DMK è stata sostenuta da una sovvenzione IRACDA da NIGMS (K12GM093857) alla Virginia Commonwealth University. Questo lavoro è stato sostenuto da NIDDKD concessione DK34153 a John R. Grider.

Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali della Virginia Commonwealth University (IACUC) ha approvato tutti gli animali e le procedure di eutanasia utilizzati in questo protocollo. 1. Preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare 4 L di tampone Krebs (composto [in mm]: 118 NaCl, KCl 4.75, 1.19 KH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, 2.54 CaCl 2, 25 NaHCO3, 11 glucosio). Pesare le quantità appropriata di ogni sostanza chimica solida, mettere nel volume adeguato di acqua deionizzata e miscelare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Poi, aerare la soluzione con carboxygen (95% O 2, 5% CO 2) per 30 minuti durante il riscaldamento a 37 ° C. </li><li> Determinare il pH della soluzione, mentre a 37 ° C (la stessa temperatura come nel bagno organo) e regolare a pH 7,4 con HCl, se necessario. Mantenere il tampone Krebs continuamente carboxygenated ea 37 ° C per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Metterei tubi di afflusso e deflusso delle pompe peristaltiche nel serbatoio tampone e accendere le pompe peristaltiche per iniziare perfusione del buffer di tutto il sistema vasca tubi e organo. NOTA: Buffer può inizialmente essere pompata nel contenitore originale fino l&#39;aggiunta di due tessuti nei bagni d&#39;organo o di sostanze chimiche nel buffer di perfusione. Questo riduce la quantità totale di tampone richiesto per la sperimentazione. Poi le linee di perfusione tampone in uscita deve essere collocato in un contenitore vuoto in modo che i buffer uscita che in entrata non si mescolano. </li><li> Calibrare la temperatura del sistema di riscaldamento sul circolatore bagno in modo che il buffer nei bagni organo diventa e rimane 37,0 ± 0,5 ° C per tutta la durata dell&#39;esperimento. Conferma e modificare, se necessario, il pH del tampone Krebs almeno una volta prima immissione segmenti del tessuto nel bagno nel passo 2.8. </li></ol> 2. Preparazione di tessuti <ol><li> Eutanasiauna cavia utilizzando anidride carbonica inalazione / asfissia in una camera sigillata o un altro metodo di eutanasia approvato dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato locale. </li><li> Dopo aver confermato l&#39;eutanasia degli animali, tagliare aprire la parete addominale longitudinalmente con le forbici dissezione e individuare gli intestini. Tagliare il mesentere attaccato al piccolo intestino per aiutare a smascherare cieco. NOTA: Per verificare l&#39;eutanasia eseguire una procedura secondaria, come la toracotomia bilaterale come approvato da un comitato cura degli animali e l&#39;uso. </li><li> Individuare l&#39;estremità distale del cieco e il colon prossimale transetto appena distale al suo collegamento al cieco. Poi transetto il colon prossimale di nuovo ~ 8 cm distalmente alla prima resezione. </li><li> Collocare il tessuto del colon in soluzione Krebs riscaldato e carboxygenated (descritto nella sezione 1) per ulteriori dissezione. Pin i due punti nel bagno dissezione e utilizzare un insieme ridotto di forbici per rimuovere la maggior quantità mesenterio e grasso possibile. </li><li> Nella hvassoio dissezione eated, rimuovere tutti i contenuti endoluminale delicatamente perfusione di tampone Krebs attraverso il lume con una siringa accoppiato ad un catetere estremità smussata (per aiutare a prevenire la perforazione del tessuto). Evitare sovradistensione del segmento durante questo processo perfusione. </li><li> Ottenere due cateteri tubo di vetro ribruciate (diametro 3 mm) e posizionare un breve pezzo di tubo di polietilene (~ diametro 3 mm di lunghezza e ~ 3 mm) attorno alla porzione del tubo di vetro di entrare nel lume del tessuto. NOTA: Questo permetterà la sutura da collocare intorno al tubo di tessuto di vetro e di rimanere sicuro e non scivolare la preparazione viene posto nel bagno organo e durante variazioni di lunghezza del tessuto. </li><li> Inserire un catetere nel fine orale della preparazione dei tessuti e legare una sutura intorno al piccolo pezzo di tubo che circonda il catetere con il nodo di un chirurgo. Cercate delicatamente di catetere di nuovo fuori per assicurarsi il nodo è comodo. Quindi, eseguire la stessa azione dall&#39;altro t catetere entrareegli aboral fine del tessuto. </li><li> Una volta che i cateteri sono fissati, spostare l&#39;intera preparazione (tessuto più cateteri) dal vassoio dissezione in uno dei bagni d&#39;organo. Posizionare la preparazione nel bagno con l&#39;estremità orale rivolto verso l&#39;utente. </li><li> Successivo montare / fissare i cateteri tubo di vetro al bagno organo di uno dei due metodi suggeriti. NOTA: fissare il vetro tubi impediscono il segmento tessuto di modificare la lunghezza durante l&#39;esperimento o venendo sopra il livello del tampone Krebs nel bagno. <ol><li> Opzione A: Fissare la parte superiore del tubo di vetro alla parte superiore del lato della vasca organo plastica attraverso l&#39;uso di argilla di modellatore o una clip di plastica. </li><li> Opzione B: Fissare i tubi di vetro per i pali di metallo che tengono le telecamere sopra la preparazione bagno organo mediante l&#39;uso di clip di plastica. </li></ol></li><li> Una volta che i cateteri sono fissate alla vasca, collegare a 5 cm pezzo di tubo all&#39;estremità aperta di ciascun catetere. Per il gatto oraleheter, collegare questi tubi ad una siringa da 10 ml, che sarà utilizzato per iniettare tampone nel lume del colon prossimale segmento. Per il catetere aboral, questo pezzo di tubo consentirà il deflusso luminale di essere diretto in un contenitore di raccolta (50 ml becher, serbatoio, etc.). </li><li> Usando la siringa attaccata all&#39;estremità orale, lentamente a filo