This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

1. coltura di cellule su micropost Array Nota: Tutte le operazioni devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. I volumi qui indicate sono per T25 fiasche di coltura cellulare. La coltura cellulare medio ricetta e la semina delle cellule densità sono ottimizzati per le linee di cellule di cancro osseo HuO9 e M132. <ol><li> Preparare una coltura cellulare per la semina su una matrice micropost. <ol><li> Controllare la qualità coltura cellulare posizionando il pallone di coltura su un microscopio ottico standard. Assicurarsi che le cellule mostrano una crescita e morfologia tipica stimando quanto del fondo pallone di coltura è coperto. Una copertura del 70% -80% riflette un tasso di crescita sana. Prestare attenzione alla quantità di cellule galleggiante in quanto rappresentano le cellule morte e / o una cultura troppo cresciuto. </li><li> Trypsinize cellule rimuovendo medie e lavaggio con 4 ml 1x tampone fosfato (PBS). Aggiungere 0,8 ml 1x tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a RT finché la cellas sloggiare, che dura circa 2-4 minuti. Controllare il processo con il microscopio e di tanto in tanto toccare il pallone con delicatezza per sostenere il sloggiare. </li><li> Aggiungere 5 ml di mezzo di coltura cellulare (Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / F12 con 10% di siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina / streptavidina (Pen / Strep)) per arrestare la reazione e per lavare le cellule residue che ancora siedono sul fondo della beuta. Successivamente pipetta questa sospensione su e giù più volte per ottenere una miscela omogenea. Assicurati di pipetta tutte le soluzioni in tutta l&#39;area di crescita originale del pallone per ottenere un efficace sloggiare. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare utilizzando una centrifuga da tavolo a 0,5 xg per 3 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo pipettando su e giù 5 volte. Assicurati di evitare la generazione di bolle, mentre farlo. </li><li> Determinare densità cellulare utilizzando una camera di conteggio cellulare e un microsco lucepe. Controllare la sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule per aggregati di cellule e garantire avere solo singole cellule per il successivo esperimento. Pipetta di nuovo su e giù parecchie volte se le cellule tendono a formare aggregati per separarli. </li><li> Diluire la sospensione cellulare con il mezzo sufficiente per ottenere una soluzione di cellule di 25.000 cellule / ml. Mescolare bene invertendo la provetta chiusa più volte. </li></ol></li><li> Preparare una matrice micropost per la semina delle cellule. NOTA CRITICA: Non pipetta sulla matrice micropost direttamente in quanto ciò potrebbe potenzialmente danneggiare le microposts, soprattutto quando vengono introdotti bolle indesiderate. Inoltre, assicurarsi che la matrice micropost non si asciuga come si verificano forze capillari portano al collasso delle microposts. <ol><li> Posizionare il substrato di vetro con l&#39;array micropost affrontare in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti utilizzando un paio di pinzette e bagnare con l&#39;aggiunta di 1 ml di etanolo (99%). Incubare a temperatura ambiente per 20-30 secondi. </li><li> Diluire l&#39;etanolograduale con l&#39;aggiunta di circa 1 ml di acqua deionizzata sterile (acqua DI) sul lato pozzo ed aspirando circa 1 ml utilizzando una pipetta di trasferimento o di dispositivo di aspirazione. Ripetere questa operazione almeno 3 volte. </li><li> Sostituire l&#39;acqua demineralizzata con PBS-buffer nella stessa maniera aggiungendo ed aspirando circa 1 ml. Ripetere questa operazione per 3 volte. </li><li> Sostituire la PBS-buffer con media aggiungendo e aspirando circa 1 ml di terreno. Ripetere questa operazione per 3 volte. </li></ol></li><li> Pipettare 1 ml di soluzione di cellule (25.000 celle) sulla parte superiore di ciascun array micropost preparati. Chiudi piastra multi-pozzo e trasferirlo in un incubatore (5% CO 2, 37 ° C). Lasciate che le cellule aderiscono e crescono in cima microposts per 6 -7 ore. </li><li> Controllare il processo