Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grants Scholar di ricerca (RSG-116403-09-082-01-MGO) dalla American Cancer Society e fondi intramurali della Wake Forest University Health Sciences a GS. DBS è stato sostenuto da NCI formazione concessione 5T32CA079448.

1. Generazione di costrutti shRNA <ol><li> Identificare un siRNA sequenza-target (20-23 nucleotidi) sulla base di criteri precedentemente pubblicati 6 o utilizzare un web server basato su algoritmo, ad esempio &quot;Finder siRNA Target&quot; da Ambion e GenScript. </li><li> Sintetizzare oligonucleotidi basato sul disegno della Figura 1 e sequenze esempio in Tabella 1. Effettuare amplificazione PCR utilizzando oligonucleotidi P1 e P2 (30 cicli di denaturazione a 94 ° C per 30 sec, ricottura a 60 ° C per 30 sec, e allungamento a 72 ° C per 30 sec) e un plasmide trasportante il U6 o H1 promotore come modello. Purificare il prodotto di PCR utilizzando una colonna di purificazione PCR. Digerire con BamHI e HindIII e purificare il DNA digerito con una colonna di purificazione PCR. Ricuocere il oligonucleotidi P3 e P4 (2,5 pmol / pl di ciascun in 100 pl di 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) mediante bollitura per 5 minuti e lentamente raffreddare a temperatura ambiente. Digerire un lentivirale vector, come quello descritto nella figura 2A, con BamHI e EcoRI, ed eseguire gel-purificazione. </li><li> Effettuare un 3-ligazione con il frammento BamHI / EcoRI digerito-vettore, un BamHI / HindIII-digerito frammento PCR e una coppia di oligonucleotidi ricotto (formando HindIII e siti EcoRI alle due estremità) ad un rapporto molare 1:10:10 (Figura 1). </li><li> Trasforma altamente efficiente competente E. coli DH5a utilizzando il prodotto ligato. Schermare le colonie utilizzando gli oligonucleotidi P5 (nel vettore) e P6 (nel promotore H1 o U6). 7 </li><li> Preparare DNA plasmidico dalle colonie positive con un kit commerciale e confermare la presenza dell&#39;inserto da BamHI / EcoRI digestione e DNA elettroforesi su agarosio. Sequenza la regione contenente il promotore e shRNA utilizzando oligonucleotide P5. </li><li> Utilizzare plasmide DNA Midi o Maxi-kit di preparazione (privo di endotossine è preferito) per preparare il DNA lentivirus portando l&#39;espressione shRNAcassetta. Determinare la concentrazione di DNA misurando l&#39;assorbimento a 260 nm. Controllare la purezza del DNA utilizzando il rapporto di 260 nm/280 nm e assicurarsi che rientra nella gamma compresa tra 1,8 e 2.0. Controllare l&#39;integrità lentivirus plasmide mediante elettroforesi su gel di agarosio. DNA per la trasfezione dovrebbe essere super-spirale. </li></ol> 2. Lentivirus Transfection Precauzioni: vettori lentivirali sono derivati ​​dal virus dell&#39;immunodeficienza umana-1 (HIV-1) e la replicazione del genoma incompetente. Essi sono stati ampiamente utilizzati in gene delivery a causa della capacità di infettare sia divisione e non-divisione delle cellule. Tuttavia, due gravi rischi esistono negli studi che utilizzano lentivirus. (1) Il potenziale per la generazione di replicazione-competenti lentivirus. Questo rischio può essere notevolmente ridotto se il sistema di terza generazione lentivirale viene utilizzato. (2) Il potenziale di oncogenesi. Questo rischio può essere aggravato se gli inserti trasportate sono oncogeno o reprimere soppressori tumorali.Le attività di ricerca coinvolte nel lentivirus HIV-based dovrebbero seguire le &quot;Considerazioni sulla biosicurezza per la ricerca con vettori lentivirali&quot; del NIH ( <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) e richiedono l&#39;approvazione da parte del Comitato Biosicurezza di istituzione di un ricercatore. Generalmente, maggiore livello di biosicurezza-2 (BSL-2) di contenimento è richiesto per l&#39;impostazione laboratorio se si utilizzano vettori