riscaldato tampone Krebs attraverso il lume del tessuto per garantire che il liquido può fluire attraverso il tessuto. Il flusso viene confermato uscendo liquido catetere aboral. Calibrare il sistema di video-registrazione (sezione protocollo 3), mentre il tessuto equilibra per 30 min. </li></ol> 3. La calibrazione del sistema di video-recording <ol><li> Calibrare il posizionamento altezza della telecamera, le impostazioni video per la luminosità e il contrasto, e la distanza orizzontale utilizzando il software. NOTA: Le impostazioni migliori per configurazioni perfusione intraluminali sono diverse rispetto alle impostazioni utilizzate per determinare la velocità di pellet di propulsione 13. </li><li> Click sulla scheda esperimento per la fotocamera da calibrare. Poi nel menu &#39;File&#39; click &#39;Calibra&#39;. </li><li> Una volta che il video viene visualizzato nella finestra &#39;calibrare workstation&#39;, impostare la fotocamera a un&#39;altezza dove l&#39;immagine comprende le estremità dei cateteri inseriti nel lume del colon. </li><li> Poi, calibrare la distanza orizzontale visualizzato nell&#39;immagine utilizzando l&#39;adesivo righello traslucido allegato ad ogni vasca. NOTA: Questa calibrazione è fondamentale per i calcoli del software successive di diametro luminale e velocità delle onde contrattili. </li><li> Nella stessa finestra &#39;workstation calibrare&#39;, impostare le linee guida verticali rosse in modo che essi sono di 10 mm l&#39;uno dall&#39;altro secondo il righello nell&#39;immagine della telecamera. Poi, digitare la distanza adeguata (10 mm) nella finestra &#39;cursori a distanza »e fare clic sul pulsante&#39; CAL &#39;. </li><li> Avanti, regolare il guadagno, la luminosità, e otturatore cursori all&#39;interno della finestra &#39;calibrare workstation&#39; per modificare l&#39;immagine della telecamera in modo cheil segmento di tessuto appare come una sagoma scura su uno sfondo chiaro. NOTA: La figura 4 mostra esempi di questa procedura di calibrazione buoni e cattivi. </li><li> Per regolare correttamente l&#39;immagine, regolare anche il focus e apertura manopole la fotocamera stessa. </li><li> La calibrazione è ora completa. Fare clic su &#39;Salva&#39;, quindi su &#39;OK&#39; nel pop-up, e infine fare clic sul pulsante &#39;EXIT&#39;. </li></ol> 4. Procedure Generale Sperimentali <ol><li> Dopo le procedure di calibrazione della fotocamera e 30 minuti per il raggiungimento dell&#39;equilibrio del tessuto sono completi, il nome delle prove in ciascun protocollo sperimentale. Nomi di prova possono essere basati sul nome e la concentrazione del composto e il volume di liquido che viene endoluminale perfusi nel segmento di tessuto durante quella parte dell&#39;esperimento. </li><li> Poi, occludere il tubo che sporge dal catetere aboral attraverso l&#39;uso di un morsetto del tubo. NOTA: Questo impedisce luminale liquido di uscire alla fine aboral durante Fusperimentazione rther, permettendo l&#39;uso di specifici volumi nel lume di provocare vari livelli di distensione (Figura 1). </li><li> Iniettare circa 0,7 ml di tampone Krebs nel lume del colon prossimale per fornire abbastanza distensione di avviare contrazioni propulsive nella cavia ex vivo preparazione. NOTA: Questo volume può variare leggermente (0,1 - 0,2 ml) in funzione della lunghezza complessiva del segmento intatto e la quantità di stirata applicata al segmento nel bagno organo. </li><li> Una volta che il segmento è dilatato dal fluido luminale, accendere la fotocamera e quindi registrare la motilità per un periodo predeterminato di tempo (ad esempio, 10 min). <ol><li> In particolare, fare doppio clic sul processo nome appropriato per aprire la vista sperimentale fotocamera e quindi l&#39;interruttore in posizione &quot;ON&quot; per visualizzare il campo della fotocamera. Quindi, fare clic sul pulsante di registrazione per iniziare la registrazione (pulsante di registrazione rimarrà rosso mentre la fotocamera è di registrazione) unand fare di nuovo clic sul pulsante di registrazione per interrompere la registrazione. </li></ol></li><li> Al termine di questo processo iniziale distensione controllo, svitare / rimuovere il morsetto occludere il catetere aboral per consentire il segmento tissue per spingere il liquido distendere fuori del lume. </li><li> Dopo 10 min periodo di riequilibrio, ripetere questa procedura con qualsiasi di una varietà di sostanze nutritive, agenti bioattivi, farmaci o agonisti / antagonisti nel fluido luminale modificare la motilità propulsiva del segmento (ad esempio, acidi grassi a catena corta o decanoico L&#39;acido) 10,18. <ol><li> Per aiutare calibro quando il nuovo fluido sperimentale entra nel segmento colico, lasciare una bolla d&#39;aria vicino al porto della siringa in modo che dopo la perfusione della nuova soluzione nel colon lume il progresso della bolla permetterà all&#39;utente di sapere quando il fluido sperimentale ha raggiunto il lume. </li><li> Continuare perfusione intraluminale con il catetere aborale aperta finché la bolla è stato premuto completamente attraverso ilsistema di perfusione luminale (può richiedere 2-3 ml di perfusato). Poi, consentono il segmento tessuto di espellere fluido attraverso il catetere aboral aperta per 5 min. NOTA: Dopo questa procedura, il lumen conterrà un volume d&#39;fluido, consentendo perfusione di un volume noto di liquido nel lume. </li></ol></li><li> Re-occludere il tubo del catetere luminale aboral utilizzando un morsetto tubo (come al punto 4.3) iniettare lo stesso volume di distensione fluido come nella condizione di controllo attraverso la siringa. Registra gli schemi di motilità del periodo sperimentale per successiva analisi e confronto alla condizione Krebs di controllo (come nel passaggio 4.5). </li><li> Ripetere paragrafi 4.4 - 4.7 del protocollo con diversi composti luminali o diverse