di adesione di tanto in tanto, utilizzando una luce microscopio. Controllare che la maggior parte delle cellule appaiono sparsi su più microposts. </li></ol> 2. fissaggio e colorazione delle cellule Nota: Tutti i passi evolumi qui indicate sono per un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Si raccomanda di processo non più di quattro dei dodici pozzetti alla volta per evitare un prosciugamento dei pozzi dopo l&#39;aspirazione di qualsiasi liquido, che si tradurrà in un collasso delle microposts. <ol><li> Aspirare il terreno dal pozzo e lavare le cellule 2x con 1 ml di PBS-buffer. Assicurarsi di applicare una forza gentile durante il lavaggio con PBS per rimuovere i detriti cellulari che si sono accumulati sulla matrice micropost durante l&#39;incubazione e di staccare le cellule morte. </li><li> Fissare le cellule con 0,5 ml di 3,7% soluzione di formaldeide tamponata per 5 min. </li><li> Sostituire la soluzione di formaldeide lavando i 2x matrice micropost con 1 ml di acqua deionizzata sterile. </li><li> Macchiare le cellule con colorante (0,05% Coomassie Brilliant Blue a 50% di acqua, 40% di etanolo e 10% di acido acetico) per circa 90 sec. Lavare soluzione colorante in eccesso 2x con 1 ml di acqua deionizzata sterile. Aggiungere acqua deionizzata 1 ml di micropost array. </li><li> Controllare risultato colorazione utilizzando un microscopio ottico. Ripetere tegli la colorazione passo, se il corpo cellulare è troppo debole per essere visualizzato. </li><li> Array Conservare micropost con le cellule colorate sulla parte superiore in un frigorifero a 4 ° C. Assicurarsi di tenerli sotto l&#39;acqua in ogni momento. </li></ol> Imaging 3. cellulare Nota: Passo 4 si applica solo ai microscopi senza corretto all&#39;infinito ottica. <ol><li> Aggiungere 2 ml di acqua demineralizzata per una capsula di Petri con un fondo di vetro sottile per immagini ad alta risoluzione. </li><li> Trasferire matrice micropost con un paio di pinzette nel piatto di imaging con le microposts rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Porre la capsula Petri di imaging su una fase mobile di un microscopio ottico. </li><li> Ruotare l&#39;anello di compensazione della lente utilizzata per l&#39;imaging finché il numero sulla scala rappresenta lo spessore totale di tutti i materiali lungo il percorso ottico per compensare la mancata corrispondenza indici di rifrazione del substrato di vetro, l&#39;elastomero di silicone e il liquido sulla parte superiore. Ciò dovrebbe portare ad un aspetto brillante dei micropostscore. </li><li> Chiudere il diaframma sul lato illuminazione fino al 50% e rimuovere eventuali anelli contrasto di fase dal percorso ottico consente un&#39;innovativa modalità campo chiaro ordinario. </li><li> Allineare la matrice micropost che i microposts formano una linea orizzontale attraverso il campo di osservazione. Definire un punto di partenza (ad esempio, in alto a sinistra) e spostare il piatto graduale Petri sul palco la scansione dell&#39;array micropost durante l&#39;assunzione di numerose immagini. </li><li> Prendete tutte le immagini con l&#39;impostazione di massima risoluzione per la telecamera con un obiettivo 20X o 40X. Lo scopo di avere una singola cella nel centro dell&#39;immagine. </li><li> Sweep lungo l&#39;asse z attraverso il substrato fino a che le punte micropost sono a fuoco. Usare la multa volante fuoco sintonizzazione del microscopio e girarlo verso concentrandosi sul fondo micropost per circa 2-3 micron. </li><li> Stabilire una procedura di imaging normale prendendo serie di immagini di prova di una sezione matrice spazzare attraverso i parametri di imaging uno alla volta (ad esempio, il tempo di esposizione,impostazione del diaframma, Impostazioni lampada ecc). Analizzare le immagini con MechProfiler e determinare un set di parametri adatto per un&#39;analisi veloce e affidabile. </li></ol> Analisi 4. Immagine con Software Open Source &quot;MechProfiler&quot; Nota: tutte le funzioni del software possono essere attivate con un dispositivo di puntamento con il tasto sinistro del mouse. Tuttavia, un operatore esperto userà la scorciatoia documentate progettati per essere nella metà