la sospensione lipidica immergendo il tubo criogenico per alcuni secondi in azoto liquido. </li><li> Scongelare lasospensione lipidica immergendo il tubo criogenico in un bagno d&#39;acqua a temperatura ambiente oa 37 ° C per alcuni minuti. Ripetere le fasi gelività almeno 10 volte. </li><li> Per estrudere la sospensione lipidica, usare una membrana di policarbonato con dimensioni 200 nm pori (altre dimensioni dei pori sono disponibili come, 100 nm o 400 nm) e di un dispositivo di estrusione commerciale 26. Nota: Attualmente, ci sono due dispositivi estrusori disponibili in commercio: un estrusore manuale è disponibile per piccoli volumi (200 microlitri a pochi ml). In questo caso, il campione viene estruso attraverso la membrana spingendo manualmente la sospensione avanti e indietro tra due siringhe. A seconda del produttore, aliquote lipidi dovrebbero essere combinati per raggiungere volume minimo del set up. Per i volumi più grandi (fino a 50 ml) sono utilizzati dispositivi più sofisticati in cui la sospensione è forzato attraverso la membrana di policarbonato utilizzando gas compresso. Condizioni di impianto e di estrusione possono cambiare in base alla model. Consultare le istruzioni del produttore prima dell&#39;uso. Questo protocollo si riferisce al estrusore manuale per piccoli volumi. </li><li> Equilibrare l&#39;estrusore in acqua facendo passare l&#39;acqua attraverso l&#39;estrusore. Immergere la membrana in acqua. </li><li> Posizionare la membrana tra i due pistoni, montare il dispositivo ed equilibrare in tampone, facendo passare il buffer attraverso l&#39;estrusore, da una siringa all&#39;altra. Questa fase consente inoltre testare la permeabilità del sistema. Se perde, smontare e rimontare nuovamente cambiare la membrana. </li><li> Prendere la sospensione lipidica utilizzando una siringa dell&#39;estrusore (&#39;lato sporco&#39;). </li><li> Applicare la siringa contenente la sospensione lipidica su una camera e la siringa vuota sulla camera opposta. </li><li> Premere la siringa su una estremità. Far passare la soluzione attraverso la membrana e nella siringa avversaria. Questo è il passo 1 °. </li><li> Passare attraverso la membrana per un totale di 31 volte taliche la soluzione finisce sulla siringa opposta (&#39;lato pulito&#39;). Nota: Controllare la membrana dopo l&#39;estrusione. Se è stato rotto, allora il processo di estrusione, non ha avuto successo e deve essere ripetuto. </li><li> Svuotare la siringa in un piccolo tubo. Grandi vescicole unilamellari (Luvs) sono stabili per 1-2 giorni se conservato a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione di Mica e vetrini <ol><li> Lavare coprioggetto prima in acqua e poi in etanolo. Aria secca. </li><li> Prendete dischi mica e staccare lo strato esterno con del nastro adesivo. </li><li> Fissare il disco mica sul vetrino. Colle ottici trasparenti sono ottimali in modo che si possa controllare i doppi strati con un microscopio a fluorescenza. </li><li> Fissare cilindri di plastica (diametro 2,5 centimetri esterno, due centimetri di diametro interno, e 0,5 cm di altezza) con ottica colla / grasso. Assicurarsi che tutto sia sigillata e che non vi siano perdite. Usare grasso quando vogliono riutilizzare i cilindri in quanto possono essere facilmente smontato dal the vetrino e lavato. Le dimensioni dei cilindri di plastica dipendono dalle dimensioni del supporto cantilever AFM e devono essere regolati di conseguenza. </li></ol></li><li> Deposizione di unilamellari vescicole su un solido appoggio <ol><li> Pipettare l&#39;intera soluzione liposomiale direttamente sulla mica. Aggiungere più di buffer SLB di raggiungere un volume di 300 ml. </li><li> Aggiungere 0,9 ml di soluzione 1 M di cloruro di calcio per raggiungere una concentrazione finale di 3 mM Ca 2+. </li><li> Incubare a 37 ° C per 2 minuti e poi a 65 ° C per almeno 10 min. Coprire sempre i doppi strati con tampone. Il contatto con le bolle d&#39;aria e aria la distruggerà. Durante l&#39;incubazione, aggiungere più tampone se necessario, soprattutto se incubando a temperature più elevate. Nota: le temperature di incubazione variano secondo le miscele di lipidi e le fasi necessarie. Occorre tempo di incubazione di almeno 10 minuti per formare bistrati supportati, ma potrebbe essere più lungo, a seconda della temperatura e della composizione. </li><li> Lavaggioil doppio strato con calda (65 ° C) del buffer SLB 15-20 volte per rimuovere calcio e vescicole non fuse. Prestare particolare attenzione durante le fasi di lavaggio per mantenere il doppio strato sotto buffer e pipetta delicatamente la soluzione di lavaggio per evitare di distruggere il doppio strato. </li><li> Raffreddare bistrati supportati a temperatura ambiente prima misure AFM. Ciò è necessario per formare le diverse fasi della membrana e ridurre la deriva termica dello strumento. </li></ol></li></ol> 2. Forza Atomica Microscopia Misure 11,12 <ol><li> Imaging Nota: eseguire a forza atomica immagini di microscopia in modalità contatto o in modalità tapping. Immagini supportati bistrati in soluzione; non consentono soluzione evapori completamente, come questo distruggerà i doppi strati. Come ci si potrebbe lavorare con tampone, osservare le precauzioni di sicurezza per fare in modo che ogni parte AFM è protetto da fuoriuscite di liquidi. <ol><li> Selezionare una mensola morbido (di seguito è consigliato di 0,2 N / m costante della molla) e montarlo in tegli AFM. La scelta di cantilever rigidità è più critica per la spettroscopia di forza (e se ne parlerà più avanti). </li><li> Montare il campione sul palco AFM e fare in modo che tutti i moduli di vibrazione-isolamento sono attivate. Attendere almeno 15 minuti per equilibrare e ridurre la dispersione termica del sistema. A seconda della AFM set-up, messa a punto e di imaging specifiche