The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

1. VDJ Amplificazione 1.1) Estrazione del DNA da campioni tumorali <ol><li> Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di congelati PTOM incorporati tessuti normali e maligni. <ol><li> Digest 10-30 sezioni sottili di tessuto incorporato tagliato da un microtomo criostato in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na 2 EDTA) con Proteinasi K (0,5 mg / ml, concentrazione finale ) e 0,625% SDS in una provetta da centrifuga da 15 ml in un bagno d&#39;acqua per una notte a 37 °. </li><li> Aggiungere 1 ml di NaCl satura (5 M) alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi. </li><li> Centrifugare a 1100 xg per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere due volumi di 100% di etanolo. </li><li> Miscelare invertendo la provetta 6-8 volte. Centrifugare a 5.000 xg per 60 min a 4 ° C per raccogliere il DNA precipitato. </li><li> Lavare il pellet di DNA due volte con il 70% di etanolo. Centrifuge a 5.000 xg per 15 min ogni tempo per raccogliere il pellet. </li><li> Sciogliere DNA in 100-400 microlitri tampone TE a temperatura ambiente su un agitatore overnight stanza. La resa del DNA è 5 a 200 mg (concentrazione finale tra 50-500 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto </li></ol></li><li> Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di, incorporato (FFPE) tessuto normale o maligni paraffinato fissati in formalina. <ol><li> Incubare sezioni di paraffina in 1 ml due volte xilene a temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga a Sparaffinare. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Incubare sezioni in 1 ml di etanolo al 100% per due volte a temperatura ambiente, 10 min ogni volta per rimuovere residui xileni. Raccogliere le sezioni di tessuto facendo girare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. La paraffina è completamente sciolto a questo punto e solo la sezione di tessuto è restanti. </li><li> Asciugare sezioni in camera temperature per 10-15 minuti. </li><li> Fare un / soluzione di 0,5 mg ml proteinasi K con 1x tampone PCR (diluito da 10x tampone PCR con acqua priva di nucleasi). Aggiungere la soluzione proteinasi K per i campioni in un volume finale di 50-100 microlitri e incubare una notte a 37 ° C. </li><li> Riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 minuti per inattivare proteinasi K. Nota: In questo passaggio, il DNA campione viene sciolto in tampone PCR e può essere utilizzato nei passaggi 1.2 e 1.3 direttamente. La resa del DNA è da 0,5 a 20 mg (concentrazione finale tra 10-200 ng / ml) a seconda delle dimensioni del tessuto. </li></ol></li></ol> 1.2) valutazione della qualità del DNA <ol><li> Mescolare 0.25 microlitri DNA polimerasi Taq con 45 ml di master mix dal kit scala commerciale in un tubo di PCR. </li><li> Aggiungere 5 microlitri DNA preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 nella provetta PCR e mescolare bene pipettando su e giù per almeno 5 volte. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per7 min; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C. </li><li> Preparare un gel di agarosio 2% in TBE (Tris / borato / EDTA). </li><li> Mescolare 20 microlitri PCR con 4 ml 6x colorante di caricamento, e caricare su un gel di agarosio 2%. </li><li> Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di gel immaginare. Nota: i campioni che producono 5 prodotti PCR con dimensioni di 100, 200, 300, 400, e 600 bp sarà continuato a generare ampliconi VDJ. ATTENZIONE: etidio bromuro è un potente mutageno. Si prega di trattare con estrema cautela, indossando indumenti protettivi, cioè guanti, e smaltire in contenitori specifici per le linee guida dell&#39;istituzione. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione quadro 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mescolare 45 microlitri master mix dall&#39;etichetta tuboEd come &quot;Mix 2&quot; di una somatica IGH ipermutazione test per il rilevamento del gel kit commerciale, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e il DNA del campione 5 ml preparata da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; poi 72 ° C per 10 minuti e tenere a 15 ° C. </li><li> Risolvere l&#39;intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi. </li><li> Macchia gel di agarosio con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione e individuare prodotti di PCR con un sistema di imaging gel. Un amplicon monoclonale è previsto con la gamma di dimensioni di 310-380 bp. </li><li> Accise la porzione gel contenente l&#39;amplicone monoclonale tra 310-380 bp. </li><li> Purificare DNA da gel asportato utilizzando un kit di Gel Extraction standard secondo il protocollo del produttore. Nota: per i campioni che i frammenti FR1 potrebbero essere ottenuti, non c&#39;è bisogno di ampiamente IGVHFR2 e IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplifica ricombinato IgH VDJ Segmento dalla Regione Framework 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mescolare 45 microlitri master mix dal tubo etichettato come &quot;Tube B&quot; di un gene IGH commerciale clonalità test per kit di rilevamento del gel, 0,25 ml Taq DNA polimerasi, e campione di DNA 5 microlitri preparati da 1.1.1.7 o 1.1.2.5 in un tubo di PCR . </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni per amplificare il DNA: 95 ° C per 7 minuti; seguita da 35 cicli di 45 secondi a 95 ° C, 45 sec a 60 ° C e 90 secondi a 72 ° C; quindi 72 ° C per 10 minuti e lasciare a 15 ° C. </li><li> Risolvere l&#39;intero prodotto di PCR in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi. </li><li> Visualizza prodotto di PCR (s) di 0,5 mg / ml colorazione con etidio bromuro. Un amplicone monoclonale può essere osservato all&#39;interno della gamma di dimensioni di 250-295 bp. </li><li> Accise la porzione gel contenente l&#39;amplicone monoclonale tra 250-295 bp. </li><li> Purificare DNA da gel asportato utilizzando un estratto di normale Gelion Kit secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 1.4) Ottimizzare VDJ PCR <ol><li> Utilizzare le seguenti condizioni di PCR modificate per amplificare IgVHFR1 e IgVHFR2 usando DNA non ottimale: 95 ° C per 7 minuti, 40 cicli di 95 ° C per 60 sec, 60 ° C per 60 sec e 72 ° C per 90 sec, estensione finale a 72 ° C per 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Biblioteca Preparazione e Sequencing 2.1) Biblioteca Preparazione 2.1.1) Fine-riparazione <ol><li> Trasferire VDJ prodotto di PCR da 1.3 in un tubo di PCR e aggiungere Risospensione tampone da campione di DNA kit di preparazione per portare il volume a 60 ml. </li><li> Aggiungere 40 ml di Fine Riparazione Mix da campione di DNA Kit di preparazione e mescolare accuratamente. </li><li> Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C. </li><li> Mescolare 136 ml sfere magnetiche e 24 microlitri PCR gacqua rade primo di una provetta da 1,5 ml, quindi trasferire l&#39;intera reazione finale di riparazione da 2.1.1.3 nel tubo 1,5 ml e mescolare bene con la soluzione perline. </li><li> Porre le provette su un supporto magnetico per 2 minuti per consentire la separazione delle sfere dalla soluzione. Aspirare il surnatante, e lavare le perline con l&#39;80% fresco preparato EtOH due volte mentre il tubo è sul supporto magnetico. </li><li> Aspirare la soluzione di etanolo completamente e consentire alle sfere di asciugare all&#39;aria per 15 min a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Prendete il tubo dal supporto e risospendere magnetici perle a 17,5 ml Resuspension Buffer. </li><li> Porre le provette di nuovo sul supporto magnetico per 2 minuti a perline separati dal Resuspension Buffer. Rimuovere la Resuspension Buffer (prodotto finale di riparazione è risospeso nel buffer Resuspension ora) in una provetta PCR clean. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Aggiungere 12,5 ml mix A-tailing nel tubo di PCR contenente prodotto end-riparazione e mescolare accuratamente. </li&gt; <li> Incubare la provetta PCR a 37 ° C per 30 minuti in un termociclatore pre-riscaldato (37 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adattatore legatura <ol><li> Aggiungere 2,5 microlitri Risospensione tampone, 2,5 microlitri legatura Mix, e 2,5 microlitri DNA adattatore Indice nella reazione A-tailing. </li><li> Incubare la reazione a 30 ° C per 30 minl in un termociclatore pre-riscaldato (30 ° C) con un coperchio preriscaldato a 100 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di arresto legatura tampone in ogni reazione e mescolare accuratamente. </li><li> Mescolare 42,5 ml ben mescolato sfere magnetiche per pulire la reazione seguente procedura 2.1.1.5 a 2.1.1.8. Aggiungere 50 microlitri Risospensione tampone per eluire il prodotto adattatore ligato. </li><li> Pulire il prodotto adattatore legatura per la seconda volta con 50 microlitri ben mescolato perline AMPure XP, ed eluire il prodotto in 25 microlitri Risospensione tampone in una provetta pulita PCR. </li></ol> 2.1.4) frammenti di DNA Amplify <ol><li> Aggiungere 5 microlitri PCR Primer Cocktail e 25 microlitri PCR Master Mix nella provetta PCR prodotto contenente adattatore-legatura e mescolare accuratamente. </li><li> Eseguire amplificazione in un termociclatore pre-programmato con le seguenti condizioni: 98 ° C per 30 sec; 10 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec; poi 72 ° C per 5 minuti e tenere a 10 ° C. </li><li> Pulire la reazione con 50 sfere magnetiche microlitri ben mescolato, ed eluire il prodotto finale in 30 microlitri Resuspension Buffer. </li></ol> 2.1.5) Biblioteca convalida <ol><li> Quantificare il prodotto finale con un fluorimetro utilizzando il protocollo del produttore. Concentrazione biblioteca finale è compresa tra 2,5 e 20 ng / ml. </li><li> Valutare la qualità del prodotto finale utilizzando uno strumento di analisi con DNA chip alta sensibilità secondo il protocollo del produttore. Aspettatevi una singola banda con il formato previsto per entrambi IGVHFR1, IGVHFR2 o IGVHFR3. Tidimensioni xpected del prodotto biblioteca è uguale alla dimensione del VDJ amplicone originale più le dimensioni degli adattatori (~ 125 bp). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Biblioteca Pooling e Sequencing <ol><li> Calcolare la molarità di ciascuna frazione libreria utilizzando la seguente formula: nM = [(ng / 1000) / * 660 bp] x 10 9 dove ng è la concentrazione della biblioteca VDJ-PCR misurata nel passaggio 2.1.5.1 e bp è il picco dimensione della libreria VDJ-PCR misurata al punto 2.1.5.2. </li><li> Diluire la libreria di 2 Nm (totale 10 ml) con acqua priva di DNasi. </li><li> Combinare i 10 ml di 2 librerie nM insieme diluito in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere un volume uguale di Phix controllo spike-in nel tubo 1,5 ml. </li><li> Caricare la piscina a una concentrazione 07:00 su una cella a flusso. </li><li> Sequenziare le librerie utilizzando un sequencer ciclo accoppiato-end 150 secondo il protocollo del produttore. </li></ol> Analisi 3. Dati Nota: Un summary degli script bioinformatica utilizzati in questa sezione si trova un file Codice supplementare. 