sinistra della tastiera per consentire una efficiente elaborazione delle immagini a due mani. <ol><li> Avviare l&#39;analisi delle immagini software MechProfiler e aprire una serie di immagini che devono essere analizzati facendo clic su &quot;Apri&quot;. </li><li> Inserire tutti i parametri nella sezione &quot;Impostazioni&quot; proposta dal sviluppatore di software. Determinare i parametri che devono essere configurati personalizzati (cioè, la soglia di contorno e distanza minima) secondo le modalità descritte in dettaglio nel manuale del software. </li><li> Analizzare immagines uno per uno per loro ritaglio per l&#39;area di interesse usando &quot;Crop&quot; (fare clic e trascinare con il pulsante del mouse premuto). Fare doppio clic all&#39;interno del rettangolo disegnato per completare questa azione. </li><li> Marcatura ogni profilo cellulare visibile uno per uno cliccando su &quot;Pareggio contorni cellulari&quot; e utilizzare il cursore cross hair per il disegno comprese tutte microposts la cella è collegata. </li><li> Eliminare le microposts indesiderate facendo clic su &quot;Scartare Messaggi&quot; e utilizzare il cursore cross hair per disegnare. Racchiudere tutti microposts che appartengono a una cella di fuori della sezione dell&#39;immagine o che vengono deviati per qualsiasi altro motivo, ma non dalla cella di interesse. </li><li> Avviare il sottoprogramma software &quot;Trova Centroidi&quot; con un clic del mouse. Regolare l&#39;impostazione proprio accanto al pulsante &quot;Cerca Centroidi&quot; fino a quando vengono registrati tutti i microposts, che è visibile da una croce rossa nel loro centro filtro. Se l&#39;impostazione del filtro è troppo basso microposts verranno ignorati, se è troppo alto muposizioni ltiple saranno contrassegnati per un singolo micropost. Mantenere l&#39;impostazione costante nel corso di una sessione di analisi del filtro. </li><li> Utilizzare la funzione di editing manuale &quot;Modifica manuale&quot; per i baricentri con più o mancati posizioni micropost. Utilizzare i capelli del mouse croce per selezionare la micropost in questione facendo clic e trascinandola attraverso. Fare doppio clic all&#39;interno del rettangolo e posizionare l&#39;indicatore rosso mancante nella sezione ingrandita, che si chiude automaticamente. Scarta una tale micropost se è al di fuori della struttura di cella disegnato (vedi punto 4.5) prima di procedere. </li><li> Trova la griglia micropost ideale attivando la funzione &quot;Crea Grid&quot; con un clic del mouse. Assicurarsi che la posizione corrisponde con il vero capo micropost, dimostrato da un anello blu, all&#39;interno della struttura di cella disegnato. </li><li> Correggere qualsiasi produttore di griglia fuori luogo all&#39;interno della cella dove necessario utilizzando la funzione corrispondente &quot;Manuel Edit&quot; con un clic del mouse. Utilizzare il mirino per selezionare il micropost in question cliccando e trascinando trasversalmente. Fare doppio clic all&#39;interno del rettangolo che appare e posizionare il mancante indicatore blu nella sezione ingrandita, che si chiude automaticamente. </li><li> Utilizzare il pulsante &quot;Calcola flessioni&quot; di clic del mouse per ottenere un istogramma dei valori di deflessione calcolati in base alla differenza tra la posizione di un micropost all&#39;interno della sezione delle immagini e la griglia ideale generato. </li><li> Salvare l&#39;analisi completa comprese le tabelle di valori da un clic del mouse su &quot;Salva&quot;. </li><li> Continuare l&#39;analisi delle immagini facendo clic su &quot;Reset View&quot; e analizzare un&#39;altra sezione immagine o click del mouse su &quot;Avanti Immagine&quot;, che comodamente può essere fatto con il tasto cursore della tastiera destra. </li></ol> 5. Analisi dei dati - Mechanoprofiling <ol><li> Aprire il file &quot;Results.xls&quot; con un programma di Office foglio dalla cartella con le immagini analizzate. Esso contiene i dati con altril valori calcolati tra cui tutte le deviazioni micropost e misure standard derivati ​​quali il lavoro (ad esempio, energia substrato deformazione) da parte della cellula analizzata. </li></ol>