lentivirali. <ol><li> Tavola 4 × 10 6 cellule HEK 293T con DMEM completo (DMEM fornito con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina) in 10 cm e piatti di coltura durante la notte a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Sostituire il mezzo con 5 ml di pre-riscaldato Opti-MEM ho ridotto siero Media (Invitrogen). </li><li> Preparare la soluzione A: 10 microgrammi di shRNA contenenti vettori lentivirali, 5 mg ciascuna delle gene terzozione lentivirus plasmidi imballaggio (preparato con elevata purezza, i tre plasmidi di imballaggio comprendono VSV-G: per una proteina di involucro, PRSV-Rev: per rev, e pMDLg / pRRE: per gag / pol, che sono essenziali per l&#39;imballaggio lentivirus), 36 pl di 2M CaCl 2, e 300 pl di acqua sterile. </li><li> Preparare la soluzione B: 300 microlitri di 2 × Hepes Buffered Saline (281 mM NaCl, 100 mM di HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH regolato a 7,12 per 0,5 N NaOH e sterilizzato di 0,22 um filtro). </li><li> Lentamente goccia di soluzione A alla soluzione B, mentre bolle d&#39;aria attraverso Soluzione B con una pipetta. Lasciare il tubo a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lentamente cadere le soluzioni miste A / B nel piatto di coltura cellulare HEK 293T preparato nella fase 2,1 e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per 4-6 h. </li><li> Sostituire il terreno con 7 ml di terreno DMEM completo. Dopo 24 ore, aggiungere un ulteriore 5 ml di terreno DMEM completo. Raccogliere il cont mediaaining il lentivirus, dopo altre 24 h della cultura. </li><li> Gira il supporto a 1.500 giri, temperatura ambiente per 10 min. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 um e ruotare il flusso attraverso il mezzo contenente lentivirus mediante ultracentrifugazione a 25.000 rpm (pari a 125.000 xg con un rotore SW28 secchio oscillante, ultracentrifuga Beckman XL-90), 4 ° C per 90 min. Decantare il surnatante in un contenitore con il 5% di candeggina (concentrazione finale). </li><li> Risospendere il pellet lentivirus in 0,5-1,0 ml di PBS freddo e fare aliquote lentivirus in 50-100 ul per provetta. Conservare a -80 ° C. </li><li> Il titolo del lentivirus può essere determinata kit commerciale (come kit di quantificazione Lentivirus QuickTiter da Biolabs cellulari, Inc.), da una PCR in tempo reale protocollo 8, oppure determinando la co-espresso marcatore fluorescente mediante microscopia a fluorescenza o citometria di flusso . In genere, uno di 10 cm piatto di coltura in grado di produrre circa 0,5-1,0 × 10 8 infezioniunità infettive (UI). </li></ol> 3. Infezione e caratterizzazione di cellule infette <ol><li> Seme le cellule infettate da in 2 ml di mezzo completo in una piastra da 6 pozzetti con 30-40% di confluenza (circa 5-8 x 10 5 cellule, a seconda delle dimensioni delle celle). Coltivare le cellule notte a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Sostituire il mezzo con 1 ml di mezzo fresco contenente 8 ug / ml di polibrene (Sigma, Cat # H9268) o 5 pg / ml di protamina (Sigma, Cat. # P4020). </li><li> Determinare una molteplicità adeguato di infezione (MOI) intervallo 9 per una linea cellulare particolare utilizzando lentivirus con marcatore fluorescente. Calcolare empiricamente o determinare la quantità di lentivirus da utilizzare per infettare la linea cellulare. Lentamente cadere il lentivirus nella piastra e scuoterla delicatamente per 10 sec. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per 6 ore e quindi sostituire il mezzo normale con mezzo completo. </li><li> Almeno due days dopo l&#39;infezione, controllare le cellule usando la microscopia a fluorescenza per i lentivirus che esprimono marcatori fluorescenti e / o aggiungere l&#39;antibiotico corrispondente al mezzo di vettori lentivirali che esprimono geni resistenti agli antibiotici. Per un vettore inducibile, ad esempio un sistema Tet-On (figura 2), coltura le cellule a terreno preparato con tetraciclina privo FBS. Dividere le celle 2-3 giorni dopo l&#39;infezione. Prendere una porzione delle cellule per testare knockdown gene inducibile da coltura in terreno con e senza 1,5 pg / ml doxiciclina (Dox) per ≥ 2 giorni. </li><li> Controllare l&#39;atterramento gene mediante Western blot, Real-Time PCR o immunostaining ≥ 2 giorni dopo l&#39;infezione, 2 giorni dopo la selezione antibiotica, o (per un Tet-On sistema inducibile) ≥ 2 giorni dopo l&#39;aggiunta Dox. </li><li> Utilizzare approcci diversi, come saggi di proliferazione cellulare, morbide studi di coltura di agar, saggi di migrazione, saggi di invasione e studi formazione del tumore) per determinare gli effetti della kn gene bersaglioockdown sulla malignità delle cellule. </li></ol> 4. Xenotrapianto mouse Studio Modello <ol><li> Pulire tutte le superfici del mouse per anestesia e iniezione di etanolo al 70% per prevenire l&#39;infezione di topi. Anestetizzare topi nudi atimici (NCI-Frederick) usando 2% isoflurano miscelato con ossigeno in anestesia induzione camera 10 min prima della inoculazione delle cellule. Mantenere l&#39;anestesia utilizzando 1% isoflurano misto con l&#39;ossigeno attraverso un cono di naso. Eseguire questo passo in una stanza con un&#39;eccellente ventilazione e montare filtri scavenger isofluorano alla camera di induzione. </li><li> Propagare le cellule che trasportano shRNAs. Utilizzare tetraciclina terreno privo di Tet-On vettori inducibili. Tripsinizzare le cellule e risospendere in mezzo completo contenente 50% Matrigel. Posizionare i topi nudi su un cuscinetto riscaldante (30 ° C) e iniettare 200 pl delle cellule (1-10 × 10 6, a seconda della malignità delle cellule) in topi con 1-2 siti di iniezione per topo. Utilizzare siringhe con 25.5-calibro aghi per iniezioni sottocutanee, e aghi di calibro 28-30 per iniezioni ortotopici. </li><li> Per costitutivi vettori shRNA, utilizzano 2 gruppi di topi iniettati con le cellule che esprimono il gene bersaglio shRNA e strapazzate shRNA. Per Tet-On vettori shRNA inducibili, utilizzano 4 gruppi di topi iniettati con cellule che portano il gene bersaglio shRNA e criptato shRNA, alimentato con acqua normale e Dox (1,5 mg / ml) contenente acqua (2 × 2 shRNAs trattamenti = 4 gruppi) . Sostituire il Dox acqua contenente due volte la settimana. </li><li> Monitorare la lunghezza e larghezza dei tumori settimanali o bisettimanali da un nonio calibro digitale e calcolare i volumi del tumore (V) con la formula V = 1/2 (lunghezza x larghezza 2) 10. Assicurarsi che il volume del tumore non superi gli orientamenti del ACUC istituzionale (ad esempio, il 10% del peso corporeo). Euthanize qualsiasi mouse utilizzando un protocollo approvato dalla ACUC istituzionale se mostra segni di ulcerazione o necrosi estesa, infectio evidenten, sanguinamento incontrollato o allo stadio terminale malattia. </li><li> La crescita tumorale e metastasi possono essere monitorati per le cellule tumorali che esprimono un inoculate bioluminescente marcatore 11, quale luciferasi di lucciola. Pulire tutte le superfici per anestesia del mouse e di imaging del 70% di etanolo per prevenire l&#39;infezione di topi. Anestetizzare i topi come descritto al punto 4.1. Iniettare luciferina (150 mg / kg) per via intraperitoneale. Mettere i topi in una camera di imaging disinfettata di un sistema di imaging commerciale, come un sistema IVIS Imaging (Caliper Life Sciences, Inc.). Attivare la leva per mantenere l&#39;anestesia anestesia dell&#39;1% isoflurano mescolato con ossigeno. Condurre questa fase in una stanza con un&#39;eccellente ventilazione. </li><li> Prendere la prima immagine esponendo 5 min e controllare l&#39;intensità del segnale. Regolare il tempo di esposizione per ottenere immagini con