Name: high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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Gli autori desiderano ringraziare Karsta Luettich e Grégory Vuillaume per la loro revisione del manoscritto.

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Tutti gli autori sono dipendenti di Philip Morris International. Philip Morris International è l&#39;unica fonte di finanziamento e sponsor di questo progetto.

Il fabbisogno di alternative alla sperimentazione animale e per i nuovi metodi di analisi ad alto rendimento sono stati ampiamente discussi nel corso degli ultimi anni. Questo ha portato gli scienziati e le autorità di regolamentazione per studiare metodi alternativi per i test di tossicità di serie, utilizzando saggi cellulari che simulano da vicino la fisiologia dei tessuti bersaglio. In questo studio, abbiamo dimostrato l&#39;applicabilità di combinare un analizzatore di cellule in tempo reale (RTCA) con una piattaforma alta schermatura contenuto (HCS) per valutare l&#39;impatto dell&#39;esposizione a singoli costituenti CS sulle cellule epiteliali del polmone umano. Questa configurazione potrebbe essere analogamente applicata per valutare la citotossicità indotta da vari altri inquinanti atmosferici, particelle sospese nell&#39;aria, e nanoparticelle. Inoltre, i risultati ottenuti possono essere abbinati con quelli di trascrittomica intero genoma e metodi di calcolo basati su reti biologiche causali. Come riportato in precedenza, questo approccio ci ha permesso di corroborare i dati sul percorso molecolareperturbazione in seguito all&#39;esposizione CS 5 con punti finali HCS, affrontare queste perturbazioni pathway anche fenotipicamente. Come un saggio di diagramma di flusso, analisi delle cellule in tempo reale fornisce informazioni relative redditività a cellule in una risoluzione dose e dipendente dal tempo, che permette di migliorare il processo decisionale che la dose e il punto di tempo di esposizione possono essere favorevoli per l&#39;analisi a valle 14. Il principio dell&#39;analizzatore si basa sulle variazioni di impedenza elettrica generata dalle celle come si attaccano e diffusione su una superficie di coltura ben coperto con un microelettrodo oro. L&#39;impedenza viene convertito in un parametro adimensionale chiamato cella-index, che può essere utilizzato per monitorare l&#39;adesione cellulare, diffusione, morfologia e infine vitalità cellulare. Sebbene questa tecnica non fornisce informazioni sui meccanismi citotossici, la sua sensibilità permette di rilevare cambiamenti morfologici cellulari anche a dosi molto basse in cui il HCS non è informativo (dati non mostrati). Sulla base di previesperimenti OU, abbiamo notato che la metodologia RTCA è in grado di rilevare i cambiamenti morfologici a dosi inferiori rispetto agli endpoint HCS. A seguito di screening iniziale con l&#39;analizzatore di cellule in tempo reale, una piattaforma HCS è stato utilizzato per ottenere informazioni più approfondite sul tipo di citotossicità suscitato da ogni HPHC. Il pannello di test HCS permesso al profilo HPHCs verso il loro potenziale impatto sulla compartimenti cellulari / organelli, nonché per identificare quelli scatenanti la genotossicità o stress ossidativo. L&#39;analisi ha rivelato i profili distinti per cui i HPHCs selezionati inducono citotossicità in cellule NHBE. In generale, tutti i composti, tranne fenolo, sono stati trovati per indurre necrosi alle dosi più alte testate. In accordo con un ruolo potenziale nello sviluppo del cancro 1-aminonaphtalene fosforilazione indotta di H2AX come marker per la genotossicità, però il pannello HCS anche l&#39;attività scoperta di questo HPHC nella lettura tossicità mitocondriale (massa aumentata e citocromo C ReleaSE) e lo stress ossidativo (GSH esaurimento). Allo stesso modo, come precedentemente descritto, fenolo è stato identificato per indurre disfunzione mitocondriale e causare danni al DNA e deplezione di GSH. Il cromo (VI), uno dei composti classificati come cancerogeni di gruppo I, e Crotonaldehyde sono stati anche identificati come sia genotossico, in particolare cromo (VI) l&#39;apoptosi indotta anche (attivazione a cascata caspasi) e Crotonaldehyde causato aumentata produzione di ROS. Infine arsenico (V), è stato trovato per indurre cJun fosforilazione, che è un marker di attivazione della via dello stress chinasi. In questo studio, abbiamo utilizzato le cellule NHBE come modello per le cellule epiteliali polmonari in vitro. Utilizzando queste cellule in un ambiente HCS è senza precedenti e ha permesso l&#39;indagine di una più ampia gamma di endpoint, inclusi gli indicatori di genotossicità e lo stress ossidativo. Sia cellule vive e approcci di colorazione delle cellule fissi sono stati descritti nei nostri protocolli, che dimostra la flessibilità della tecnica complessiva. in fatto, gli stessi protocolli può essere applicato ad un&#39;ampia gamma di obiettivi, che può essere affrontato mediante l&#39;uso di qualsiasi colorante fluorescente o anticorpi. Per il buon esito dei protocolli di colorazione vivi, è importante rispettare il tempo di incubazione, come alcuni dei coloranti hanno una limitata emivita e il segnale di fluorescenza può diminuire prima dell&#39;acquisizione dell&#39;immagine è completata. E &#39;anche importante considerare che se viene usato un tipo cella diversa, tutte le condizioni colorante deve essere rivalutati, come la concentrazione ottimale di colorante e il tempo di incubazione possono essere diverse. Nella carta corrente abbiamo descritto uno scenario in cui solo cinque composti in cui vagliati con la metodologia HCS. Considerando il layout di piastra precedentemente descritto, sono stati dosati oltre 2 diversi set piastre per un totale di 24 piastre (6 saggi e 2 punti temporali) .Il numero delle piastre potrebbe anche essere aumentata, consentendo per lo screening simultaneo di più composti o gli invesdell&#39;inchiesta di più endpoint. Prima di ciò, tuttavia, si dovrebbe prendere in considerazione che taluni punti finali (GSH e ROS) richiedono immediata acquisizione, e di conseguenza, il dosaggio delle piastre devono essere eseguite in maniera sfalsata per permettere l&#39;acquisizione del piatto precedente. D&#39;altra parte, utilizzando un protocollo di colorazione cellulare fissa rappresenta un vantaggio in quanto le piastre possono essere impilati, interrompendo il protocollo in qualsiasi fase dopo la fissazione, per il completamento della procedura di colorazione in una fase successiva. Questo approccio, per esempio, potrebbe fornire all&#39;operatore il tempo per completare tutte le piastre di marcatura cellulare vivi senza compromettere la qualità dei dati. Per ottimizzare ulteriormente il flusso di lavoro riducendo il numero di piastre, sarebbe anche possibile multiplare più endpoint insieme. Ad esempio in questo contesto danni del DNA e lo stress chinasi potrebbe essere indagato insieme semplicemente utilizzando due anticorpo secondario con fluorocromi che emettono in diversi channels. Il continuo sviluppo della piattaforma HCS, compresi semina completamente automatizzato cellule, diluizione composto, dosaggio e colorazione, così come l&#39;aggiunta di nuovi endpoint si espanderà ulteriormente la capacità della piattaforma HCS come un potente strumento di profilatura per HPHCs su epiteliale e altri tipi cellulari .