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	<li>Sharma, R. I., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+biomechanical+gradients+for+directed+bone+marrow+stromal+cell+differentiation+toward+tendon+and+bone.">Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone.</a> Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).</li><li>Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+and+biophysics+of+cancer+cells.">Biomechanics and biophysics of cancer cells.</a> Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).</li><li>Bartalena, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+adherent+single-cell+stiffness+in+tension:+design+and+testing+of+a+substrate-based+live+cell+functional+imaging+device.">A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device.</a> Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).</li><li>Tan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+Temperature+Operable+Autonomously+Moving+Bio-Microrobot+Powered+by+Insect+Dorsal+Vessel+Tissue.">Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue.</a> PloS ONE. 7 (7), (2012).</li><li>Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+retraction+of+bundled+type+IV+pili+enables+nanonewton+force+generation.">Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation.</a> Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).</li><li>Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Chemo-Mechanical+Effects+of+an+Anti-Cancer+Drug+Emodin+on+Breast+Cancer+Cells.">Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).</li><li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Cellular+Traction+Forces+by+Micropillar+Arrays:+Contribution+of+Substrate+Warping+to+Pillar+Deflection.">Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection.</a> Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li><li>Lemmon, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+for+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).</li><li>Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+subcellular+measurement+of+cell+stiffness+using+a+microengineered+stretchable+micropost+array+membrane.">Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane.</a> Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).</li><li>Roure, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+mapping+in+epithelial+cell+migration.">Force mapping in epithelial cell migration.</a> PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).</li><li>Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+role+of+material+surface+topography+and+wettability+on+cell-material+interactions.">Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions.</a> Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).</li><li>Badique, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+nuclear+deformation+on+micropillared+surfaces+by+substrate+geometry+and+cytoskeleton+organization.">Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization.</a> Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).</li><li>Sniadecki, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+microposts+as+an+approach+to+apply+forces+to+living+cells.">Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells.</a> PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).</li><li>Weng, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone-based+stretchable+micropost+array+membrane+for+monitoring+live-cell+subcellular+cytoskeletal+response.">A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response.</a> Lab Chip. 12, 731-740 (2012).</li><li>Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> J Vis Exp. (8), e311 (2007).</li><li>Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+stem+cell+mechanobiology+on+microfabricated+elastomeric+substrates+with+geometrically+modulated+rigidity.">Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity.</a> Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).</li><li>Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+in+Cell+Biology.">Micropatterning in Cell Biology.</a> Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).</li></ol>