segnale ottimale rispetto al fondo. Determinare il tempo di imaging empiricamente, che è generalmente 1-5 min per tumori sottocutanei. </li><li> Euthanize i topi da un protocollo approvatodal ACUC istituzionale quando le dimensioni del tumore raggiunge circa 1.000 mm 3, o come specificato dalle linee guida ACUC. Excise tumori lo xenotrapianto, li pesano e scattare foto. Trattare i campioni tumorali di diversi studi, come ad esempio le analisi patologiche per determinare la morfologia delle cellule tumorali, e Western blot e Real-Time PCR per testare studi di espressione genica. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Questo protocollo è stato utilizzato per studiare gli effetti della YY1 knockdown sul trapianto di formazione del tumore della Firefly luciferasi che esprimono MDA-MB-231 cellule (cellule di adenocarcinoma della mammella; Caliper Life Sciences) in topi nudi atimici. La sequenza bersaglio di shRNA YY1 umana è &quot;GGG AGA AGC AGC AGG TGC AGA T&quot;. Una sequenza criptato &quot;GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T&quot; è stato creato anche per un controllo (cont) shRNA, che non hanno una somiglianza notevole a qualsiasi trascrizione conosciuto. Gli oligonucleotidi utilizzati per rendere Tet-On costrutti shRNA inducibili, con YY1 come esempio, Sono mostrati nella Tabella 1. Come risultato, due vettori lentivirali, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA e PLU-Puro-Indu-cont shRNA, sono stati costruiti e sono stati utilizzati per la produzione di lentivirus. Abbiamo usato per infettare tali lentivirus singolarmente due MDA-MB-231 cloni cellulari (cloni 1 e 3) che esprimono sia regolatore tetraciclina (tetR) e luciferasi di lucciola. Popolazioni cellulari policlonali sono stati ottenuti dopo la selezione puromicina. Figura 3A mostra Dox indotta YY1 smontabile in questi MDA-MB-231 cellule infettate da plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus. Abbiamo poi utilizzato le cellule policlonali del clone 3 infettati singolarmente da questi inducibile shRNA YY1 e cont lentivirus shRNA e ha osservato che YY1 esaurimento ridotta invasività della MDA-MB-231 cellule (Figura 3B). Analisi Western Blot ha confermato Dox indotta YY1 silenziamento in MDA-MB-231 cellule con l&#39;indu-YY1 shRNA, mentre le celle che contengono indu-cont shRNA non hanno mostrato questo effetto (Figura 3C). Abbiamo poi usato<html> queste cellule per lo studio xenotrapianto modello murino. Rispetto ai gruppi di controllo, i topi impiantati dalle MDA-MB-231 cellule con indu-YY1 shRNA e fornito con Dox acqua contenente mostrato una ridotta formazione di tumori, quando visualizzato mediante bioluminescenza (Figura 4A) e determinata da pesi tumorali (Figura 4B ). YY1 silenziamento in questi tumori xenotrapianto è stato confermato da studi Western blot mostrato nella figura 4C. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> Figura 1. Schema per la generazione di un costrutto shRNA e trascrizione shRNA. Il primer P1 a P6 sono mostrati (vedere Tabella 1 per sequenze esempio). Pol III: RNA polimerasi III (d):. End digerito. Disegno non è in scala. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Diagrammi di (A) un vettore lentivirale e (B) il meccanismo del Tet-On promotore inducibile H1 utilizzato per il silenziamento genico. Il vettore lentivirale stato ricostruito sulla base pLL3.7 14. H1-Pr: promotore H1; UBC-Pr: Human promotore di ubiquitina C; Puro: puromicina; TRE: elemento che risponde alle tetracicline; Dox: doxiciclina. TetR: regolatore di tetraciclina. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR e WRE sono componenti essenziali di un 14 vettori lentivirali. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> Figura 3. Dox-indotta YY1 silenzio e il suo effetto sulla invasività della MDA-MB-231 cellule. A. YY1 livelli in due popolazioni cellulari policlonali derivate da TetR-esprimere cloni 1 e 3 infettati da plu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus e coltivate in assenza e presenza di Dox. B. Boyden test camera di MDA-MB-231 celle con shRNAs inducibili. (* P &lt;00,05 rispetto agli altri tre gruppi). C. rappresentativi Western blot di YY1 espressione in queste quattro popolazioni di cellule. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> Figura 4. Effetti del silenziamento indotto YY1 sulla formazione di tumori trapiantati da MDA-MB-231 cellule. A. Schema di impianto cella (a sinistra) e rappresentativi bioluminescenti immagini catturate dal sistema di imaging IVIS a 4 settimane (a destra) inoculazione delle cellule post. B. pesi tumorali xenotrapianto a 4 settimane. * P ≤ 0,05. C. occidentali blot di YY1 e β-actina di espressione in eterotrapianti di MDA-MB-231 cellule con indu-YY1 shRNA in assenza e presenza di DOX. Le etichette sulla parte superiore sono i nomi dei singoli topi. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequence (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> Utilizzo e la posizione </td></tr><tr><td> P1 (Tet-On H1) </td><td> cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C </td><td> PCR; alla estremità 5 &#39;del promotore H1 </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG </td><td> PCR; alla estremità 5 &#39;del promotore U6 </td></tr><tr><td> P2 (per YY1 con Tet-On H1) </td><td> CAGC AAGCTT GAA atc TGC acc TGC ttc TGC tcc c GGG ATC ATC TCT ACT GAT AGG GAA C </td><td> PCR; alla estremità 3 &#39;del promotore Tet-On inducibile H1 </td></tr><tr><td> P2 (per YY1 con U6) </td><td> CAGC AAGCTT GAA atc TGC acc TGC ttc TGC tcc c aaa caa GGC ttt TCT cca agg gat uno </td><td> PCR; alla estremità 3 &#39;del promotore U6 </td></tr><tr><td> P3 (per YY1) </td><td> agc tt ATC TGC acc TGC ttc TGC tcc c ttttt g </td><td> Per essere ricotto con P4 </td></tr><tr><td> P4 (per YY1) </td><td> aattc AAAAA <strong&gt; ggg agc aga agc agg TGC aga ta </td><td> Per essere temperati con P3 </td></tr><tr><td> P5 (per pLL3.7) </td><td> ggg tac AGT gca ggg gaa aga ata g </td><td> Per lo screening PCR, utilizzato con P6 </td></tr><tr><td> P6 (per Tet-On H1) </td><td> GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG AC </td><td> Per lo screening PCR, utilizzato con P5 </td></tr><tr><td> P6 (per U6) </td><td> AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG </td><td> Per lo screening PCR, utilizzato con P5 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Oligonucleotidi sintetizzati utilizzati per generare costrutti shRNA. P1 e P6 sequenze per la U6 mouse e Tet-On promotori inducibili H1 umani sono forniti. Umana YY1 viene utilizzato come un esempio con una sequenza bersaglio di shRNA GGG AGC AGC AGG AGA AGA TGC T. Le sequenze specifiche di YY1 sono evidenziati. Due sequenze P2 di YY1 sono progettati per i due promotori, rispettivamente. Il costitutiva U6 / YY1 shRNA è stato descritto precedentemente erano 15, mentre il Tet-On H1/YY1 è stato utilizzato in questo protocollo. P5 è vettoriale specifica e la sequenza di pLL3.7 14 è mostrato. Le sequenze di enzimi di restrizione sono sottolineati, mentre le sequenze per temprare i promotori durante l&#39;amplificazione PCR sono in corsivo.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo protocollo descrive un metodo per abbattere un gene utilizzando shRNA e visualizzare il suo effetto biologico utilizzando l&#39;imaging bioluminescente di crescita di cellule tumorali in vivo. Il sito bersaglio di un shRNA non dovrebbe contenere uno qualsiasi dei tre siti di restrizione (BamHI, EcoRI e HindIII) utilizzati per subcloning. In uno scenario raro quando uno di questi siti è presente, un enzima di restrizione aggiuntivo può essere utilizzato per sostituirlo nel generare il costrutto. <p ...