Valutazione del rischio tossicologico ha storicamente fatto affidamento su l&#39;uso di modelli animali che, pur fondamentale nelle scienze della vita, sono anche collegati con carenze come traducibilità incoerente per l&#39;uomo e costo elevato. Inoltre, vi è stato uno sforzo crescente per trovare alternative alla sperimentazione animale nello spirito di &quot;The 3R&quot; 2 (sostituzione, riduzione e affinamento). Questo sforzo è stato accelerato nel corso degli ultimi anni, non solo a causa dei recenti progressi, come le tecniche high-throughput e approcci biologia dei sistemi, ma anche a causa della legislazione limitare l&#39;impiego di sperimentazione animale, in particolare nell&#39;Unione europea. La complessità dei percorsi di segnalazione cellulare che regolano la risposta agli insulti tossici rende evidente che utilizzando singoli parametri tossicologici non sarà sufficiente a descrivere la base tossicologica di alcuni composti. Per questo, l&#39;interazione tra centinaia di interazione pdovranno anche essere presi in considerazione roteins che contribuiscono a una rete biologica. Per studiare l&#39;effetto dei tossici su tali reti, un approccio di sistema tossicologia combinato con medio fenotipici e saggi di screening ad elevata capacità è utile per inferire potenze e allo stesso tempo fornire ulteriori informazioni sul meccanismo di azione delle singole sostanze tossiche. In questo studio, abbiamo impiegato HCS come un potente strumento di screening, che si compone di un microscopio automatico e un&#39;applicazione software biologica, che può acquisire, elaborare e analizzare i dati di immagine ottenuti da specifiche analisi cellulari basate sulla fluorescenza. Questo permette di cambiamenti visivi all&#39;interno di una cella da quantificare, in una singola cella o livello subcellulare, e molti parametri da analizzare simultaneamente. 3, ad esempio, il DNA rotture del doppio filamento sono stati valutati utilizzando un documento d&#39;identità a base di anticorpi dell&#39;istone H2AX fosforilazione e specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) sono stati quantificati utilizzando una cella-permsuperossido eable colorante sensibile. Poiché le cellule epiteliali polmonari rappresentano la prima barriera biologica contro sostanze tossiche inalate, tra cui il fumo di sigaretta, abbiamo utilizzato cellule epiteliali bronchiali primarie come un modello in vitro al profilo l&#39;effetto di HPHCs pubblicati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration. 4 Questo manoscritto è un follow -up su uno studio precedente 5 in cui abbiamo valutato l&#39;impatto biologico di un diverso sottoinsieme di HPHCs. Come parte del nostro flusso di lavoro per valutare la citotossicità in vitro, inizialmente abbiamo valutato le potenze di una selezione di 15 HPHC di, con un tempo reale analisi cellulare impedenza basato sul sistema (RTCA) che ci ha permesso di stabilire la dose-range, adatto per la successiva HCS analisi (Figura 1). Una valutazione tossicologica HCS è stata poi condotta utilizzando nove punti finali multi-parametriche di tossicità cellulare, ogni effettuato a due punti di tempo (4 e 24 ore). I marcatori utilizzati erano indicativi di tossicità mitocondriale, danno al DNA, stress chinasi, specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), contenuto di glutatione (GSH), caspasi 3 - 7 attività, il rilascio del citocromo C e permeabilità della membrana cellulare, come descritto nella Tabella 1. Il nostro approccio abilitato identificazione e caratterizzazione dell&#39;effetto dei componenti del fumo di sigaretta attraverso campionamento dose e tempo dipendente. In definitiva, questo ha prodotto un profilo tossicologico in vitro per ogni HPHC. approcci multi-omiche possono anche essere utilizzati per integrare ulteriormente l&#39;analisi HCS. Ciò avrebbe finalmente anche fornire una più profonda comprensione degli effetti al segnalazione cellulare e / o livello trascrizionale.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&amp;nbsp; black&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)