possono variare. Consultare manuale del costruttore. </li><li> Avvicinare il campione con la punta AFM fino contatto. </li><li> Poiché doppi strati lipidici sono solitamente 4 nm in altezza, utilizzare la Z-gamma dello strumento che darà il più alto z-risoluzione (ad esempio 1,5 micron). </li><li> Seleziona una regione per immagine. Per avere una panoramica del doppio strato lipidico, a 50 micron x 50 micron o 25 micron x 25 micron regione sarà un buon punto di partenza per l&#39;immagine. Se appaiono le caratteristiche più piccole, immagine una lattina nelle aree più piccole (10 micron x 10 micron, o 2 micron x 2 micron). La scelta della zona di imaging dipende anche dalla r lavorareange dello scanner piezoelettrico. Si prega di consultare il manuale dello strumento per questo. </li><li> Come bistrati sono molto fragili, regolare il set point della punta AFM durante l&#39;imaging di mantenere la forza al minimo e corretta per deriva termica, restando a contatto con il campione. Nella modalità di contatto, ridurre al minimo il set point. In modalità toccando, massimizzare il set point. </li><li> Le immagini del processo di montaggio ogni linea di scansione per le funzioni di livellamento polinomi. Eseguire la rimozione delle linee per le scansioni che perdono contatto con la membrana utilizzando il software proprietario della società di produzione AFM. </li></ol></li><li> Spettroscopia Forza <ol><li> Calibrare il cantilever seguendo le istruzioni in base al protocollo del produttore. La calibrazione consente la conversione del segnale elettrico di fotodiodi a forza (Figura 1B). <ol><li> Calibrare la sensibilità della punta per misurare deflessione come movimento z-piezo (in unità di lunghezza) invece del segnale elettrico in volt. <br /&gt; Nota: AFM rileva variazioni della deflessione del cantilever utilizzando un laser riflessa sul retro del cantilever. Il laser raggiunge un fotodiodo in grado di rilevare la posizione spaziale del punto laser. Un cambiamento nella deflessione della cantilever come si piega a contatto con il campione viene rilevata da questo fotodiodo come &quot;deflessione verticale&quot;, e questo è in unità di tensione. Poiché il cantilever viene spostato dalla z-piezo, la deflessione verticale è legato al movimento in z-piezo. Il rapporto tra la deflessione verticale e z-movimento è chiamato sensibilità e converte la tensione a distanza. </li><li> Calcolare la costante della molla a sbalzo con il metodo frequenza del rumore termico, solitamente incorporato nel software AFM. In questo metodo, tracciare l&#39;ampiezza di vibrazione dal rumore rispetto alla frequenza di oscillazione, creando una trama densità spettrale di potenza. Questo grafico mostra un picco intorno alla frequenza di risonanza. La frequenza dove l&#39;i dell&#39;ampiezzas il più grande è la frequenza di risonanza. Montare una funzione Lorentziana intorno al picco di calcolare automaticamente la costante della molla dal software. Alcune risorse utili per la teoria del metodo rumore termico sono riportati nei riferimenti 27-30. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;imaging un&#39;area del doppio strato, selezionare una regione x 5 micron 5 micron nel doppio strato effettuare spettroscopia di forza. </li><li> Impostare la AFM modo che ci vuole forza curve di una griglia di quella regione 16 x 16. Ciò si traduce in 256 curve di forza per regione. Lo spazio tra i due punti adiacenti dovrebbe essere sufficiente ad evitare che l&#39;area membrana essendo controllato di un punto coinciderebbe con il punto successivo. Questo dipende dal raggio della punta. Una distanza 100 nm tra due punti sarebbe ideale. Dividere il 5 micron x 5 micron regione in 16 x 16 griglia. A seconda delle dimensioni della fase, si può selezionare una regione più piccolo o più grande, e quindi regolare la dimensione della griglia di conseguenza. </li><li> Set spostamento z-piezo per400 nm. Questo determina la portata massima di movimento del z-piezo. Esso dovrebbe essere abbastanza grande per assicurarsi che il cantilever sia completamente ritirata dal campione tra le misurazioni. </li><li> Impostare velocità di avvicinamento a 800 nm / sec e ritrarre la velocità a 200 nm / sec. Utilizzare una velocità di avvicinamento tra 400 a 6.000 nm / sec a seconda della composizione bistrato e fase lipidica da studiare 6,16. </li><li> Dopo aver impostato tutti i parametri, acquisire forza curve, premendo il tasto &quot;run&quot; del software AFM. </li><li> Salvare forza curve come forza contro le curve di altezza (una misura di movimento z-piezo). Ciò non tiene conto della curvatura del cantilever a contatto con il campione. Durante la fase di elaborazione dei dati, il software permette di AFM correzione per cantilever flessione per ottenere forza contro curve di separazione punta-campione (Figura 1C), che darà valori corretti per lo spessore doppio strato. I valori di correzione sono di solito incorporati nel CALIBRAZzione, che viene salvato ad ogni curva di forza. Calcolare separazione punta-campione sottraendo la deflessione verticale dal movimento piezo in un determinato punto. Nota: Il picco nella curva forza approccio (il valore della forza scende anche se il movimento cantilever è ancora sul ciclo di accostamento) è la forza innovativa della membrana, mentre la differenza tra la posizione di questo picco e la posizione del punto dove la forza comincia a sollevarsi fornisce nuovamente lo spessore della membrana. </li><li> Acquisire almeno 500 curve di forza per ogni condizione di ottenere buone statistiche. Tracciare un istogramma dei valori utilizzando programmi come origine o MatLab, e montare gli istogrammi di una distribuzione gaussiana per ottenere il picco e la larghezza della distribuzione. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