concentrazioni dello stesso composto luminale. </li></ol> 5. Costruzione di mappe spazio-temporale (STmaps) <ol><li> Dopo il completamento della registrazione dell&#39;esperimento, fare doppio clic sul nome di un processo specifico per aprire il vento analisiow per la costruzione di un STmap. </li><li> All&#39;interno dell&#39;area di riproduzione video, regolare i cursori contrasto e della luminosità nella finestra di analisi per rendere l&#39;immagine appropriata per l&#39;analisi (nero silhouette tessuto su sfondo chiaro, figura 4). NOTA: Se la calibrazione fotocamera non è stata eseguita in modo appropriato prima di iniziare l&#39;esperimento l&#39;immagine può essere modificata solo in misura minore, a questo punto. </li><li> Quando l&#39;immagine è contrastata correttamente, impostare le linee orizzontali e verticali rossi all&#39;interno della finestra immagine video per isolare la regione di tessuto per l&#39;analisi e rimuovere le aree contenenti artefatti. Inoltre, selezionare il segmento temporale appropriata dalla registrazione determinando inizio e fine punti di tempo per l&#39;analisi. <ol><li> In particolare, selezionare il punti iniziali e finali all&#39;interno del video utilizzando i pulsanti gialli &#39;B&#39; verde &#39;A&#39; e all&#39;interno del software di analisi. Impostare il cursore tempo per l&#39;inizio del segmento video per analizzare e lan fare clic sul pulsante &#39;A&#39; verde. Quindi, impostare il cursore alla fine del segmento per analizzare e fare clic sul pulsante giallo &#39;B&#39;. </li></ol></li><li> Avanti, fare clic sulla scheda &#39;analisi motore&#39; per aprire la finestra STmap e fare clic sul pulsante &#39;cronometro&#39;. Dopo aver cliccato il cronometro, prossimo clicca il cursore a croce all&#39;interno della sagoma nera del tessuto all&#39;interno del filmato registrato per iniziare generazione STmap. </li><li> Dopo aver cliccato il mirino nella silhouette del tessuto, il software genera e visualizza il STmap per quella regione del video. NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda della lunghezza del video selezionato per l&#39;analisi. </li><li> Fare clic su &#39;Zoom&#39; per vedere l&#39;immagine ingrandita della STmap e controlli per regolare l&#39;immagine. <ol><li> Selezionare l&#39;opzione &#39;colore&#39; nella finestra appena creata per visualizzare l&#39;STmap come colore invece che in scala di grigi. Inoltre, fare clic sull&#39;opzione &#39;Abilita&#39; per essere in grado di posizionare il cursore su specifici pixel all&#39;interno della mappa e view un tracciato della variazione di diametro luminale per quella regione tessuto specifico. Fare clic su &#39;Exit&#39; una volta terminato. </li></ol></li><li> Esportare un STmap per l&#39;uso in documenti o presentazioni o per analizzare ulteriormente in ImageJ selezionando il menu &#39;File&#39;, poi selezionando &#39;esportazione dati&#39; e poi &#39;Meta File&#39;. Nome della STmap, che sarà salvato come file EMF e fare clic sul pulsante &#39;Salva&#39;. </li><li> In alternativa, salvare le immagini del STmap catturando uno screenshot. Ciò è necessario per salvare le versioni pseudo-colore del STmap. </li></ol> 6. Analisi della contrattile della velocità dell&#39;onda in STmaps <ol><li> Per analizzare la velocità di propagazione contrattile o la durata di contrazione, prima convertire il file STmap .emf a .tiff, .gif, .jpg, .bmp o formati che siano accettabili per ImageJ attraverso un programma di conversione di file di scelta. NOTA: ImageJ non apre il formato di output EMF dei STmaps dal software. <ol><li> Alternatively, uso software cattura screenshot per scattare una foto di un STmap sullo schermo e salvarlo in un formato di file appropriato. </li></ol></li><li> Quindi aprire il STmap ri-formattato in ImageJ e quindi aprire il plugin GIMMProcessor aprendo il &#39;menu e selezionando&#39; &quot;Plugins GIMMProcessor &#39;. Si aprirà due&#39; finestre GIMMProcessor &#39;e&#39; Misure Tabella. </li><li> Fare clic sul &#39;strumento di selezione rettangolare&#39; all&#39;interno della finestra di ImageJ e quindi utilizzarlo per delineare cliccando e trascinando l&#39;intera area della barra di scala nell&#39;angolo in alto a destra della STmap. Dopo aver selezionato quella regione, fare clic sul pulsante &#39;set di calibrazione&#39; nel plugin. Infine, inserire la distanza adeguata (mm) e il tempo (sec) nella casella di taratura secondo i valori sulla barra di scala e fare clic su &#39;Fatto&#39;. </li><li> Avanti, fare clic sullo strumento di disegno riga nella finestra di ImageJ. Tracciare una linea sul STmap attraverso il centro di una contrazione propaga lungo l&#39;angolo di the pendenza cliccando e trascinando l&#39;immagine STmap su. In alternativa, tracciare una linea verticale attraverso una banda di non propagazione contrazione per determinare la durata di contrazione. </li><li> Dopo che la linea è disegnata in modo appropriato (una sola riga, può essere oggetto alla volta), fare clic sul pulsante &#39;prendere la misura&#39; nel plugin per generare una lettura-out della distanza orizzontale, distanza verticale, e la pendenza della linea; che corrispondono alla lunghezza (mm), il tempo (sec), e la velocità (mm / sec), rispettivamente. Questi dati vengono visualizzati nella finestra &#39;Misure Table&#39;. </li><li> Ripetere il disegno al tratto e l&#39;analisi i passaggi più volte all&#39;interno di un determinato STmap e salvare i dati in un file .gmd. Fare clic sul pulsante &#39;Salva&#39; nel plugin e il nome del file. Quindi fare clic di nuovo &#39;Salva&#39; per completare il processo. Questi dati possono poi essere confrontati con altri dati di prova o utilizzati per ri-disegnare linee su un STmap. </li></ol>

Catamount Research and Development, Inc., creator of the GIMM system, covered publication fees for this manuscript.