3.1) Allineamento e QC <ol><li> Mappa accoppiato-end sequenziamento legge contro un IGH V umana, D e J regione del database scaricato dal sito IMGT 11 utilizzando un algoritmo esplosione nucleotide adattato in base al &#39;BLASTN&#39; disponibile da NCBI con divario penale aperto di 2, divario penale estensione di 1, lunghezza della parola di 7, e la soglia e-valore di 10 -4. Eliminare la coppia lettura non mappare sia l&#39;IGH V e una regione J. </li><li> Contare le restanti coppie di lettura che hanno IGH V e J mappature per ottenere le frequenze di corrispondenza combinazioni VJ in tutti leggere coppie ottenuti dal sequenziamento corsa sul campione. Count una lettura coppia se è mappato sia l&#39;IGH V e J gene, e quindi aggiungere il suo allele al conteggio corrispondente per la particolare combinazione VJ. </li><li> Classificare i conteggi per ogni regione VDJ ricombinato ottenuto dalla 3.1.2 dall&#39;altoest al più basso. La regione VDJ ha la più alta legge conteggio viene definito come combinazione riarrangiamento principale. </li><li> Scartare sequenze allineate che coprono meno del 35% del dominio principale riarrangiamento identificato nel 3.1.3. </li></ol> 3.2) SHM profilo di identificazione <ol><li> Contare tutti i modelli SHM attraverso la legge dal punto 3.1.3. Definire ogni modello SHM come sottoclone. </li><li> Contare il numero dei subcloni che sono corrispondenti a differenti modelli unici SHM, e il numero di letture che vengono mappati alle singole sottocloni. </li></ol> 3.3) Rappresentazione grafica dei risultati <ol><li> Eseguire l&#39;analisi filogenetica sulle subcloni utilizzando i loro corrispondenti modelli SHM utilizzando un quartiere metodo dal pacchetto R &quot;ape&quot; giunzione secondo il protocollo del produttore. Calcolare una matrice di distanza dai singoli schieramenti distinti per ricreare la filogenesi subclone radicato alla sequenza germinale del VJ combinazione in questione per ogni set di campioni appaiati. </li><li> Utilizzare la sequenza nucleotidica di ogni subclone come carattere vettoriale e calcolare la distanza approssimativa corda tra tutti i subcloni in maggiore riarrangiamento VJ sia per la diagnosi e campioni ricaduta corrispondenti utilizzando una misura di distanza Levenshtein dove matematicamente la distanza tra due allineamenti è dato da d x, y (i, j), dove d x, y (i, j) = 1 se i ≠ j e 0 altrimenti, e poi riassumere questa funzione per tutta la lunghezza della stringa corrispondente al nucleotide sequenze ie j. </li><li> Graficamente visualizzare la matrice risultante delle distanze e dei loro corrispondenti subclone conteggi subclone nei seguenti due modi: <ol><li> Utilizzare pacchetto R &quot;massa&quot;, secondo il protocollo del produttore di applicare scaling multidimensionale alla matrice distanza subclone e generare un principio bidimensionale coordinate della mappa, che viene poi tracciata con il logaritmodi conteggi subclonal come il raggio del cerchio. </li><li> Costruire un grafo non orientato in base alla distanza Levenshtein, dove i vertici corrispondono a ogni subclone distinta derivante dal maggiore riarrangiamento VJ. Nota: Se la distanza tra due cloni distinti è uguale a uno allora esiste un arco tra i due vertici. Se la distanza è maggiore di uno, allora vi è un fronte che li collega. </li><li> Tracciare il grafico del 3.3.3.2 usando la funzione tkplot nel pacchetto R &quot;IGRAPH&quot; con il layout Kamada Kawai secondo il protocollo del produttore. Il raggio dei vertici è proporzionale alla radice al cubo del numero totale di cloni mappati ad esso e l&#39;ombreggiatura utilizza un intervallo rosso e blu per indicare la proporzione di cloni che o appartengono alla diagnosi (blu) o recidiva (rosso) campioni . </li></ol></li></ol> 3.4) eterogeneità (Entropy) Misura <ol><li> Esaminare i numeri e conteggi sottoclone delmodelli individuali di mutazione somatica che si verificano nella principale riarrangiamento VJ per ogni set di campioni appaiati. </li><li> Calcolare l&#39;entropia empirica e l&#39;entropia empirica residuo corretto per il numero di cloni distinti in ciascun campione usando la stima entropia basato istogramma standard. </li></ol>

