Name: ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
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Ringraziamo Laurent Limozin, Pierre Dillard e Astrid Wahl per continuare discussioni fruttuose su applicazioni cellulari. Ringraziamo anche Frederic Bedu dalla struttura camera bianca PLANETE per il suo aiuto con le osservazioni SEM. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Consiglio europeo della ricerca tramite concessione n ° 307.104 FP / 2007-2013 / ERC.

1. pulizia del vetro Cover-diapositive e di osservazione Chambers <ol><li> Disporre il vetro di copertura-scorre su un vassoio multi-slide in materiale inerte, come politetrafluoroetilene (PTFE). </li><li> Immergere il vassoio con scivoli e la camera di osservazione in una soluzione di tensioattivo (qualsiasi prodotto consigliato per pulizia cuvette di quarzo è adatto). </li><li> Utilizzando un bagno ad ultrasuoni, ultra-sonicato nella soluzione di tensioattivo per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Lavare 5 volte con acqua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0.059 mS / cm). </li><li> Ultra-ultrasuoni in soluzione di tensioattivo per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare 10 volte con acqua ultrapura. </li><li> Ripetere i punti 1.5 e 1.6 due volte. </li><li> Conservare in acqua a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C) per un massimo di una settimana. </li></ol> 2. Realizzazione di proteine ​​Nano-punti <ol><li> Deposizione di perline <ol><li> Deposit la sospensione di perline di silice (2% v / v, 70 mL) goccia a goccia su un coperchio-slitta (24 x 24 mm, spessore 170 um) tenuti con un&#39;inclinazione di 15 gradi. </li><li> Lasciate che la sospensione si sviluppa per circa 1 minuto, mentre sfogliando il vetro di 90 ° ogni 15 s. </li><li> Che il liquido evapori in condizioni ambiente. </li><li> Conservare in un bicchiere pulito o camera PTFE in condizioni ambiente per un massimo di 2 giorni. </li></ol></li><li> Deposizione di alluminio <ol><li> Porre i vetrini (preparati in sezione 2.1) all&#39;interno una frequenza radio (RF) magnetron sputtering attrezzature 8, su una tavola rotante ad una distanza di circa 105 mm dal in alluminio (99%): silicio (1%) porta. </li><li> Pump down della camera di deposizione a 2,6 x 10 -4 Pa utilizzando una pompa turbomolecolare. Questo passaggio è importante per la rimozione di eventuali impurezze gassose. </li><li> Introdurre pura atmosfera di Argon (5N, 99,999%) con un flusso di 10 sccm a una pressione di 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; NOTA: L&#39;argon flusso in ingresso è controllato da un controllore di flusso di massa e la pressione di processo è controllata mediante un manometro. Il flusso di gas argon è continua ed è controllato da un equilibrio tra l&#39;ingresso e l&#39;apertura delle valvole di uscita. </li><li> Accendere il generatore di potenza RF. NOTA: Qui, è stata utilizzata una gamma tipica di 400-600 W di potenza a radiofrequenza a frequenza 13,56 MHz. Il generatore RF viene utilizzato con una rete di adattamento in una modalità di accoppiamento capacitivo plasma. La potenza riflessa è monitorata e minimizzata utilizzando l&#39;adattamento rete. </li><li> Dopo il plasma è stabilizzato, sputter per 2 min mantenere l&#39;otturatore chiuso per rimuovere eventuali impurezze dalla superficie del bersaglio. </li><li> Aprire l&#39;otturatore e consentire lo sputtering proseguire per 60 min per depositare alluminio sul vetrino ad uno spessore di 200 nm. </li><li> Tagliare il flusso di argon, chiudere la valvola a saracinesca per isolare la pompa turbomolecolare dalla camera di deposizione e sfiatare la camera con pulito nitrogen per ottenere la pressione ambiente. Recuperare i vetrini rivestiti di alluminio. Conservare fino a un mese in una scatola di vetro o PTFE pulito e chiuso ermeticamente in condizioni ambientali. </li></ol></li><li> deposizione a vapore di organosilano <ol><li> Immergere il vetrino rivestito di alluminio-preparata nella fase 2.2.6 in acqua ultrapura a temperatura ambiente e ultra-ultrasuoni per 30 s in bagno ad ultrasuoni (50 W, 50/60 Hz, tra 20 e 30 ° C). </li><li> Deposito 0,5 mL di (3-amminopropil) -triethoxysilane (APTES) al fondo di un essiccatore. ATTENZIONE: APTES è un organosilano, che evapora facilmente ed è tossico. APTES devono essere trattati solo sotto un flusso cappuccio e con i guanti. </li><li> Mettere i vetrini (preparati in 2.3.1) su una griglia ceramica e posto all&#39;interno essiccatore. </li><li> Collegare l&#39;essiccatore ad una pompa a membrana e funzionare alla massima potenza per 30 min per generare un basso vuoto. </li><li> Chiudere la valvola di essiccatore e spegnere la pompa. </li><li> Scaldare l&#39;essiccatorea circa 50 ° C per 1 h. </li><li> Aprire un essiccatore e raccogliere le diapositive. </li><li> Trasferimento ad un altro essiccatore pulito per memorizzare fino a 48 ore a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C). </li></ol></li><li> Deposizione di primo strato di proteine ​​- sieroalbumina bovina marcata con biotina (BSA-biotina) <ol><li> Mettere uno dei vetrini preparati nella sezione 2.3 su un supporto in PTFE. </li><li> Cassetta 1 ml di 25 mg / ml BSA-biotina sciolti in tampone fosfato isotonico (PBS). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (da 20 a 30 ° C). </li><li> Risciacquare 10 volte con PBS. Conservare il campione fino a 24 ore a 4 ° C al riparo dalla sorgente luminosa. </li></ol></li><li> Rimozione di maschera in alluminio <ol><li> Incubare i vetrini in una soluzione di NaOH in PBS (preparato da gocce di NaOH 1 M e circa 100 ml di PBS per ottenere pH≈12) durante la notte a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). ATTENZIONE. NaOH è corrosivo e deve essere maneggiato con i guanti. </li><li> Sciacquare10 volte in acqua ultrapura. </li></ol></li></ol> 3. Deposizione di supportati doppio strato lipidico (SLB) <ol><li> Pulizia della depressione Langmuir <ol><li> Rimuovere l&#39;acqua nel contenitore PTFE del trogolo Langmuir utilizzando una pompa. </li><li> Pulito con un panno monouso non tessuto privo di lanugine imbevuto di cloroformio. ATTENZIONE. Il cloroformio è tossico e deve essere manipolato in un&#39;area ben ventilata, con una maschera (o sotto flusso-cappa) e con i guanti appropriati. </li><li> Pulite 4 volte con acqua ultrapura tiepida (40 a 50 ° C). </li><li> Pulire almeno 6 volte con acqua ultrapura fredda. </li></ol></li><li> Deposizione del primo strato lipidico <ol><li> Posizionare i vassoi di PTFE nel recinto PTFE del trogolo Langmuir e poi riempirlo con acqua ultrapura. </li><li> Utilizzare il software di controllo dell&#39;apparato Langmuir per impostare la pressione misurata a 0 mN / m. </li><li> Utilizzare una siringa di vetro a tenuta di gas / metallo di depositare 30 microlitri di una / soluzione lipidica