The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

Questo lavoro si propone di avanzare il campo della microscopia a forza di trazione da una consistente riduzione delle barriere tecniche e pratiche all&#39;ingresso. Queste barriere provengono da due lati. In primo luogo sono le numerose sfide tecniche non banali che devono essere superati per la produzione riproducibile e commissionare una matrice micropost sperimentalmente. In secondo luogo, è similmente non banale necessità di una affidabile analisi semiautomatico delle forze monocellulari - tenendo presente che un...

Saggi cellulari meccano-sensibili permettono di indagare cellule aderenti, con una vasta gamma di applicazioni che riflettono il ruolo centrale che la meccanica possono giocare in biologia cellulare. Queste applicazioni spesso si concentrano sui meccanismi di base che guidano i processi subcellulare o comportamenti a cellule intere. Da un lato, i fattori ambientali esterni come composizione della matrice extracellulare o rigidità matrice possono influenzare notevolmente la risposta meccanica e biologica di una cella. 1 Lo stesso può essere osservato dopo l&#39;uso di numerose classi di composti farmaceuticamente attivi, i cui effetti sono spesso caratterizzate usando modelli di coltura cellulare. 2 D&#39;altro canto proprietà genotipici, come quelle causate da mutazioni genetiche spontanee o indotta sperimentalmente, può indurre forti variazioni fenotipo cellulare che sono associati ad alterazioni nella struttura e funzione del citoscheletro. 3 Questi esempi sono solo alcune delle molte possibiliArgomenti per i quali fenotipizzazione meccanica delle cellule è rilevante, e tutti questi sono stati utilmente studiati con gli array micropost. Al momento in cui scriviamo, circa 200 articoli sono stati pubblicati descrivono l&#39;interazione cellule-micropost. Queste opere discutono aspetti teorici della micropost principi di deflessione e le istruzioni pratiche su loro fabbricazione. Il primo articolo descrive l&#39;interazione delle cellule e array micropost flessibili è stata pubblicata da Tan e colleghi nel 2003. 4 In contrasto classica microscopia a forza di trazione (TFM) dove substrati molli continui sono utilizzati per stimare contrattilità cellulare nanonewton scala, Tan et al. descritto un metodo che utilizza multipli travi verticali strettamente distanziati di elastomero siliconico. I principali vantaggi di questa tecnica emergono due caratteristiche principali. Prima, per cambiare il substrato rigidità cellulare apparente basti cambiare le dimensioni micropost mantenendola composizione del substrato altrimenti costante ed evitando differenze di topologia superficiale e chimica. Seconda microposts agiscono come singole sorgenti che possono essere analizzati in modo discreto con forza e risoluzioni spaziali dell&#39;ordine di singole adesioni focali e in grado di ridurre le sfide analitiche che sono inerenti all&#39;analisi analoga dalla norma TFM. Oggi la gamma di applicazioni per le matrici micropost supera di gran lunga solo la mappatura delle forze per un paio di singole cellule. Ad esempio, Akiyama riporta l&#39;uso di un isolato tessuto vaso dorsale da un bruco falena come attuatore per una matrice micropost, al fine di sviluppare un insetto propulsione muscolare autonoma micro-robot. 5 Tuttavia, le applicazioni più pubblicati di microposts sono concentrati su studi di condizioni mediche come infezioni o cancro. Ad esempio, gli array micropost sono stati utilizzati per studiare la costituzione della forza di tipo IV in bundle pili di Neisseria gonorrhcolonie OEA che è associato con cascate di segnale migliorando infezione. 6 Altri hanno utilizzato microposts studiare le cellule del cancro al seno trattate con composti farmaceutici rivolte al citoscheletro. 7 Flessione di un micropost viene spesso descritto con la teoria classica del fascio per un cantilever con un carico fine assumendo la cellula si attacca solo alla punta estrema della micropost. Qui la forza applicata F che causa una deviazione δ dipende k &quot;rigidezza flessionale&quot; del micropost ed è calcolato mediante: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) con E, I e L essendo il modulo di Young, superficie momento di inerzia e fascio lunghezza rispettivamente. Tuttavia, i risultati di questa equazione solo dare un&#39;approssimazione generale delle forze in gioco dal fascio tranciatura e piegatura e deformazione substrato non vengono presi in accontare. Considerando che microposts sono in genere realizzati con materiali morbidi come il