SLB composti DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono formati sulla mica dopo vescicole adsorbimento e rottura indotta da cloruro di calcio. Questa composizione lipidica separato in L d e L o fasi. La fase L o si arricchisce in sfingomielina e colesterolo ed è meno fluido / più viscoso (Figura 1A) che l&#39;L d di fase 11. La separazione di L o di fase L d manifesta come strutture circolari elevata sopra la circostante (Figura 1...

Atomic Force Microscopy (AFM) genera un&#39;immagine di una superficie di scansione attraverso l&#39;area del campione utilizzando una mensola con una punta molto affilata 1. Il movimento del cantilever sonda la topologia superficiale del campione. AFM è stato ampiamente applicato alle molecole biologiche - come proteine, DNA e membrane, grazie alla sua versatilità nell&#39;analisi campioni fissati in aria o stato quasi native nel liquido 2-5. Oltre alla sua capacità di imaging ad alta risoluzione in nanometri, il cantilever AFM agisce come una molla per sondare forze di interazione (adesione e repulsione) e le proprietà meccaniche del campione di 5,6. Questo è noto come spettroscopia di forza. In questa modalità, la prima sonda si avvicina al campione e esercita una forza su di esso, allora viene retratto fino perde contatto con il campione (Figura 1A). Le curve generate mostrano forza in funzione della distanza del cantilever sia per l&#39;applicazionescarafaggio e retrazione. Diversi proprietà incluso il modulo elastico per misurare la rigidità di un materiale, e le forze di adesione possono essere derivati. Bistrati lipidici supportati sono membrane biologiche modello situata sulla sommità di un supporto solido - solitamente mica, vetro borosilicato, silice fusa, o ossidato silicio 7. Sono preparati utilizzando varie tecniche come vescicole deposizione, metodo Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. L&#39;imaging AFM è stato utilizzato per seguire la formazione di questi bistrati supportati 10, e sonda diverse strutture formate da membrane di diverse composizioni 11-15. Esecuzione di spettroscopia di forza su bistrati risultati supportati in un picco nella curva approccio. Questo picco indica la forza necessaria per perforare il doppio strato, e si chiama forza rivoluzionaria. Lo spessore doppio strato può essere misurata utilizzando la curva della forza 6. La forza innovativa tipica di bistratirange compreso tra 1-50 nN 6. Queste proprietà dipendono imballaggio lipidi (liquido o gel fase) e la struttura (acil lunghezza della catena e il grado di insaturazione) e modificata da agenti membrana attiva 16. La teoria dietro la rottura è stato spiegato il 17 ed altri parametri sperimentali come cantilever morbidezza, il raggio e la velocità di punta approccio influenzare anche la forza rivoluzionaria 15,16,18. Spettroscopia di forza è stato utilizzato per analizzare le proprietà di diverse fasi lipidiche 11,19, composizione-dipendente cambiamenti 12,20, così come gli effetti di altre biomolecole, quali peptidi, sulla stabilità della membrana 21. L&#39;orientamento piatta di bistrati supportati è vantaggioso per combinare AFM con altri metodi come la risonanza plasmonica superficiale 22 e microscopia a fluorescenza 11,19 per meglio caratterizzare struttura e le proprietà delle membrane. Questo video proto dettagliatacol lo scopo di preparare i doppi strati lipidici supportati con vescicole deposizione e analizzarli con AFM e spettroscopia di forza. Mentre vescicole di varie dimensioni possono essere usati per preparare bistrati, questo protocollo si concentra sulle piccole e grandi vescicole unilamellari. Bistrati supportati quella fase separano in liquido ordinato (L o) e disordinati (L d) fasi liquide sono state caratterizzate 11,15. La membrana è composta di-oleoyl-fosfatidilcolina (DOPC), sfingomielina (SM) e colesterolo (Chol) a 2: 2: 1 ratio. Questi modelli di composizione delle zattere lipidiche, che sono proposti a comportarsi come piattaforme importanti per il traffico di proteine ​​e di smistamento, segnalazione cellulare e altri processi cellulari 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogenphosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), &gt;99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenphosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 24&amp;nbsp;x&amp;nbsp;60&amp;nbsp;mm, 1&amp;nbsp;mm thickness</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&amp;nbsp; Always handle mica with gloves or tweezers.</td></tr><tr><td>Laboratory Equipment Grease</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (&lt;a href=&quot;http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf&quot;&gt;Data sheet&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Silicon Nitride AFM Cantilever&amp;nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60&amp;nbsp;nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Doppi strati lipidici supportati composto da DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) sono state visualizzate con AFM (Figura 2 AC). A causa della composizione lipidica, sono stati osservati SM / Chol-ricchi L DOPC ricchi fasi L d oe. Il profilo altezza da immagini AFM può fornire importanti informazioni sulla struttura della membrana. Osservando il profilo altezza, lo spessore doppio strato può essere misurato in presenza di difetti nella membrana (Figura 2B), ovvero la differenza di alte...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Views.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Video: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Ricerca