Motilità intestinale è stato visto e descritto da diversi punti di vista in base alla natura dei parametri in registrazione. Video registrazione e mappatura spaziotemporale è dimostrato uno strumento prezioso che permette l&#39;analisi di movimento complessivo e / o spinta su lunghe segmenti di intestino e analisi dell&#39;attività in punti specifici lungo il segmento. Il metodo adottato per la registrazione video e mappatura spaziotemporale può essere duplice e è riflettente della regione esaminato e la natura del contenuto luminale. Nei segmenti intestinali cui contenuto luminale più fluidi e colon prossimale cui contenuti sono più semi-solido, l&#39;attività è indotta dall&#39;introduzione di fluido intraluminale in bolo o per infusione. Mappe spazio-temporali in queste registrazioni video sono progettati per rappresentare il movimento dell&#39;intera segmento come descritto sopra. Al contrario, nel medio colon distale, dove i contenuti sono più solide, l&#39;attività è iniziata da inserimento di una pelle fecalet (epossidiche pellet naturali o artificiali pellet) e le mappe spazio-temporali sono progettati per riflettere il movimento del pellet attraverso i due punti come illustrato nell&#39;articolo JOVE di Hoffman et al. 13. Così la configurazione dell&#39;esperimento e l&#39;analisi sono cruciali e dipende dal tipo di stimolo e la regione in fase di studio. Pertanto, le fasi critiche per la generazione e l&#39;analisi delle mappe spazio-temporali di liquido indotta motilità intestinale sono: 1) corretta eliminazione del mesentere dal tessuto sezionato; 2) calibrazione dell&#39;immagine corretta prima della registrazione; 3) la corretta rimozione di artefatti durante la generazione e l&#39;analisi STmap; 4) la corretta configurazione del sistema di analisi; e 5) conquistando la manualità cateterizzare e suturare i segmenti senza danneggiarli. Mentre l&#39;uso di STmaps di diametro luminale hanno migliorato la capacità di visualizzare e analizzare i modelli completi motilità su una regione dell&#39;intestino, la tecnica è ottimale quando accoppiato conmisurazioni funzionali di pressione o di contrazione muscolare 2,15,20. Ad esempio, mentre alcune contrazioni muscolari possono cambiare diametro luminale leggermente ed essere visibile su alcuni STmaps (cioè, ondulazione miogenici) non possono effettivamente causare alcun propulsione o la miscelazione del contenuto intestinale 25. Questo non può essere conosciuta senza giunto di questa tecnica per altre misurazioni funzionali. Inoltre, la natura di molti preparati tissutali in questo tipo di sistema (cioè, un sistema chiuso o luminale costante perfusione luminale da un sistema di pompa) comporta difetti all&#39;interno STmaps. Così, l&#39;utente deve essere a conoscenza di come la loro preparazione organo specifico e esperimento può portare ad artefatti nei dati e modi per evitare o escludere questi artefatti di analisi dei dati (ad esempio, linee verticali mesentere indotta o pixelation buio a causa dell&#39;incapacità del tessuto espellere fluido dal sistema in un preparato luminale chiuso). Esistono diversi metodi per perfusione luminale di un intatto segmento intestinale oltre ad un sistema chiuso. Un metodo è quello di utilizzare invece un sistema aperto che mantiene costante intraluminale / indietro pressione attraverso l&#39;uso di un tubo in rilievo e / o la valvola unidirezionale sull&#39;estremità anale della preparazione 8-10,30. Questo permette al fluido di muoversi fuori dalla preparazione durante contrazioni propulsive. Poiché il sistema è configurato principalmente per rilevare i cambiamenti di diametro luminale, quelle contrazioni o modelli di motilità che non incidono notevolmente diametro luminale sono spesso difficili da visualizzare da questo protocollo. Poiché l&#39;evoluzione delle shading pixel all&#39;interno della STmap sono basati su variazioni di diametro luminale, schemi di motilità che non provocano grandi cambiamenti nel diametro non saranno visualizzati anche in questo metodo se contrazioni forti sono presenti anche all&#39;interno della stessa registrazione. Come descritto per la visualizzazione e l&#39;analisi di ondulazione tipo di contrazione (figura 3), cala analisi della registrazione video vicina to la parete tessuto può ovviare a questo problema. Questo metodo riduce il diametro massimo visualizzato all&#39;interno STmap, così contrazioni che cambiano solo minimamente diametro tessuto possono essere visualizzati. Un&#39;altra opzione per risolvere questo problema sta cambiando la durata del segmento video analizzato, per escludere contrazioni che influenzano notevolmente diametro luminale, cosicché contrazioni più piccoli sono più facilmente visualizzate. Questo porta al potenziale problema di motilità che cambia minimamente diametro luminale cercando simile a un STmap separato dove contrazioni notevolmente cambiati diametro luminale. Questo perché la determinazione di pixel bianchi sulla mappa si basa sul diametro più piccolo in un determinato video. Se non c&#39;è molto variabilità del diametro all&#39;interno del video (poca o nessuna contrazione del muscolo circolare) molto piccole contrazioni che non cambiano il diametro del preparato può notevolmente simile a contrazioni peristaltiche da un altro video. Pertanto, è