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to disclose.

A causa del numero quasi illimitato di iterazioni di informazioni sequenza codificata da VDJ riarrangiamento e SHM al locus IGH delle cellule B umane, l&#39;esame di tutto il repertorio IGH da high-throughput deep-sequenziamento ha dimostrato di essere un modo efficace e completo per delineare clonale e le popolazioni di cellule B sub-clonali. Inoltre, questa strategia può essere usato per studiare il percorso evoluzione clonale di sviluppo delle cellule B tumorali, remissione e ricaduta confrontando le architetture cl...

Il cancro è una malattia clonale. Da trenta anni fa, quando Peter C. Nowell ha proposto il cancro clonale evoluzione del modello 1, molti studi hanno cercato di sezionare popolazioni clonali in campioni di tumore e ricostruire espansione ed evoluzione modelli clonali che sono alla base del processo di tumorigenesi 2. Recentemente, tutto il sequenziamento del genoma ha permesso agli investigatori di dare uno sguardo profondo alla eterogeneità clonale e l&#39;evoluzione 3,4. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori trattabili in molti tipi cellulari, è difficile dedurre la precisa architettura clonale e percorso evolutivo. Fortunatamente c&#39;è un marcatore clonalità naturale in cellule B mature da cui molti tumori maligni linfoidi, tra cui DLBCL, sono originari. In risposta alla stimolazione antigenica, ogni B-cella può formare una singola produttivo sequenza IgH VDJ unendo un V H (variabile), un D (diversità), e un J H (giunzione) segmento insieme da una grande piscina di questi segmenti. Durante questo process, piccole porzioni di sequenza originale possono essere cancellati e ulteriori nucleotidi non-templated possono essere aggiunti per creare un riarrangiamento VDJ unico. Questa riorganizzazione VDJ specifico può essere ereditata in tutta la progenie di questo B-cellule, quindi la codifica B-cellula matura individuale e la sua prole 5. Inoltre, SHM verifica sulle sequenze VDJ ricombinati nella reazione successiva centro germinativo (GC) per introdurre mutazioni aggiuntive per l&#39;espansione del pool di anticorpi e la valorizzazione di anticorpi affinità 6. Pertanto, confrontando e contrastanti VDJ e SHM modelli di linfoma campioni che hanno subito questi processi, intra-tumorale eterogeneità potrebbe essere delineato e clonale percorso evolutivo della malattia può essere desunta. In precedenza, VDJ riassetto e SHM potrebbero essere identificati mediante PCR amplificando le regioni ricombinati, clonazione dei prodotti di PCR, e successivamente sequenziamento Sanger per ottenere informazioni sulla sequenza. Questo mi avvicinos basso throughput e bassa resa, il recupero di solo una piccola parte di tutto il repertorio VDJ ricombinato, e ostacolando la caratterizzazione della rappresentazione complessiva della popolazione clonale in un dato campione. Un approccio modificato è stato creato mediante la generazione di NGS indicizzati librerie sequenziamento dai prodotti VDJ PCR e l&#39;esecuzione di PE 2x150 bp sequenziamento di ottenere più di mezzo milione di sequenze VDJ ricombinate per campione. Inoltre, una pipeline personalizzata è stato sviluppato per eseguire il controllo di qualità (QC), allineare, filtro VDJ sequenziamento legge per identificare riarrangiamenti e SHMS di ogni lettura, ed eseguire analisi filogenetica sull&#39;architettura clonale di ogni campione. Inoltre, è stato stabilito un nuovo approccio per caratterizzare ulteriormente i modelli di evoluzione clonali per i campioni raccolti a vari stadi della malattia. Abbiamo applicato questa tecnica per i campioni dei pazienti DLBCL. DLBCL è una forma aggressiva di linfoma non-Hodgkin con frequenti recidive in un massimo di un thIRD dei pazienti 7. Ricadute DLBCL normalmente si verificano presto, entro 2 o 3 anni dalla diagnosi iniziale, anche se alcuni si verificano dopo 5 anni 8. La prognosi per i pazienti con recidiva è scarsa, con solo il 10% che raggiungeva 3 anni la sopravvivenza libera da progressione a causa di limitate opzioni di trattamento. Questa è la base per l&#39;urgente necessità di nuovi approcci per il trattamento di DLBCL ricaduta 9,10. Tuttavia, i meccanismi molecolari associati con DLBCL recidive sono ancora in gran parte sconosciute. In particolare, il ruolo di eterogeneità clonale al momento della diagnosi e l&#39;evoluzione clonale durante lo sviluppo ricaduta DLBCL sono attualmente indefinita, il che rende difficile la definizione di un biomarcatore accurate e utili per prevedere le ricadute. Per rispondere a queste domande, abbiamo applicato il nostro approccio VDJ-sequenza su più coppie di corrispondenti primario diagnosi-recidiva coppie di campioni DLBCL. Due distinti scenari evolutivi clonali di ricaduta emerse dal confronto delle architetture clonali tra la diagnosi e la samp ricadutales che suggerisce molteplici meccanismi molecolari può essere coinvolta in DLBCL ricaduta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89125-170</td>
			<td style="width:197px;">200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">TE buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12090-015</td>
			<td style="width:197px;">10 mM Tris&#183;Cl, pH 8.0; 10mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-XX0055-6</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">U1515</td>
			<td style="width:197px;">10 mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PCR Buffer&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11699105001</td>
			<td>Without MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td style="width:123px;">4311806</td>
			<td>50 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Specimen Control Size Ladder</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>2-096-0020</td>
			<td>33 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:359px;">IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td style="width:123px;">5-101-0030</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>1-101-0020</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">M8291</td>
			<td>20 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Corning (cellgro)</td>
			<td style="width:123px;">46-011-CM</td>
			<td style="width:197px;">6x1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50X TAE BUFFER&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101414-298</td>
			<td style="width:197px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:197px;">10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10597011</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15628-019</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td style="width:197px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610144</td>
			<td style="width:197px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:197px;">50 columns</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A63881</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">Q32854</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:123px;">5067-4626</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">MiSeq</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Magnetic stand</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4457858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:359px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>170-8370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vdj-seq: deep sequencing analysis of rearranged immunoglobulin heavy chain gene to reveal clonal evolution patterns of b cell lymphoma