Biochimica

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Ingegneria

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Bioingegneria

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Visualizing Solution Structure at Solid-Liquid Interfaces using Three-Dimensional Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the solution conditions such as ion concentrations, pH, ligands, and trace additives, as well as the underlying crystallography and chemistry. In this context, three-dimensional fast force mapping (3D FFM) has emerged as a promising tool for investigating solution structure at interfaces. This capability is based on atomic force microscopy (AFM) and allows the direct visualization of interfacial regions in three spatial dimensions with sub-nanometer resolution. Here we provide a detailed description of the experimental protocol for acquiring 3D FFM data. The main considerations for optimizing the operating parameters depending on the sample and application are discussed. Moreover, the basic methods for data processing and analysis are discussed, including the transformation of the measured instrument observables into tip-sample force maps that can be linked to the local solution structure. Finally, we shed light on some of the outstanding questions related to 3D FFM data interpretation and how this technique can become a central tool in the repertoire of surface science.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione della struttura della soluzione su interfacce solido-liquido utilizzando la mappatura tridimensionale della forza rapida

Here, we present a protocol for using three-dimensional fast force mapping - an atomic force microscopy technique - for visualizing solution structure at solid-liquid interfaces with the subnanometer resolution by mapping the tip-sample interactions within the interfacial region.

Visualizzazione della struttura della soluzione su interfacce solido-liquido utilizzando la mappatura tridimensionale della forza rapida

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the ...

Chimica

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Microscopia a forza atomica Nanoindentazione basata su sbalzo: misure di proprietà meccaniche su scala nanometrica in aria e fluido

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

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