This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

Preparazione 1. Esempio <ol><li> Purificazione di monomeri temperatura-sensibile <ol><li> Sciogliere 20 g di N -isopropylacrylamide (NIPA) in 100 mL di toluene. </li><li> Filtrare la soluzione sotto vuoto per eliminare la polvere. </li><li> Mescolare il filtrato con 500 ml di etere di petrolio. </li><li> Posizionare il recipiente di reazione in un bagno di ghiaccio-acqua. </li><li> Agitare la soluzione fino a quando i monomeri vengono precipitati (tipicamente 30 min). </li><li> Filtrare la soluzione sotto aspirazione per ottenere i monomeri precipitati. </li><li> Asciugare i monomeri a pressione ridotta (100 Pa) durante la notte. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione di polimero sensibile alla temperatura <ol><li> Degas 20 mL di acqua deionizzata per 1,0 minuti usando una pompa a membrana. </li><li> Sciogliere 780.8 mg di NIPA purificato in 9,5 ml di acqua degasata e deionizzata. </li><li> Posizionare il recipiente di reazione in un bagno di ghiaccio-acqua. </li><li> Proteggere la reazioneluce coprendo l&#39;apparecchiatura con un foglio di alluminio. </li><li> Mescolare delicatamente la soluzione per 10 minuti, mentre l&#39;introduzione di un moderato flusso di gas Ar delicatamente attraverso un puntale collegato alla bombola del gas con un tubo. </li><li> Aggiungere 11,9 ml di N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethylethylenediamine alla soluzione tramite una micropipetta. </li><li> Agitare la soluzione per 1.0 minuti, mentre l&#39;introduzione di gas Ar, come indicato nel punto 1.2.5. </li><li> Agitando il campione, sciogliere 4,0 mg di persolfato di ammonio in 0,5 mL di acqua degasata e deionizzata. </li><li> Mescolare la soluzione del campione (dal punto 1.2.7) e la soluzione di ammonio persolfato (dal punto 1.2.8). </li><li> Agitare la soluzione per 30 s, mentre l&#39;introduzione di gas Ar, come indicato nel punto 1.2.5. </li><li> Coprire la soluzione con un foglio di alluminio e conservarlo in frigorifero (4 ° C) per una notte. </li></ol></li><li> Preparazione di fissaggio degli esemplari <ol><li> Mettere 60 ml di soluzione del campione (dapasso 1.2.11) in una diapositiva cavità. </li><li> Coprire la soluzione con un vetro di copertura circolare. Non essere attenti a bolle d&#39;aria trappola. </li><li> Rimuovere la soluzione in eccesso utilizzando una micropipetta e di laboratorio salviette. </li><li> Sigillare il campione con la colla. Lasciare asciugare la colla a temperatura ambiente (tipicamente 6 h). </li><li> Preparare un altro vetrino pieno di lattice 0,1% in peso di polistirene (diametro delle particelle da 100 nm) sospensione seguendo i punti 1.3.1-1.3.4. Questa diapositiva viene utilizzato come standard. </li></ol></li></ol> Misura Size 2. particella con Dynamic Light Scattering microscopio <ol><li> Ottimizzazione dello strumento <ol><li> Posizionare il vetrino sospensione di polistirene (dal punto 1.3.5) sul palco del microscopio invertito. Il lato vetro di copertura deve essere rivolto verso il basso. </li><li> Inserire un ammortizzatore fascio davanti al rivelatore (un fotodiodo a valanga e un autocorrelatore). </li><li> Applicare un raggio laser (laser a stato solido, λ = 488 nm, 30 mW, continuaonda) per il campione attraverso una lente obiettivo (10 ×). Una parte della luce riflessa attraversa uno specchio lancio del microscopio ed è osservato da una telecamera CCD montata al porto lato del microscopio (Figura 1). </li><li> Regolare l&#39;altezza della lente obiettivo per impostare il punto focale per la sospensione di esempio spostando l&#39;altezza della lente obiettivo dalla posizione bassa a alta. Durante questa procedura, l&#39;immagine riflessa è focalizzata tre volte: alla superficie del vetro di copertura, all&#39;interfaccia tra il vetro di copertura e il campione, e all&#39;interfaccia tra il campione e il vetro hole-scivolo. Impostare il punto focale tra il secondo e il terzo punto. </li><li> Attenuare l&#39;intensità della luce dispersa cambiando la potenza del laser. </li><li> Introdurre la luce diffusa nel rivelatore rimuovendo la serranda fascio davanti al rivelatore. Questa unità misura la correlazione