La comprensione clonalità tumore è fondamentale per comprendere i meccanismi coinvolti nella tumorigenesi e la progressione della malattia. Inoltre, comprendere i cambiamenti composizione clonali che si verificano all&#39;interno di un tumore in risposta a determinati microambiente o trattamenti possono portare alla progettazione di approcci più sofisticati ed efficaci per eliminare le cellule tumorali. Tuttavia, tumori clonali inseguimento sottopopolazioni è stato difficile a causa della mancanza di marcatori distinguibili. Per risolvere questo problema, un protocollo VDJ-ss è stato creato per tracciare i modelli di evoluzione clonali di linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) recidiva sfruttando VDJ ricombinazione e mutazione somatica (SHM), due caratteristiche uniche di linfomi a cellule B. In questo protocollo, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) librerie con potenziale di indicizzazione sono stati costruiti da amplificato immunoglobuline riarrangiato catena pesante (IgH) regione VDJ da coppie di diagnosi primaria e la recidiva DLBCL samples. In media più di mezzo milione di sequenze VDJ per campione sono stati ottenuti dopo il sequenziamento, che contengono sia VDJ riassetto e informazioni SHM. Inoltre, le condutture bioinformatica personalizzati sono stati sviluppati per utilizzare pienamente le informazioni di sequenza per la caratterizzazione di IgH-VDJ repertorio all&#39;interno di questi campioni. Inoltre, il gasdotto permette la ricostruzione e confronto dell&#39;architettura clonale dei tumori individuali, che consente l&#39;esame della eterogeneità clonale nei tumori diagnosi e la deduzione di modelli di evoluzione clonali fra la diagnosi e le coppie di recidiva del tumore. Quando si applica questa analisi a diverse coppie di diagnosi-recidiva, abbiamo scoperto le prove chiave che più tumorali distintivo modelli evolutivi potrebbero portare a DLBCL ricaduta. Inoltre, questo approccio può essere esteso ad altri aspetti clinici, come l&#39;identificazione della malattia minima residua, monitorare i progressi recidiva e la risposta al trattamento, e ricerca di repertorio immunitarioes in contesti non linfoma.

La procedura complessiva di VDJ sequenziamento (VDJ-seq), compresa l&#39;estrazione del DNA, ricombinato VDJ regione amplificazione e purificazione, la costruzione della libreria sequenziamento, legge elaborazione e analisi filogenetica, è rappresentato in figura 1. Ordinariamente 5-200 mg DNA può essere recuperato da sezioni di tessuto solido congelato o 0,5-20 mg DNA da sezioni di tessuto incluso in paraffina fissati in formalina. A seconda della qualità, modello riarrangiamento e SHM grado di sing...

Watch this Scientific Journal Video about VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma at JoVE.com

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

26.5K Views.  Weill Cornell Medical College. This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes. 

Video: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Dissezione di Human Elements corpo vitreo per l&#39;analisi proteomica

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Ricerca

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Produzione e di rilevamento di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) in Cancro

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Deep Neuromuscular Blockade Leads to a Larger Intraabdominal Volume During Laparoscopy

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that lowering the insufflation pressure during surgery may reduce the risk of post-operative pain. In this pilot study, a method is presented for measuring the intra-abdominal space available to the surgeon during laproscopy, in order to examine whether the relaxation produced by deep neuromuscular blockade can increase the working surgical space sufficiently to permit a reduction in the CO2 insufflation pressure. Using the laproscopic grasper, the distance from the promontory to the skin is measured at two different insufflation pressures: 8 mm Hg and 12 mm Hg. After the initial measurements, a neuromuscular blocking agent (rocuronium) is administered to the patient and the intra-abdominal volume is measured again. Pilot data collected from 15 patients shows that the intra-abdominal space at 8 mm Hg with blockade is comparable to the intra-abdominal space measured at 12 mm Hg without blockade. The impact of neuromuscular blockade was not correlated with patient height, weight, BMI, and age. Thus, using neuromuscular blockade to maintain a steady volume while reducing insufflation pressure may produce improved patient outcomes.

This article presents a method for measuring the working abdominal volume during laproscopic myomectomy using the surgical grasper, and applies this technique to obtain pilot data on whether deep neuromuscular blockade (NMB) can enable the use of lower insufflation pressure. Reduced insufflation pressure during laproscopic surgery has been shown to reduce post-operative pain, and thus the use of NMB during surgery may enable improved patient outcomes.

Blocco neuromuscolare profondo porta ad un maggiore volume intra-addominale durante la laparoscopia

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

Rilevamento di distorsione architettonica in mammografia precedenti<em&gt; Via</em&gt; Analisi dei modelli Oriented

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Imparziale sequenziamento profondo di RNA virus da campioni clinici

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

Applicazione della tecnologia microfluidica Biochip per rilevare siero allergene-specifiche dell'immunoglobulina E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...