Il fumo di sigaretta (CS) è un importante fattore di rischio per malattie cardiovascolari e polmonari. Perché CS è un aerosol complesso contenente più di 7.000 sostanze chimiche 1 è impegnativo per valutare i contributi delle singole componenti della sua tossicità generale. Profili tossicologici dei singoli costituenti, nonché le miscele possono essere comunque stabilita in vitro, mediante l&#39;applicazione di alto through-put strumenti di screening, che consentono la profilatura di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHCs) del fumo di tabacco, così come definito dalla Food and Drug statunitense Administration (FDA). 2 Per una valutazione iniziale, uno strumento impedenza-based è stato utilizzato per un tempo reale, la valutazione priva di etichetta di tossicità del composto. La lettura dello strumento si basa su adesione cellulare, la vitalità e la morfologia che tutti insieme forniscono una panoramica dello stato della cella. Un parametro adimensionale, chiamato index cella, viene utilizzato per la quantificazione. Un insieme di difprotocolli di colorazione di- stato sviluppato per un&#39;indagine basata su imaging di fluorescenza e una piattaforma di HCS è stato utilizzato per ottenere informazioni più approfondite sul tipo di citotossicità suscitato da ogni HPHC. Dei 15 componenti testati, sono stati selezionati solo cinque per l&#39;analisi HCS-based come hanno registrato una LD calcolabile 50 (&lt;20 mm). Questi hanno incluso 1-aminonaphtalene, arsenico (V), cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo. Sulla base del loro effetto nel HCS, 1-aminonaphtalene e fenolo potrebbero essere identificati per indurre disfunzione mitocondriale, e, insieme con cromo (VI) come genotossico sulla base della maggiore fosforilazione dell&#39;istone H2AX. Crotonaldehyde è stato identificato come un induttore di stress ossidativo e arsenico come un percorso attivatore di stress chinasi. Questo studio dimostra che una combinazione di tecnologie impedenza-based e HCS fornisce uno strumento robusto per la valutazione in vitro dei componenti CS.