polidimetilsilossano (PDMS) a base di gomma siliconica di questi fattori devono essere inclusi. . Schoen et al hanno dimostrato che vi è un tale fattore di correzione in base al rapporto di aspetto del micropost (L / D) e il rapporto di Poisson del polimero corrispondente v 8 Si è dato da.: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) Con T inclinazione (v) essendo un coefficiente di inclinazione che include il parametro un raccordo = 1,3 come si possono trovare nello stesso articolo: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) Ciò significa rigidità corretto del micropost k corr è il prodotto del puro curvatura rigidezza k = k bend e il fattore di correzione corrin: <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) Pertanto, i calcoli di forza delle cellule devono essere effettuate utilizzando la variazione più raffinata dell&#39;equazione (1) ora di lettura: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) L&#39;impatto della correzione diventa più evidente non appena vengono utilizzati i valori tipici per le quote micropost. Ad esempio, una lunga micropost 15 micron con una sezione trasversale circolare e un diametro di 5 micron in gomma siliconica a base di PDMS porta ad un fattore di correzione di 0,77 e quindi un calcolo non corretta potrebbe sovrastimare le forze esercitate cellulari del 23%. Questo diventa ancora più grave per microposts con proporzioni minori. Tradizionalmente, micropost analisi delle immagini si è basato anche sulla teoria flessione fascio idealizzato. Nel 2005 il gruppo che aperto la strada all&#39;uso di MICRarray opost pubblicato un software di analisi delle immagini adatto per l&#39;analisi micropost 9 Il software richiede una licenza software e l&#39;utente deve prendere tre immagini per ogni posizione.; uno ciascuno da piani superiore e inferiore del micropost in trasmissione e un altro in modalità fluorescenza con la cellula colorata. Dopo aver confrontato le posizioni superiore e inferiore per ogni micropost il software determina un campo di forza vettoriale e calcola i parametri correlati come forza per posta. Esistono altri pacchetti software e loro principi di analisi sono brevemente menzionati negli articoli corrispondenti che li descrivono, ma questi pacchetti software di analisi non sono generalmente disponibili al pubblico. 10,11 Gli array micropost progettati per forze cellulari mappatura possono essere classificati come essendo in un layout micropost ortogonali o uno esagonale, l&#39;ultima delle quali hanno il vantaggio di lacune equidistanti tra tutti microposts vicini. Microposts tipici ettarive una sezione trasversale circolare e le loro dimensioni variano da 1,0 micron a 10 micron di diametro e 2 a 50 micron di lunghezza. 4 Tuttavia, sono stati riportati anche microposts a sezione ellittica o quadrata. 12,13 L&#39;uso di miscele a base di silicone-PDMS come materiale micropost permette di aggiungere nanoparticelle nella miscela. Per esempio l&#39;aggiunta di cobalto nano-barre consente un&#39;attivazione magnetico della micropost e quindi dà un grado di libertà per i potenziali progetti sperimentali. 14 maggior parte dei gruppi producono i loro allineamenti micropost su substrati rigidi piatti come copertura in vetro o all&#39;interno di una capsula di Petri. Tuttavia, Mann e collaboratori recentemente riportato una matrice micropost formata su una membrana elastica. 15 Ciò consente l&#39;applicazione di cellule che si estende forze di cellule aderenti durante gli studi live-cell subcellulare risposte dinamiche in termini di contrattilità delle cellule. L&#39;e più isti largamente impiegatoprocesso tuito per rendere gli array micropost è basato su litografia soft, come descritto nei protocolli penetranti di Sniadecki e colleghi. 16-18 Nei processi standard, camere bianche brevi sono usati per generare le microstrutture sulla cima di un wafer di silicio con photoresist SU8. Questa è seguita da un processo di copia in cui la gomma di silicone è gettato sulle strutture che li trasferiscono in stampi. In una seconda fase questi stampi sono utilizzati per replicare la microstruttura iniziale utilizzando gomma siliconica su di un substrato scelto. Tuttavia, nonostante il grande e crescente numero di pubblicazioni relative alla loro applicazione, stabilendo un processo di fabbricazione per microposts richiede una notevole quantità di tempo anche per gli esperti di micro-ingegneria; ci sono molte fasi di processo che richiedono ottimizzazione e adattamento all&#39;ambiente specifico laboratorio e la layout micropost per produrre un livello