importante considerare la figuraleggenda nell&#39;angolo in alto a destra della mappa. Se la differenza tra i diametri massimo e minimo è piccola, è importante confrontare il STmap al video è stato generato per determinare la validità del cambiamento ombra pixel come rappresentato nel STmap. Pertanto, l&#39;esame della barra della scala in collaborazione con la registrazione effettiva è fondamentale per la corretta interpretazione della mappa. Registrazione video e mappatura spazio-temporale di segmenti intestinali e del colon sono stati applicati a una varietà di specie, tra cui 26 zebrafish, topo 25,27 - 30, ratto 7,9,30 - 33, cavia 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, trichosurus 12,36, coniglio 2,30,37,38, pollo 39, maiale 40,41 e umano 42. Le specie più studiati è la cavia. Questo non è sorprendente perché la cavia sistema nervoso enterico hcome stato più completamente caratterizzata e storicamente è stato l&#39;animale più studiato in vitro per quanto riguarda la motilità propulsiva dell&#39;intestino 43. Mappatura spazio-temporale è stato per lo più applicata ai segmenti tubolari di budella da piccoli animali; tuttavia, gli studi nei sistemi modificati utilizzando il coniglio e maiale dimostrano l&#39;applicazione di questa metodologia di animali più grandi. Nel caso del coniglio, l&#39;approccio è identico a quello degli animali inferiori, salvo che i segmenti grandi e bagni di organi sono stati utilizzati 30. L&#39;approccio utilizzato nel maiale era di utilizzare un ciclo di esteriorizzato dell&#39;intestino da un suino anestetizzato piuttosto che l&#39;immersione di un segmento di tessuto sezionato in un bagno d&#39;organo. Inoltre, STmaps sono stati generati da cross-correlazione piuttosto che il metodo utilizzato nella transilluminazione maggior parte degli studi 40. L&#39;isolato, vascularly perfuso preparazione loop per la registrazione video e la mappatura spazio-temporale è stata applicata anche alle specie più piccole, come ratto <sup&gt; 33. Un recente studio condotto da Kuizenga et al. è il primo uso di STmaps dei video registrati modelli di motilità in ex vivo segmenti dell&#39;intestino umano 42; sebbene, approcci STmapping sono stati applicati all&#39;analisi di manometriche (pressione) registrazioni nell&#39;uomo in vivo 3,44. Gli schemi di motilità registrati nel tessuto umano sono simili a quelli già registrati in modelli animali con tecniche simili e convalidare l&#39;estensione di questo approccio di tessuti umani. È interessante notare che questo studio STmaps combinati derivano da registrazioni video con misurazione della contrazione muscolare registrata da trasduttori di forza. La misurazione della pressione intraluminale da una fibra ottica catetere manometrico inserito nel segmento ex vivo è stata anche convertito in STmap, che mostra la versatilità del STmap visualizzare più di cambiamenti di diametro luminale. Questo approccio tensione muscolare correlazione combinata, pressione endoluminale e il movimento della parete permetteper un&#39;analisi funzionale delle STmaps generate da registrare video più approfondita. Studi di STmaps generati dai movimenti a muro e variazioni del diametro luminale (chiamato anche DMAP) hanno permesso la descrizione dettagliata dei modelli di motilità come le onde peristaltiche propulsive e le contrazioni segmentale localizzati. Mentre questi modelli sono stati identificati con metodi sperimentali precedenti, l&#39;attuale approccio consente una definizione più raffinata dei movimenti contrattili localizzati, come increspature e nuove contrazioni anti-peristaltiche 9,24,25,30,31,42. La costruzione di STmaps e analisi delle variazioni del pattern di motilità sono stati applicati alle domande chiave nella motilità gastrointestinale dell&#39;intestino e del colon. Questi includono: la differenziazione delle contrazioni neurogena e miogenici e la definizione del ruolo delle cellule interstiziali di Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, la comprensione del complessointerazioni tra gli strati muscolari circolari e longitudinali 2,7,8,11,12,32,39,40, esaminando gli effetti dei nutrienti intraluminali 10,18,19, 34 ceppi microbici, e viscosità 12,36 su vari modelli di motilità, e la comprensione del ruolo di vari agenti neuro-ormonali endogeni e agenti farmacologici esogeni 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 nella generazione e modifica della motilità. Il futuro di questa tecnica comporta l&#39;accoppiamento con altre misure, tra cui pressione, elettrofisiologia e tensione / contrattilità. Recenti studi hanno spesso incorporato una o più di queste misurazioni in combinazione con registrazione video e mappatura spaziotemporale per fornire ulteriori dettagli correlativo 2,42. Inoltre, il sistema può essere utilizzato per misurare la motilità in altri organi tubolari e non tubolari. Ad esempio, si è tentato di misurare la motilità gastrica usandoun tale sistema, ma la tecnica e il software necessario raffinatezza quantificare meglio motilità in un organo simile non-tubolare 45. Non vi è dubbio che l&#39;utilizzo di tecniche di mappatura spatiotemporal solo e in combinazione con i metodi più tradizionali di analisi porterà ad una più approfondita e completa comprensione della motilità gastrointestinale in futuro.