mL 1 mg (1, 2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) in cloroformio) sulla superficie dell&#39;acqua. Il cloroformio evaporare e le molecole lipidiche spontaneamente formano un monostrato. </li><li> Utilizzare il software di controllo per comprimere il monostrato lipidico chiudendo la barriera PTFE fino alla pressione desiderata (27 mN / m per DOPC) viene raggiunto. </li><li> Utilizzare il software di controllo di immergere il vetrino preparato in sezione 2.5.2 nel contenitore di PTFE utilizzando un morsetto motorizzato. </li><li> Tenere il vetrino, nel morsetto, perpendicolare all&#39;interfaccia aria-acqua. Utilizzare il software di controllo di aumentare lentamente (15 mm / min) attraverso l&#39;interfaccia, mantenendo costante la pressione a 27 mN / m. </li><li> Posto in un ambiente secco sia per uso immediato o per la conservazione fino a 24 ore a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li></ol></li><li> Deposizione del secondo strato lipidico <ol><li> Mantenere la pressione superficiale nel trogolo Langmuir al valore desiderato di 27 mN / m. Comprimere utilizzando ilsoftware di controllo del dispositivo e / o Langmuir aggiungere una piccola quantità di lipidi per ottenere la pressione desiderata. </li><li> Porre i vetrini trasportano il monostrato lipidico, preparato in sezione 3.2.6, orizzontalmente sulla superficie dell&#39;acqua. Assicurarsi che ciascuna slitta galleggia sopra un vassoio PTFE. </li><li> Spingere i vetrini giù, una diapositiva alla volta, nel suo vassoio di PTFE corrispondente con PTFE o metallo pinzette tale che sono immersi in acqua. Evitare di inclinare le diapositive mentre si spinge. </li><li> Utilizzare PTFE o metallo pinzetta per trasferire i vassoi di PTFE contenenti i vetrini in un cristallizzatore riempito con acqua ultrapura assicurandosi che i vetrini non sono esposti all&#39;aria. </li><li> Utilizzare PTFE o metallo pinzette per trasferire, mentre lavora sott&#39;acqua, un doppio strato rivestito vetrino in una camera di osservazione. NOTA: La camera di osservazione è posto sotto acqua all&#39;interno del cristallizzatore. La camera di osservazione è personalizzato e costituito da un anello in PTFE con una guarnizione in gommaintelaiature d&#39;acciaio d, che possono essere assemblati subacqueo per fare una camera stagna la cui superficie inferiore è realizzato dal vetrino precedentemente rivestito con il doppio strato lipidico. </li><li> Chiudere la camera pur continuando a lavorare sott&#39;acqua e assicurando che circa 1 mL di acqua è intrappolato all&#39;interno della camera. </li><li> Prendere la camera assemblato fuori dall&#39;acqua. Assicurarsi che è libero a tenuta d&#39;acqua e perdite. </li><li> Sostituire i 1 ml di acqua ultrapura presente nella camera di osservazione con PBS aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte. Assicurarsi che la camera non è mai priva di liquido. </li></ol></li><li> SLB passo blocco <ol><li> Introdurre 100 ug / ml di albumina di siero bovino (BSA) nella camera di osservazione contenente il vetrino preparato in sezione 3.3.6 e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare bistrato rimuovendo e aggiungendo 500 pl di PBS per 10 volte. Il doppio strato può essere mantenuta 24 ore a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Funzionalizzazione con ligandi <ol><li> Aggiungere fluorescente o neutravidina non fluorescente (VPN, una versione deglicosilata di avidina non caricata a pH 7) a 2 ug / ml nella camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2 per 30 min a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS per 10 volte. </li><li> Aggiungere biotinilato anti-CD3 a 2 ug / mL alla camera contenente il vetrino preparato in sezione 3.4.2. Per doppia funzionalizzazione della SLB e puntini, aggiungere Fc-ICAM1 His-tag a 5 mg / ml (qui, il doppio strato è fatto di DOPC + 1% di acido nitrilotriacetico NTA) lipidi (). Lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente (tra 20 e 30 ° C). </li><li> Risciacquare aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri di PBS 10 volte </li><li> Sostituire la PBS con mezzo di cella (PBS + 0,1% BSA) aggiungendo e rimuovendo 500 microlitri del mezzo cellulare 10 volte. </li><li> Lasciare 200 ml di media cella nel Chamber con la slitta. </li><li> Posizionare la camera per 10 min a 37 ° C prima di aggiungere le cellule. </li></ol> 5. cellulare Deposizione (rinvio 7 per i dettagli) <ol><li> depositare accuratamente 400 microlitri della sospensione cellulare nella camera. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C. </li><li> Fissare la cella con il 2% di paraformaldeide (PFA) per 15 min a 37 ° C. Sostituire il PFA con PBS mediante rimozione ripetuta e l&#39;aggiunta di 500 ml di PBS. </li></ol> 6. osservazione <ol><li> Proteo-lipidico Nano-modello e la fluidità SLB <ol><li> Utilizzare un microscopio a fluorescenza per l&#39;immagine del profilo proteico in modalità epi-fluorescenza utilizzando appropriata lunghezza d&#39;onda di illuminazione (639 nm) e cubi filtro (p.es. qui, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688). NOTA: L&#39;intensità del segnale può essere quantificata per stimare la quantità di proteine ​​dentro e fuori il punto. Utilizzare opportuna lunghezza d&#39;onda di illuminazione (330 nm) ed fcubo ilter all&#39;immagine bistrato (BP 365/12, FT 395, LP 397), che appare luminoso con fori scuri. </li><li> Usare la tecnica continua fotobleaching (CPB) 13, 15 per misurare la costante diffusione dei lipidi traccianti nel doppio strato. Questa osservazione è preferibilmente realizzato subito dopo la deposizione SLB. NOTA: Al fine di quantificare la costante di diffusione, due parametri sono misurati durante CPB processo: il tempo sbianca specifica del colorante (teso) e la lunghezza di caduta del profilo fluorescente dell&#39;alone formata intorno alla zona sbiancato (TAUD). Il primo è ottenuto tracciando l&#39;evoluzione temporale della fluorescenza al centro del campo illuminato durante il processo di CPB. La seconda è ottenuta tracciando il profilo di intensità ai margini della zona illuminata (media su 12 linee e 5 immagini dopo il raggiungimento dello stato stazionario). Le curve sono montati avere tesa e TAUD. La costante diffusione è dato da tauD 2 / teso (D = <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi critiche nel protocollo sopra descritto sono legati alla formazione della proteina nano-punti o back-riempimento dello spazio intorno ai punti da un bistrato lipidico supportato. Il primo passo critico rispetto alle proteine ​​nano-dots è la preparazione del cordone maschera. La pulizia del coperchio-scivolo è critica. I vetrini devono essere sia pulito con una soluzione detergente che è raccomandato per pulizia cuvette di quarzo, o con plasma di ossigeno. Altre tecniche di pulizia come immersione in etan...