di qualità accettabile. Array micropost commerciali sono ora disponibili in un ready-tformato o-uso (&quot;off-the-shelf&quot;) con una qualità elevata e costante. Come tali sono un&#39;alternativa al lungo e complesso processo di produzione necessarie per la produzione in loco. In questo lavoro un allineamento micropost disponibile in commercio è stato utilizzato per la mappatura delle forze cellulari utilizzando una singola immagine al microscopio un campo chiaro. Ancora più importante questo articolo descrive e documenta un software open-source pienamente funzionale denominato MechProfiler, che è disponibile per il download come materiale supplementare di questo manoscritto. Una versione attivamente mantenuto del software si possono trovare anche in http://www.orthobiomech.ethz.ch. La combinazione di un saggio &quot;off-the-shelf&quot; e una compatibile con software di analisi open source riduce notevolmente l&#39;ostacolo ingresso per raggiungere esperimenti TFM accurate. I ricercatori non hanno accesso a entrambi i servizi in camera puliti o esperienza di sviluppo di software in grado di analizzare le forze cellulari con successo. Esso consente all&#39;utente di concentrarsi sulle mechanosensitivity uscita test piuttosto che la tecnologia stessa, e fa misure di forza di trazione disponibili a una comunità più ampia. Inoltre, questo è un passo importante per spianare la strada verso lo screening completamente automatica di array micropost. Il software di analisi MechProfiler elabora le immagini in file di formato tiff, png, bmp e jpg. Le immagini possono essere scattate con la fluorescenza, contrasto di fase o in campo chiaro microscopia ottica. Il programma standalone funziona insieme con la libera Matlab compilatore runtime (disponibile presso: Figura 12) e gli algoritmi sottostanti consentire l&#39;elaborazione delle immagini semplificata, che permette all&#39;utente di elaborare immagini con cellule singole o multiple in circa 1 min. Inoltre, queste cellule possono essere o vivere o &quot;fissi&quot;. Il software MechProfiler è in grado di aumentare notevolmente la velocità di analisi dei dati basandosi su riproducibilità di array micropost qualità commerciale, più specificamente, il default e #8220, non deviato &quot;posizione di ogni post nella matrice si può presumere contro una griglia ideale (tolleranze di fabbricazione per la griglia in matrici utilizzate per questo studio sono stati inferiori a 100 nm). In breve si apre una selezione di file di immagine per l&#39;analisi, le colture per la regione di interesse, definisce i posti coperti dalle cellule o che devono essere scartati, determina le posizioni postali, calcola le deformazioni / forze contro la griglia ideale, e, infine, salva tutti i dati specifici delle cellule con la possibilità per l&#39;esportazione, tra cui a un ufficio foglio elettronico standard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flasks</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS-buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS South America</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge vials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropost array&#160;</td>
			<td rowspan="2">MicroDuits</td>
			<td rowspan="2">MPA-col1/FN</td>
			<td>Micropost dimensions:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td>
			<td>&#216;= 6.4 &#181;m, l=18.2 &#181;m; grid=&#160;13 &#181;m, kcorr= 2.87 nN/&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100.983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27815</td>
			<td>Coomassie blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol ACS p.A.</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>WillCo Wells BV</td>
			<td>GWSb-3522</td>
			<td>35 mm diameter, aperture 22&#160;mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-100 Eclipse</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3-L3</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Camera controler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS Fi2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Il vantaggio principale della tecnica descritto risiede nella sua semplicità e potenziale di integrazione rapida ed efficace nel lavoro di laboratorio di routine. La combinazione di array di sensori commerciali di alta qualità abbinati a software open source fornisce informazioni sulla sensibilità meccano che altrimenti richiede l&#39;accesso ai servizi camera bianca e una conoscenza approfondita di analisi di immagine e di sviluppo del software. La Figura 1 illustra il flusso di lav...