RTCA Poiché gli endpoint HCS non sarà informativo quando non viene rilevato alcun effetto tossico, quei composti non mostrano diminuita vitalità cellulare fino alla più alta concentrazione nella RCTA non sono testati da HCS (Figura 3b, c, d, g, k, l, m , p). Composti mostravano un calo della vitalità cellulare al solo la più alta concentrazione (figura 3e, o) sono anche deselezionata per HCS. Infine, solo i componenti con LD computabile 50 (&lt;20 mM) sono selezionati per ulteriore analisi HCS (figura 3a, f, h, j, n). HPHCs che soddisfano i criteri di cui sopra sono: 1-aminonaphtalene, arsenico (V), cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo. HCS Come un controllo di qualità (QC), controlli positivi sono fiprima analizzato per assicurare che procedura di colorazione in modo corretto. Quadri rappresentativi di cellule di controllo trattate positivi sono mostrati in Figura 6. I valori di dati sono normalizzati a veicolo come descritto in precedenza. Nessun curve dose-risposta sono riportati in grafico solo tre dosi sono testati e non tutte le tre dosi sono considerate in ogni time-point. dosi dei controlli positivi sono selezionati (sulla base di esperimenti precedenti, dati non mostrati) in modo che le risposte adeguate sono osservati per ciascun endpoint sia a 4 ore e 24 ore. In particolare dosi 1 e 2 sono utilizzati per valutare l&#39;effetto a 4 ore mentre dosi 2 e 3 vengono utilizzati per valutare l&#39;effetto a 24 ore. Le piastre sono scartati se nessuna risposta si osserva per le dosi di controllo positivo. Si noti che per tutti gli endpoint, ad eccezione di potenziale di membrana mitocondriale e contenuto di GSH, si prevede un aumento della intensità del segnale. Tutti i composti, ad eccezione di fenolo, ha indotto un fenotipo necrotico<html> tipo, basata su una maggiore permeabilità della membrana cellulare (Figura 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo sono stati identificati come essere genotossico sulla base di una maggiore fosforilazione della H2AX istone (Figura 7e, j, n, p). Fenolo e 1-aminonaphtalene sono stati trovati a causare una grave disfunzione mitocondriale (Figura 7b, o) che, con 1-aminonaphtalene, ha portato ad un aumento del rilascio di citocromo C (Figura 7c). Rilevamento di una maggiore attività delle caspasi 3/7 fornito la prova di evento apoptotico in seguito all&#39;esposizione al cromo. Ossidativo induzione dello stress (ROS o GSH) è stata anche rilevata in seguito al trattamento con 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde e fenolo (Figura 7d, m, q). Infine, Arsenico induce lo stress cellulare come dimostrato dalla maggiore fosforilazione del fattore di trascrizione cJun (figura 7g). carico / 53.987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Composto Tox-Profiler flusso di lavoro. A) Schema del flusso di lavoro ha seguito in questo studio. In primo luogo, un risultato dose gamma è stata effettuata utilizzando la piattaforma RTCA per selezionare dosi appropriate per la successiva HCS per caratterizzare i profili di tossicità specifici composti. B) progettazione sperimentale dello studio. 24 ore dopo la semina, le cellule sono state dosate e valori di impedenza costantemente monitorata nel corso dei seguenti 24 ore, mentre gli endpoint HCS sono stati studiati 4 e 24 ore dopo la somministrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figura 2. RTCA Piastra di esposizione. Piatto principale composto in primo luogo è generato eseguendo un cinque fasi diluizione 1:10 di serie. Ogni composto,incluso il controllo del veicolo (dose 0) viene aggiunto in triplice copia alla piastra di esposizione insieme medio e staurosporina come controlli. Si noti che le dosi sequenza è mantenuta al momento del trasferimento, le dosi più alte sono in numero di riga 1 mentre comandi del veicolo sono in numero di riga 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentante RTCA della vitalità cellulare risultati. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropano, c) Acetamide, d) Acetone, e) acrilamide, f) Arsenico (V), g) Benzene, h) Cromo (VI) , j) Crotonaldehyde, k) Metiletilchetone, l) Nickel (II), m) nitrobenzene, n) fenolo, o) chinolina, p) Toluene. A 24 ore dopo la somministrazione, l&#39;area sotto la curva (AUC) è stata calcolata per ogni dose (incluso il controllo positivo e veicolo) e normalizzati in una gamma da 0 a -100 attività% (asse y), dove 0 riflette l&#39;attività di il veicolo e -100 del controllo positivo. I valori sono stati poi tracciati e montate con una equazione Hill quattro parametri e, quando possibile, DL 50 è stato calcolato. Le concentrazioni sono espresse su una scala logaritmica (asse x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figura 4. Schema di diluizione per il controllo positivo Composti per HCS Assays. A) Aggiunta di controlli positivi e vevei- alla diluizione di serie targa. b) la diluizione seriale dei controlli positivi. c) 200X controlli positivi dosi. de) diluizione dei controlli 200X dosi positivi nel medio (01:40) per generare la piastra di controllo positivo contenente le dosi 5x. Si noti che ogni dose viene diluito in triplicato per riflettere il layout finale nella piastra di esposizione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figura 5. HCS Piastra di esposizione. Piatto principale composto in primo luogo è generato effettuando una diluizione in cinque fasi. Ogni composto, compreso il controllo del veicolo (dose 0) viene aggiunto in triplice copia alla piastra di esposizione ei controlli positivi. Si noti che l&#39;ordine dosi viene mantenuto al momento del trasferimento,dosi più alte sono in numero di riga 1 mentre comandi del veicolo sono in numero di riga 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentante fluorescenti Foto di anticorpi o di Dye-macchiati Cells a) Parametri nucleari - colorante nucleare: un colorante. Permeabili, che si lega al DNA in cellule vive o fissi. Questa macchia è utilizzato per identificare le cellule singole etichettatura regione nucleare b) Necrosi - colorante permeabilità della membrana cellulare. Rilevamento Dye a base di integrità della membrana cellulare. Il reagente è intrinsecamente impermeabili alla membrana cellulare. Durante necrosi, la membrana diventa permeabile e il colorante entra nella cellula e si lega al DNA producendo una forte fluorescenza s. ignal c) L&#39;apoptosi - citocromo C: Individuazione di anticorpi a base del rilascio di citocromo C, un marchio di garanzia ben noto di apoptosi precoce. Su induzione di apoptosi, citocromo c viene rilasciato dai mitocondri e diffonde nel nucleo d) danno del DNA - pH2AX:.. Individuazione di anticorpi a base di fosforilazione dell&#39;istone H2AX, un marchio di garanzia ben noto di doppie rotture del DNA e) Lo stress chinasi - cJun:. individuazione di anticorpi a base di fosforilazione in Ser-73 di cJun, un marchio di garanzia ben noto di stress cellulare f) lo stress ossidativo - DHE: rilevazione Dye a base di radicali superossido. Dihydroethidium stessa fluorescente blu nel citoplasma mentre la forma ossidata etidio reagisce in rosso su DNA intercalazione g) GSH - mBcl:. Rilevamento basata Dye di molecole libere GSH. mBcl reagisce con GSH agenerare un prodotto altamente fluorescente h) apoptosi - caspasi 3/7 di attivazione:. rilevamento Dye a base di caspasi 3/7 attività. Il reagente è non fluorescente con un peptide di quattro amminico che inibisce il legame del DNA. Dopo l&#39;attivazione della caspasi-3/7, il peptide viene scisso consentire al colorante di legarsi a DNA e produrre un luminoso risposta fluorogenica. Pannelli BH mostrano cellule di controllo trattate positivi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figura 7. Rappresentante HCS Risultati. 1-aminonaphtalene (ae), arsenico (V) (F e G), cromo (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) e fenolo (OQ). 4 ore (linea blu) e24 hr segnali (linea arancione) sono stati calcolati per ogni dosi e normalizzati all&#39;attività veicolo (0%). I valori che non sono inclusi in curva calcoli di montaggio sono mostrati in grigio. Le concentrazioni sono espresse su una scala logaritmica (asse x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> saggio </td><td> Endpoint # </td><td> endpoint biologica </td><td> compartimento cellulare </td><td> funzione di uscita </td></tr><tr><td rowspan="4"> citotossicità </td><td> 1 </td><td> Massa mitocondriale 6 </td><td> Citoplasma </td><td> superficie media Spot </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Potenziale di membrana mitocondriale 6 </td><td> Citoplasma </td><td> intensità media Spot </td></tr><tr><td> 3 </td><td> rilascio del citocromo C <sup&gt; 7 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Permeabilità della membrana cellulare 8 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> I danni del DNA </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> Lo stress chinasi </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Nucleo </td><td> intensità media </td></tr><tr><td> contenuto di GSH </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Citoplasma </td><td> intensità media Spot </td></tr><tr><td> L&#39;apoptosi </td><td> 9 </td><td> Caspasi 3 13 </td><td> Citoplasma </td><td> intensità media Spot </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco delle HCS unssays ed endpoint. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Veicolo </td><td colspan="6" rowspan="2"> dosi RTCA (micron) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> dosi HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> La vitalità cellulare-selezionati (micron) </td><td> 3R4F (nm) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 280 micron </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropano </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetone </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> L&#39;acrilamide </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsenico (V) </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 160 micron </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Il cromo (VI) </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 20 micron </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> Crotonaldehyde </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 200 pM </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil etil chetone </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mm </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nichel </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenolo </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 2.300 micron </td><td> 5.000 </td><td> 2.000 </td><td> 1.000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> chinolina </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> toluene </td><td> acqua </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco dei composti HPHC testati con LD relativa 50 a 24 ore di trattamento. I composti selezionati per l&#39;analisi HCS sono evidenziate in arancio e dosi testate sono anche dato. La dose 3R4F è equivalente alla quantità di componente presente nel fumo di uno stick dalla 3R4F sigarette riferimento. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> saggio </td><td> Composto </td><td> Soluzione madre </td><td> Solvente </td&gt; <td colspan="3"> Dose (s) (micron) </td></tr><tr><td> La vitalità cellulare </td><td> staurosporine </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> citotossicità </td><td> valinomicina </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> I danni del DNA </td><td> Il paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Lo stress chinasi </td><td> anisomycin </td><td> 2 mm </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> contenuto di GSH </td><td> acido etacrinico </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1.000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L&#39;apoptosi </td><td> staurosporine </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Elenco dei controlli positivi e le concentrazioni usate per ogni test.