<html> L&#39;adesione cellulare avviene attraverso le molecole di adesione cellulare specializzati (CAM), proteine ​​presenti sulla membrana cellulare che sono in grado di legarsi a loro controparte sulla matrice extracellulare o su un&#39;altra cella. Su cellule aderite, la maggior parte delle molecole di adesione tra cui l&#39;integrina onnipresente e caderina, si trovano in forma di cluster 1. L&#39;interazione dei linfociti T (cellule T) con cellule presentanti l&#39;antigene (APC) fornisce un&#39;illustrazione particolarmente sorprendente l&#39;importanza dei cluster recettori formata all&#39;interfaccia tra le due cellule - spesso chiamata sinapsi immunologica. Su formare il primo contatto con i recettori delle cellule APC, T (TCR) sulla superficie dei cluster scala forma cella micron T che servono come segnalazione piattaforme 2, 3, 4, e sono eventualmente centralizzati per formare un cluster centrale supramolecolare grande (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Recentemente, è stato dimostrato che sul lato APC, i ligandi del TCR sono raggruppati 8. Nel contesto di interazione cellule T-APC, l&#39;impiego di sistemi ibridi, in cui l&#39;APC viene imitato da una superficie artificiale funzionalizzata con proteine di interesse, ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dell&#39;interfaccia sinaptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . In questo contesto, è di grande rilevanza per la progettazione di superfici mimetiche APC che catturano uno o più aspetti della cellula bersaglio. Ad esempio, se ligandi sono innestate su bistrati lipidici supportati, possono diffondere nel piano del doppio strato, mimare la situazione sulla superficie APC e allo stesso tempo consentire la formazione dellacSMAC 6, 7. Analogamente, i cluster sulla APC sono stati imitato creando isole di ligandi in un mare di polimeri 9, 10, 11, 12, 13, 14. Tuttavia, queste due caratteristiche finora non sono stati combinati. Qui si descrive una tecnica innovativa per creare nano-dots di anti-CD3 (un anticorpo che bersaglia il complesso TCR) circondato da un doppio strato lipidico con i lipidi diffondenti. Il doppio strato viene depositato mediante Langmuir-Blodgett / tecnica Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 e, se desiderato, potrebbe essere funzionalizzato con una proteina specifica - per esempio, il legante di integrina cellule T (chiamato ICAM1). Inoltre, gli anti-CD3 punti proteina could essere sostituito con un altro anticorpo o CAM. Mentre abbiamo scelto le proteine ​​per uso futuro come piattaforma per gli studi di adesione cellulare T, la strategia dettagliato qui può essere adattato per qualsiasi proteina e persino il DNA.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