Oltre alle attrezzature di laboratorio comunemente utilizzato per le analisi di RNA e proteine ​​e la cultura delle cellule, i seguenti materiali e reagenti sono necessari per questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td></tr><tr><td> Biosicurezza adatto per livello di biosicurezza 2 contenimento Cabinet </td></tr><tr><td> PCR termociclatore </td></tr><tr><td> Ultracentrifuga </td></tr><tr><td> Anestesia-induzione da camera con spazzini isofluorano </td></tr><tr><td> Digital Vernier pinza </td></tr><tr><td> IVIS sistema di imaging </td></tr><tr><td> Altamente competenti DH5a E. coli </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, e gli enzimi di restrizione HindIII </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td></tr><tr><td> Di terza generazione lentivirus plasmidi imballaggio VSV-G, PRSV-Rev e pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Elenco dei materiali

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA interference (RNAi) inibisce l&#39;espressione genica attraverso mRNA bersaglio specifico degradanti. Dalla scoperta del double-stranded RNA interference piccola (siRNA) in silenziamento genico 1, RNAi è diventato un potente strumento di ricerca in studi di funzione del gene. Rispetto a delezione genetica, RNAi-mediata silenziamento genico possiede numerosi vantaggi, come la facilità con cui viene effettuata e la sua idoneità per più linee cellulari. Molteplici studi hanno dimostrato le applicazioni della tecnologia RNAi nella ricerca sul cancro. In particolare, lo sviluppo della tecnologia del DNA vettoriale basato su di produrre piccole forcina RNA (shRNA) guidato dal promotore U6 o H1 ha reso lungo termine e gene inducibile silenziamento possibile 2,3. Il suo impiego in combinazione con geneticamente vettori virali, quali lentivirus, facilita elevato rendimento di consegna shRNA e / o integrazione nel DNA genomico per espressione stabile shRNA. Descriviamo un detaileprocedura d con il vettore basato su tecnologia del DNA RNAi per determinare la funzione del gene, compresa la costruzione di vettori lentivirali esprimenti shRNA, la produzione di lentivirus e l&#39;infezione delle cellule, e studi funzionali utilizzando un modello di xenotrapianto mouse. Varie strategie sono stati riportati nella generazione di costrutti shRNA. Il protocollo qui descritto impiegando amplificazione PCR e un 3-frammento legatura può essere utilizzato per generare direttamente ed efficacemente shRNA contenenti costrutti lentivirali senza lasciare alcuna ulteriore adiacente ad una sequenza nucleotidica codificante shRNA. Poiché le shRNA-cassette di espressione creato da questa strategia può essere tagliato con enzimi di restrizione, possono essere facilmente spostato con altri vettori diversi marcatori fluorescenti o antibiotici. Reagenti di trasfezione più commerciali possono essere utilizzati nella produzione lentivirus. Tuttavia, in questa relazione, mettiamo a disposizione un metodo economico utilizzando fosfato di precipitazione di calcio che può raggiungere oltre il 90% di efficienza di transfezione inCellule 293T. Rispetto ai vettori di espressione shRNA costitutivi, un sistema inducibile shRNA è particolarmente adatto ad abbattere un gene essenziale per la proliferazione cellulare. Dimostriamo il silenziamento del gene Yin Yang 1 (YY1), un oncogene potenziale nel cancro della mammella 4,5, da un Tet-On sistema inducibile shRNA ei suoi effetti sulla formazione di tumori. La ricerca che utilizza lentivirus richiede l&#39;esame e l&#39;approvazione di un protocollo sulla biosicurezza dal Comitato di Biosicurezza di istituzione di un ricercatore. La ricerca che utilizza modelli animali richiede l&#39;esame e l&#39;approvazione di un protocollo animale dalla cura degli animali e Comitato uso (ACUC) dell&#39;istituzione di un ricercatore.

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DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L&#39;invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento genico<em&gt; In vivo</em&gt;.

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Views.  Wake Forest University School of Medicine. RNA interference (RNAi) possiede molti vantaggi rispetto knockout del gene ed è stato ampiamente utilizzato come strumento in studi di geni funzionali. L'invenzione di DNA vettoriale basata RNAi tecnologia ha fatto lungo termine e smontabile gene inducibile possibile, e anche aumentata la possibilità di silenziamento genico In vivo.

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In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

In Vivo saggio canina funzione muscolare

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
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Ricerca

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Utilizzando Saccadometry con stimolazione cerebrale profonda per studiare normali e patologiche funzione cerebrale

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...