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High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

Alta Analisi Screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

12.1K Views.  Philip Morris International R&D. The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds. 

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Lo screening per Endocrine attività in acqua mediante disponibili in commercio<em&gt; In Vitro</em&gt; Transattivazione Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Ambiente

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificazione- e specie chimica di Polyfluorinated con un flusso di lavoro combinato mirati e Screening di mirati spettrometria di massa ad alta risoluzione

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Chimica

A High-Throughput Screening Approach for Evaluating the Binding Affinity of Environmental Pollutants to Nuclear Receptors

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite their high environmental occurrence, there is very limited information regarding their toxicological effects. It is urgent to develop high-throughput screening (HTS) methods to guide toxicological studies. In this study, a receptor-ligand binding assay using an HTS system was developed to determine the binding potency of environmental pollutants on nuclear receptors. The test is conducted using a microplate reader (i.e., a 96-well plate containing various chemicals) by measuring the fluorescence polarization (FP) of a specific fluorescent probe. This assay consists of four parts: the construction and transformation of recombinant vectors, the expression and purification of the receptor protein (ligand-binding domain), receptor-probe binding, and competitive binding of chemicals with the receptor. The binding potency of two environmental pollutants, perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) and triphenyl phosphate (TPHP), with peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR&#947;) was determined to illustrate the assay procedure. Finally, the advantages and disadvantages of this method and its potential applications were also discussed.

This protocol describes a high-throughput screening system that uses fluorescence polarization of a specific fluorescent probe binding to a nuclear receptor as a readout for screening environmental pollutants.

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Ricerca sul cancro

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Immunologia e infezioni

Valutazione dei cambiamenti di comportamento delle celle indotte da MOF mediante rilevamento del substrato della cella elettrica

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Autore in primo piano: Progressi nella valutazione della risposta delle cellule epiteliali polmonari umane alle strutture metallo-organiche 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Rilevamento elettrico cellula-substrato per la valutazione in tempo reale dei profili tossicologici della struttura metallo-organica

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Alta Analisi Screening contenuto di valutare gli effetti tossicologici di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHC)

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