Attualmente v&#39;è un notevole interesse per la creazione di array ordinati di isole di proteine ​​adesive in un mare di superficie passivata per gli studi di biologia cellulare. Negli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che le cellule viventi rispondono, non solo per la natura biochimica delle molecole presentati a loro, ma anche per il modo in cui queste molecole sono presentati. Creazione di proteine ​​micro-modelli è quindi ora di serie in molti laboratori di biologia; nano-modelli sono anche più accessibile. Tuttavia, nel contesto delle interazioni cellula-cellula, non v&#39;è la necessità di modello non solo proteine, ma anche doppi strati lipidici. Tale doppia patterning proteo-lipidica, non è stato finora facilmente accessibile. Offriamo una tecnica facile per creare proteine ​​nano-dots supportati su vetro e proporre un metodo per riempire lo spazio tra punti con un doppio strato lipidico supportato (SLB). Da fotometabolismo di tracciante lipidi fluorescenti incluse nel SLB, dimostriamo che il doppio strato presenta una considerevole in-plfluidità ane. Funzionalizzazione i puntini della proteina con gruppi fluorescenti ci permette di immagini di loro e per dimostrare che sono ordinate in modo regolare reticolo esagonale. La dimensione tipica punto è circa 800 nm e la spaziatura dimostrato qui è 2 micron. Questi substrati sono attesi per servire piattaforme utili per l&#39;adesione cellulare, la migrazione e studi meccano-sensing.