Vari metodi di registrazione e l&#39;analisi motilità intestinale sono state sviluppate nel corso degli ultimi 150 anni 1. Questi hanno spaziato da quella iniziale in vivo osservazioni e descrizioni di William Beaumont e di Walter Cannon ai metodi più recenti di misura e l&#39;interpretazione di registrazione multisito di tensione muscolare, pressione intraluminale, e / o potenziale di membrana (cioè potenziali giunzionali) 2 - 6. Questi ultimi approcci forniscono un&#39;istantanea di modelli generali motilità, ma sono limitati dal numero di siti di registrazione e la validità interpolazione dei dati da zone tra i siti di registrazione. Il recente sviluppo di registrazione video e le tecniche di mappatura spazio-temporale (STmap) hanno permesso di osservare e analizzare i modelli di motilità complessi ex vivo interi segmenti di colon e dell&#39;intestino. Approcci iniziali, prima descritte per intessegmenti fonodale alla fine del 1990, 7,8 dipendeva software investigatore-progettato per analizzare la registrazione video; molti gruppi hanno ora creato o modificato il software per questo scopo 2,8 - 12. Mentre molti gruppi hanno generato i loro pacchetti software propri o plugin, tutti analizzano diametri di un segmento di tessuti e convertire i vari diametri alla rappresentazione in scala di grigi. Un sistema di registrazione e di analisi disponibili in commercio chiamato il Sistema di monitoraggio motilità gastrointestinale (GIMM) fornisce un approccio chiavi in mano che consente di analizzare sia motilità propulsiva via fecale determinazione velocità pellet nella cavia colon distale 13 così come l&#39;analisi dei modelli di motilità propulsiva e miscelazione con uno stimolo liquido nei segmenti intestinali intatte 4,5,14 - 19. Quest&#39;ultimo approccio dipende la generazione e l&#39;analisi di STmaps ed è descritto in questo documento. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di aumentare tha capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente diversi schemi di motilità presenti nell&#39;intestino. Mentre altri gruppi hanno usato il STmap per l&#39;analisi della motilità attraverso il proprio software, questa è la prima descrizione di come utilizzare il GIMM per analizzare i modelli di motilità dalla generazione di STmaps. Nel presente lavoro, forniamo istruzioni dettagliate passo-passo su: la preparazione dei tessuti intestinali per la registrazione video, la corretta impostazione dei parametri di registrazione video per massimizzare la capacità di rilevare variazioni del diametro del tessuto, la creazione di STmaps, così come il interpretazione e analisi dei STmaps utilizzando il sistema GIMM e software ImageJ. Il metodo qui descritto è specifico per l&#39;analisi della perfusione luminale dei liquidi o semisolidi contenenti composti che influenzano gli schemi di motilità intestinale. Un metodo per l&#39;analisi di fecale pellet propulsione è descritto in un articolo di Mawe e colleghi 13. Il metodo generale qui descritto potrebbe essereapplicato ad altri organi tubolari muscolari lisce quali: tenue, vasi sanguigni, uretra, ureteri, ecc Mentre questo metodo da solo non fornisce dati sulle variazioni di pressione o tensione muscolare, potrebbe essere accoppiato con l&#39;uso di pressione trasduttori, trasduttori di forza o misurazioni elettrofisiologiche per fornire un quadro più completo dei modelli di motilità come alcuni altri gruppi hanno dimostrato 2,15,20,21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxygen (95%O2/5%CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting trays/dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dunkin Hartley Guinea Pigs</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Freely available online.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM)</td>
			<td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td>
			<td></td>
			<td>Includes parts listed below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pumps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Cameras</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath TransIllumination Backlights</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ Baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Backlight Intensity Controls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIMM Processor ImageJ Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Connectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing for Peristaltic Pumps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Bath/Water Circulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal mapping of motility in ex vivo preparations of the intestines

Molteplici approcci sono stati utilizzati per registrare e valutare la motilità gastrointestinale, tra cui: i cambiamenti di registrazione in tensione muscolare, la pressione endoluminale, e potenziale di membrana. Tutti questi approcci dipendono misurazione dell&#39;attività in una o più posizioni lungo l&#39;intestino contemporaneamente che vengono poi interpretati per fornire un senso di schemi generali di motilità. Recentemente, lo sviluppo di registrazione video e le tecniche di mappatura spazio-temporale (STmap) hanno permesso di osservare e analizzare modelli complessi in ex vivo interi segmenti di colon e dell&#39;intestino. Una volta registrati e digitalizzati, registrazioni video possono essere convertiti in STmaps in cui il diametro del lume viene convertito in scala di grigi oa colori [chiamato mappe di diametro (DMAP)]. STmaps possono fornire dati sulla direzione motilità (ossia, stazionario, peristaltica, antiperistaltici), velocità, durata, frequenza e la forza contrattile dei modelli di motilità. I vantaggi di questo approccio sono: analysis di interazione o sviluppo simultaneo di diversi schemi di motilità in diverse regioni dello stesso segmento, visualizzazione del modello motilità cambia nel tempo, e l&#39;analisi di come l&#39;attività in una regione influenza l&#39;attività in un&#39;altra regione. Le registrazioni video possono essere riprodotti con differenti scadenze e parametri di analisi in modo che STmaps separati ed i modelli di motilità possono essere analizzati in modo più dettagliato. Questo protocollo dettagli in particolare gli effetti della distensione fluida e intraluminali stimoli intraluminali che influenzano la generazione motilità. L&#39;uso di agonisti e antagonisti dei recettori luminali fornisce informazioni su come meccanicistica specifici modelli sono iniziati e come un modello può essere convertito in un altro modello. La tecnica è limitata dalla capacità di misurare solo la motilità che provoca cambiamenti nel diametro luminale, senza fornire dati su cambiamenti di pressione intraluminale o tensione muscolare, e la generazione di artefatti basate su apparato sperimentale; anche se, analysimetodi s possono spiegare questi problemi. Rispetto alle precedenti tecniche la registrazione video e l&#39;approccio STmap fornisce una comprensione più completa della motilità gastrointestinale.