temporale delle intensità luminosa. </li><li> Impostare un foro stenopeico (φ = 50 micron) between il microscopio ed il rivelatore per ottenere l&#39;effetto confocale. Regolare la posizione del foro di spillo per massimizzare l&#39;intensità luminosa al rivelatore. </li><li> Misurare la funzione di correlazione tempo dell&#39;intensità della luce diffusa per 30 s avviando il funzionamento del correlatore tramite un computer. La funzione di correlazione misurata è spesso espressa come g (2) (t) - 1, dove t è il tempo di correlazione 4 e <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg" /> . Qui, I (t) è l&#39;intensità della luce diffusa al tempo t e (•••) T è il tempo di media. Il tempo di decadimento sarà di circa 0,1 ms. </li><li> Regolare il punto focale di ottenere una vasta gamma per l&#39;ampiezza iniziale della funzione di correlazione tempo (g (2) (t = 0) - 1). NOTA: L&#39;ampiezza iniziale è fortemente influenzata dalla quantità di luce riflessa. Spostando il punto focale trainoard l&#39;interfaccia tra il vetro di copertura e il campione, aumenta la quantità di luce riflessa. Per forti scatterers leggeri, come polistirene, l&#39;ampiezza iniziale può essere modificato da 0 a 1. Tuttavia, è difficile impostare l&#39;ampiezza iniziale vicino a 1 per soluzioni più comuni polimeri perché l&#39;intensità della luce riflessa è molto superiore quella della luce diffusa. </li><li> Applicare l&#39;inverso di Laplace trasformazione (utilizzando il programma di regolarizzazione vincolata CONTIN 13,14) per la funzione di correlazione tempo ottenuto per l&#39;acquisizione della funzione di distribuzione delle dimensioni. Nei casi in cui l&#39;ampiezza iniziale è impostato a meno di 0,2, la funzione di distribuzione del raggio idrodinamico mostrerà un forte picco di circa 100 nm, che è due volte il raggio effettivo (si veda la discussione per i dettagli). </li></ol></li><li> misurazione del campione <ol><li> Impostare la temperatura fase a 25 ° C. </li><li> Posizionare un vetrino preparato con poli-NIPA (PNIPA) solutione (fase 1.3.4) sul palco del microscopio. </li><li> Misurare la funzione di correlazione temporale delle intensità della luce diffusa seguendo i punti 2.1.4-2.1.8. Se l&#39;ampiezza iniziale è maggiore di 0,2, regolare il punto focale di rendere l&#39;ampiezza iniziale della funzione di correlazione volta meno di 0,2 seguendo passo 2.1.9. Una piccola ampiezza iniziale semplifica l&#39;analisi. </li><li> Impostare la temperatura fase a 35 ° C e attendere fino a quando la soluzione diventa torbida. La temperatura più bassa soluzione critica (LCST) di soluzione PNIPA è di 32 ° C 15. </li><li> Misurare la funzione di correlazione momento seguenti operazioni 2.1.4-2.1.8. Se possibile, regolare la posizione del punto focale per rendere l&#39;ampiezza iniziale della funzione di correlazione tempo inferiore a 0,2. Per soluzioni torbide, le loro ampiezze iniziali tendono ad aumentare, poiché l&#39;intensità della luce aumenta sparsi mentre quella della luce riflessa rimane costante. </li><li> Applicare l&#39;inverso Laplace transformatia funzioni di correlazione temporali ottenuti per ottenere le funzioni di distribuzione dimensioni. Si noti che la dimensione effettiva è la metà del valore ottenuto nei casi in cui l&#39;ampiezza iniziale è inferiore a 0,2. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;ampiezza iniziale della funzione di correlazione tempo dipende fortemente dal punto focale, come mostrato nella Figura 2 (a). Questo contraddice apparentemente il fatto che la soluzione risulti omogenea (tranne per il sottile strato all&#39;interfaccia) 8. Questa variazione di ampiezza iniziale è attribuita a una variazione della quantità di luce riflessa. Parziale teoria eterodina 16 prevede che l&#39;ampiezza iniziale A, l&#39;intensità della luce diffusa, I s, e l&#39;intensità della luce riflessa, I r, soddisfano la seguente equazione 1 <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg" /> Questa equazione mostra che la più grande I R diventa il più piccolo A diventa. Pertanto, A viene ridotta impostando la posizione focale vicino all&#39;interfaccia. L&#39;apparente di diffusione costante D A can essere ottenuto