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K Views.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Studiare Traiettorie cellulare Rolling Patterns Receptor asimmetrica

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Ricerca

Bioingegneria

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., global gene expression, cell division) encountered within living cells. However, such systems, used in conventional macro-scale bulk reactors, often fail to exhibit the dynamic behaviors and efficiencies characteristic of their living micro-scale counterparts. Understanding the impact of internal cell structure and scale on reaction dynamics is crucial to understanding complex gene networks. Here we report a microfabricated device that confines cell-free reactions in cellular scale volumes while allowing flexible characterization of the enclosed molecular system. This multilayered poly(dimethylsiloxane) (PDMS) device contains femtoliter-scale reaction chambers on an elastomeric membrane which can be actuated (open and closed). When actuated, the chambers confine Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) reactions expressing a fluorescent protein, allowing for the visualization of the reaction kinetics over time using time-lapse fluorescent microscopy. Here we demonstrate how this device may be used to measure the noise structure of CFPS reactions in a manner that is directly analogous to those used to characterize cellular systems, thereby enabling the use of noise biology techniques used in cellular systems to characterize CFPS gene circuits and their interactions with the cell-free environment.

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Array sigillabile Femtoliter camera di Biologia gratis-Cell

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

Microfluidica di interfacciamento con microelettrodi per studiare comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput electrophysiological approaches for hiPSC-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparations is much needed for efficient drug testing. Although multielectrode arrays (MEAs) are frequently employed for field potential measurements of excitable cells, a recent publication by Joshi-Mukherjee and colleagues described and validated its application for recurrent action potential (AP) recordings from the same hiPSC-CM preparation over days. The aim here is to provide detailed step-by-step methods for seeding CMs and for measuring AP waveforms via electroporation with high precision and a temporal resolution of 1 &#181;s. This approach addresses the lack of easy-to-use methodology to gain intracellular access for high-throughput AP measurements for reliable electrophysiological investigations. A detailed work flow and methods for plating of hiPSC-CMs on multiwell MEA plates are discussed emphasizing critical steps wherever relevant. In addition, a custom-built MATLAB script for rapid data handling, extraction and analysis is reported for comprehensive investigation of the waveform analysis to quantify subtle differences in morphology for various AP duration parameters implicated in arrhythmia and cardiotoxicity.

This article contains a set of protocols for the development of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) networks cultured on multiwell MEA plates to reversibly electroporate the cell membrane for action potential measurements. High-throughput recordings are obtained from the same cell sites repeatedly over days.

Reti di cardiomiociti derivati da umani da iPSC su array di microelettrodi multiwell per registrazioni di potenziali azioni ricorrenti

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural underpinnings of brain disease and injury. As electrodes are miniaturized to the scale of individual cells, a corresponding rise in the interface impedance limits the quality of recorded signals. Additionally, conventional electrode materials are stiff, resulting in a significant mechanical mismatch between the electrode and the surrounding brain tissue, which elicits an inflammatory response that eventually leads to a degradation of the device performance. To address these challenges, we have developed a process to fabricate flexible microelectrodes based on Ti3C2 MXene, a recently discovered nanomaterial that possesses remarkably high volumetric capacitance, electrical conductivity, surface functionality, and processability in aqueous dispersions. Flexible arrays of Ti3C2 MXene microelectrodes have remarkably low impedance due to the high conductivity and high specific surface area of the Ti3C2 MXene films, and they have proven to be exquisitely sensitive for recording neuronal activity. In this protocol, we describe a novel method for micropatterning Ti3C2 MXene into microelectrode arrays on flexible polymeric substrates and outline their use for in vivo micro-electrocorticography recording. This method can easily be extended to create MXene electrode arrays of arbitrary size or geometry for a range of other applications in bioelectronics and it can also be adapted for use with other conductive inks besides Ti3C2 MXene. This protocol enables simple and scalable fabrication of microelectrodes from solution-based conductive inks, and specifically allows harnessing the unique properties of hydrophilic Ti3C2 MXene to overcome many of the barriers that have long hindered the widespread adoption of carbon-based nanomaterials for high-fidelity neural microelectrodes.

Fabrication of Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays for In Vivo Neural Recording

We describe here a method for fabricating Ti3C2 MXene microelectrode arrays and utilizing them for in vivo neural recording.

Fabbricazione di array di microelettrodi Ti3C2 MXene per la registrazione neurale In Vivo

Implantable microelectrode technologies have been widely used to elucidate neural dynamics at the microscale to gain a deeper understanding of the neural ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...