Comprendere mappe spazio-temporali (STmaps) come mappe Diametro (DMAP) Mentre le mappe generati da questa tecnica sono spaziotemporale, variazioni del diametro luminale del tessuto è il parametro specifico sia visualizzato in distanza e tempo. Il STmap ritrae distanza orizzontale lungo il segmento tissue l&#39;asse x (in mm) e l&#39;ora l&#39;asse y (in sec) con il tempo di avviamento al momento alto e termina nella parte inferiore. Nell&#39;angolo in alto a destra è una leggenda, che visualizza diametro luminale minimo e massimo, nonché di scala sia per la xey assi (Figure 1-4). Così, diverse tonalità di pixel all&#39;interno dell&#39;immagine in scala di grigio corrispondono a differenti diametri luminale. Più scuri pixel corrispondono ai diametri più ampi e pixel più chiari corrispondono ai diametri più piccoli. Pertanto, onde contrattili del muscolo circolare appariranno come regioni di pixelation leggero a causa della riduzione del diametro luminale ( <strong&gt; Figura 1 frecce nere). Al contrario, distensione luminale causa rilassamento muscolare circolare o un grande bolo di fluido provoca un aumento del diametro luminale e scuri pixel nelle (frecce bianche Figura 1C) STmap / Dmap. Un ulteriore discussione della formazione e del significato della STmaps può essere trovato in un articolo di gruppo di Lammers 11. Luminal distensione-indotte moltiplicazione Contrazioni Nella figura 1, cavia colon prossimale è dilatato con 0,5, 1,0, 1,5, e 2,0 ml di tampone Krebs per 5 minuti a ciascun volume. Contrazioni moltiplicazione stati suscitato da tutti i volumi ≥1.0 ml e appaiono bande bianche sottili nella STmap (Figura 1). La distensione del lume intestinale provoca l&#39;apertura di contrazioni moltiplicazione. Come mostrato in figura 1, il diametro del lume aumenta con maggiori volumi intraluminali e i pixel del STmapcorrisponde al suo diametro diventa più scuro creando uno sfondo scuro complessiva. Ad un certo livello di distensione viene attivato il riflesso peristaltico (1,0 ml; Figura 1), che avvia onde propulsive di contrazione al termine orale che riducono il diametro del lume e si muovono verso la fine anale del segmento (mostrato come bande bianche nelle figure 1 e 4). Il bianco contrazione banda rappresenta è spesso preceduta da una banda scura, che rappresenta il rilassamento aboral avanti dell&#39;onda peristaltica (frecce bianche Figura 1C). Questi pixel bianchi e neri corrispondono alla contrazione ascendenti e discendenti componenti rilassamento del riflesso peristaltico, rispettivamente 22,23. Nella STmap nella figura 1 pannello A, ci sono 0 onde propulsive a 0.0 ml, 0 onde propulsivi a 0,5 ml distensione, 3 onde propulsivi a 1,0 ml distensione, 6 onde propulsivi a 1,5 ml distensione, e 5 onde propulsivi unt 2,0 ml distensione. Stazionari / contrazioni miscelazione nutrienti indotta Ondate di moltiplicazione contrazione non sono l&#39;unico motivo motilità che può essere visualizzato con STmaps. Modelli miscelazione della motilità come segmentazione può essere visto anche in STmaps e corrispondente immagine (Figura 2A). Questo modello è diverso da quello di moltiplicazione contrazioni. Durante la miscelazione modelli molti piccoli, contrazioni stazionari si verificano in diverse aree contemporaneamente (visualizzato come più piccoli quadrati bianchi nella stessa linea orizzontale, ma non si toccano). Mentre ogni contrazione segmentale è fermo e non si muove nella orale maniera anale come descritto per contrazioni di moltiplicazione, la capacità dei STmaps per illustrare modelli contrattili complessi lunghi periodi di tempo permette la visualizzazione della lenta progressione delle contrazioni anally nel tempo (Figura 2A freccia nera). La durata diogni individuo contrazione può essere determinato anche tracciando una linea verticale attraverso la piazza contrazione bianco utilizzando ImageJ e il plugin associato (Figura 2A). In questo particolare STmap generato da perfusione intra-colon degli acidi grassi a catena corta, la durata media contrazione stazionaria è ~ 2 sec (range: 1,9-2,1 sec). Mentre mesentere rimanente su un segmento tessuto può causare artefatti di analisi, gli artefatti generati da linee verticali mesentere (figure 1B, 2B) possono essere utilizzati per determinare movimenti muscolari longitudinali. Nelle figure 1B e 2B il movimento orizzontale della linea verticale nera è dovuta alla contrazione e rilassamento della muscolatura longitudinale. Questo movimento laterale del muscolo longitudinale può essere visualizzato su STmaps come movimenti orizzontali delle bande verticali generati dai manufatti mesentere (figure 1B, 2B). ImageJ e Plugin Analisi di STmaps Sia la velocità di un&#39;onda di propagazione (Figura 3) così come la durata di contrazione (figura 2) può essere determinata utilizzando ImageJ e il plugin GIMMProcessor. Nella Figura 3, la velocità di propagazione delle onde sia ortograda e retrogrado era ~ 0.25 mm / sec (range: 0.21 al 0.35 mm / sec). Come si può vedere l&#39;immagine video sopra la mappa in ST, le linee di analisi (linee rosse che formano una scatola sull&#39;immagine video) sono stati fissati proprio attorno un bordo del segmento tessuti anziché intorno all&#39;intero segmento. Si tratta di un importante utilizzo delle linee guida nel software. Regolazione precisa di queste linee guida è fondamentale per una corretta analisi del video come ulteriormente analizzati nella sezione di discussione. Questo permette la generazione di un STmap che visualizza miogeniche contrazioni ondulazione 24. Queste contrazioni sono miogenico di origine e non cambiano diametro luminale notevolmente. Inoltre, dir diversoriflessioni di propagazione (ortograda o retrogradi), che sono comuni per increspature, possono essere analizzati utilizzando questa tecnica (Figura 3). Come mostrato in figura 2 la durata della contrazione può variare nelle diverse regioni del segmento tissue. Analisi corretta di STmaps Un potenziale problema con la creazione di STmaps è possibile generazione artefatto dovuto alla metodologia sperimentale. Per esempio, mesentere lasciato all&#39;esterno del tessuto aumenta il diametro lettura per quel segmento del tessuto creando una linea nera verticale sulla STmap (figure 1, 2B). La presenza di mesentere anche amplia artificialmente mappa scala di grigi aumentando la misura più larga lume, che si traduce in un&#39;attenuazione delle misure di contrasto della scala. Per questo motivo è utile per rimuovere il mesentere più completamente possibile dal segmento senza perforare il tessuto. Un<html> altra possibile artefatto STmap è una linea verticale bianca a causa di bolle all&#39;interno del fluido luminale che non può essere contrapposta al nero (Figura 4B). Queste bolle possono rendere il diametro luminale sembrare più piccolo al software di analisi o sovrapporre regioni bianco / luce sugli schemi di motilità del STmap. Pertanto, l&#39;installazione del segmento del tessuto e proprio contrasto della registrazione video prima analisi sono assolutamente cruciale per il successo nella costruzione STmaps (Figura 4). Configurazioni contrastanti corretta e non sono mostrati in Figura 4. È importante notare che la regolazione video sia la calibrazione della camera di pre-esperimento e finestra di analisi post-esperimento sono cruciali per la generazione STmap corretta ed analisi. Calibrazione dell&#39;immagine non corretta può portare a STmaps con dati inutilizzabili (Figura 4A). 