Le immagini di fluorescenza sono stati analizzati per misurare la distanza e la dimensione dei puntini. Spaziatura tipico è risultato essere 1.900 ± 80 nm e tipico dot-size era 600 ± 100 nm (Figura 1g). La spaziatura viene impostato dalla dimensione dei granuli utilizzati per la maschera. Dot-dimensioni è impostato dal tallone-size e condizioni di deposizione. La SLB è depositato unicamente attorno ai punti proteine e non sulla loro (figura 2), con ...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K Views.  CNRS, UMR 7325, CINaM.  Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione. 

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Ricerca

Biochimica

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Chimica

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioingegneria

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

Auto-assemblaggio di membrane lipidiche ibride drogate con molecole organiche idrofobiche presso l'interfaccia acqua/aria

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Patterning proteico reversibile controllato dalla luce su membrane lipidiche

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Autore in primo piano: Reclutamento di proteine commutabili con foto per il patterning reversibile nei sistemi cellulari artificiali

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Riepilogo

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Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Auto-assemblaggio di membrane lipidiche ibride drogate con molecole organiche idrofobiche presso l'interfaccia acqua/aria

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

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Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

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Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Formazione automatizzato doppio strato lipidico della membrana Utilizzando un Polidimetilsilossano Thin Film

Auto-assemblaggio di membrane lipidiche ibride drogate con molecole organiche idrofobiche presso l'interfaccia acqua/aria

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine interagenti con microscopia elettronica a trasmissione