700 &quot;/&gt; Figura 1. onde che si propagano nel colon prossimale. (A) Una curva distensione-risposta (eseguita nella cavia colon prossimale) è stata utilizzata per determinare il volume di fluido intraluminale opportuno avviare propagazione delle onde in questo segmento (bande bianche orizzontali). Frecce nere illustrano esempi di onde di propagazione full-length. Frecce bianche illustrano l&#39;artefatto linea causato dalla rimozione mesentere incompleta. (B) Una visione più ravvicinata di moltiplicazione contrazioni raggiunti dalla generazione STmap da un esperimento simile a Pannello A, ma un video di durata più breve. È facile notare che le contrazioni progrediscono in direzione orale anale e per identificare il rilassamento aboral precedente rappresentato come un&#39;area scura avanti della banda bianca rispetto al pannello A. Questa mappa fornisce anche un&#39;altra vista di manufatti mesentere. La scatola rossa identifica la regione di questo STmap ampliato nel Pannello C. (C) Questo pannello mostra una visione ancora più vicina of lo stesso video e la mappa come nel pannello frecce B. Bianchi etichettati punto &#39;Distensione Fluid&#39; di pixel scuri che sono dovuti a luminale distensione da aborale fluido l&#39;onda di propagazione. Si tratta di regioni in cui si verifica il rilassamento muscolare circolare aborale alla contrazione muscolare circolare. Si noti che le contrazioni si propagano sembrano linee completamente orizzontali nel pannello A causa della lunga scala temporale della mappa. Nei pannelli B e C il tempo di scale sono graduale diminuzione in modo che l&#39;onda contrattile ha una pendenza che può essere misurato e riportato come la velocità del movimento delle onde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Determinazione della contrazione durata per STmap. (A) Cavia prossimale del colon shOWS un modello motilità miscelazione / segmentale in risposta alla perfusione endoluminale di acidi grassi a catena corta (butirrato). Linee rosse verticali sono state elaborate attraverso i periodi di contrazione per determinare la durata contrazione utilizzando immagine J e il plugin GIMMProcessor. La freccia nera indica la direzione di propagazione aboral delle contrazioni stazionari. (B) contrazioni moltiplicazione in topo ileo spesso mostrano regioni di contrazione sostenuta. Frecce verticali disegnate su questa mappa mostra che le regioni più orali rimasti contratti per una durata più lunga. In questa preparazione, la fine anale della preparazione venne chiuso per evitare fluido di lasciare il sistema chiuso durante le contrazioni del tessuto. L&#39;immagine in alto del pannello mostra un momento in cui l&#39;intera parte orale del tessuto è contratta (bianco su STmap), mentre l&#39;intera parte anale è distesa da fluido (nera STmap). Il movimento orizzontale / laterale del nero verticale nel centro del pannello B STmap mostra il movimento delstrato muscolare longitudinale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Schemi bidirezionale motilità. Propagazione onde possono muoversi in entrambe ortogrado (orale anale) e retrograda (anale orali) direzioni. Frecce nere indicano Solid normale propagazione ortograda e frecce nere tratteggiate mostrano propagazione retrograda. La velocità di propagazione sia orthograde e contrazioni retrogrado in questo STmap stati determinati mediante analisi ImageJ ed erano ~ 0.25 mm / sec. Linee di analisi delle immagini (linee rosse che formano una scatola dell&#39;immagine video qui sopra la STmap su) sono stati posti a distanza ravvicinata un bordo del tessuto di visualizzare contrazioni ripple miogenici che sono bassa ampiezza, contrazioni poco profondi spesso orientati in ortograda, retrograde, o entrambe le direzioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. L&#39;importanza del contrasto delle immagini per STmap generazione. (A) mostra un&#39;immagine impropriamente contrastato e STmap, mentre riquadro B mostra un&#39;immagine adeguatamente contrastata e STmap. In (A) le bande orizzontali bianche generato dall&#39;immagine correttamente contrastata (B) non sono così evidenti e ci sono più artefatti (ombreggiamento bianco) a causa l&#39;immagine iniziale di essere in scala di grigi. Nella STmap generato dalla corretta contrastata immagine (B) i manufatti di ombreggiatura bianchi della scala di grigi scompaiono e onde di propagazione sono più pronunciate. Inoltre, l&#39;ombreggiatura nero che rappresenta il rilassamento ahead della propagazione dell&#39;onda contrattile può essere visto nel fine anale del STmap con ogni onda di contrazione. Nel pannello B frecce bianche illustrano un artefatto STmap generato da una regione dell&#39;immagine che non possono essere adeguatamente contrastata. Questo tipo di artefatto è in gran parte dovuto alle bolle intraluminali che ogni tanto si verificano nella preparazione durante il corso del protocollo sperimentale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mappatura spazio-temporale di motilità in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparazioni di intestini

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

spatiotemporal-mapping-motility-ex-vivo-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

10.3K Views.  Virginia Commonwealth University. Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Video: Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Ex vivo Carico meccanico del tendine

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Ricerca

Biologia

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Espressione mirato di GFP nel follicolo pilifero Utilizzando Ex trasduzione virale Vivo

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor motilità gastrointestinale (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...