montando la funzione di correlazione tempo nel caso di soluzioni monodisperse: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg" /> dove <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg" /> . Qui, n è l&#39;indice di rifrazione del solvente (acqua, 1,33), θ è l&#39;angolo dispersa (180 °), e λ è la lunghezza d&#39;onda della luce (514,5 nm). Poiché abbiamo applicato geometria backscattering, il valore di q è fisso. Tuttavia, questo punto è risolto utilizzando diverse lunghezze d&#39;onda della luce. Si prega di notare che qualsiasi tipo di sorgente laser ad onda continua è disponibile per costruire il microscopio DLS. Grazie al piccolo volume irradiato, il fattore di coerenza 17 è stimato a più di 0,99 ed è trascurabile. Per soluzioni polidispersi, la funzione di ripartizione di D A è ottenuta dalla trasformazione inversa di Laplace. esimo eterodina parzialiEory prevede anche che D A non è la stessa come la costante reale diffusione D. Queste due costanti di diffusione soddisfano la seguente equazione: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg" /> La costante di diffusione D viene convertito nel idrodinamico raggio R h usando l&#39;equazione di Einstein-Stokes 4. Quando A = 1, questo rapporto diventa D A = D. In questo caso, il processo di conversione dei dati è la stessa che per la dispersione della luce dinamica comune. La linea rossa mostrata nella figura 2 (b) corrisponde a questo caso. Al contrario, questo rapporto diventa D A = 0,5 D al limite di A → 0. Quindi, la dimensione è stimata essere due volte più grande della dimensione reale quando A è piccolo (praticamente, inferiore a 0,2), come mostrato dalla linea blu di figura 2 (b) </sTrong&gt;. Se sappiamo che A è notevolmente piccolo, l&#39;asse orizzontale può essere spostata, come mostrato nella Figura 2 (c). In linea di principio, possiamo convertire D A in D per qualsiasi valore di A. In pratica, tuttavia, è preferibile impostare l&#39;ampiezza iniziale inferiore a 0,2, poiché il semplice approssimazione D A ~ 0,5 D vale. Le caratteristiche di spicco della tecnica di diffusione microscopio ottico dinamica sono state dimostrate con una soluzione PNIPA. La conformazione del PNIPA qui sotto e al di sopra della LCST è stato ampiamente studiato con piccoli angoli di scattering di neutroni 15,18. Al contrario, light scattering dinamico non è stato utilizzato per l&#39;analisi PNIPA sopra la LCST causa della sua torbidità 19. Questo problema viene risolto dal microscopio ottico dispersione dinamica, come mostrato nelle figure 3 (a) e (b). La dimensione di questi aggregati è parecchio &amp;# 181; m, che non può essere ottenuta con uno piccolo angolo X-ray scattering di / neutroni o tecniche di scattering di luce convenzionali. Misure risolta in tempo che utilizzano questo sistema forniscono informazioni sul processo di aggregazione durante il cambio di temperatura. Lo svantaggio del microscopio della diffusione della luce dinamica è anche illustrata in figura 3. Per il risultato al di sotto del LCST, la funzione di correlazione temporale è fortemente influenzata dalla piccola quantità di polveri presenti (le linee nere in figura 3). Ad esempio, la funzione di correlazione tempo non decade completamente, anche con tempi di correlazione nell&#39;ordine di 1,0 s. Questo perché il volume irradiato con questo apparato (circa 1,0 micron) è significativamente minore di quella irradiata con la consueta apparecchiatura dispersione della luce dinamica (circa 100 micron). Nei casi in cui l&#39;intensità della luce diffusa è debole, il segnale viene oscurata dal rumore, come quella causata da squantità centro commerciale di polvere nella soluzione. Pertanto, i tre picchi mostrati in figura 3 (b) non possono avere importanza quantitativa, anche se l&#39;ordine generale delle dimensioni è significativo. Si noti che un diffusore così debole può essere misurata con un apparecchio di dispersione della luce dinamica convenzionale. Abbiamo dimostrato che il microscopio dispersione della luce dinamica consente di misurare i campioni sia trasparente e torbidi con la stessa configurazione. Poiché la lunghezza del percorso ottico nei campioni è breve, questa tecnica può essere applicata a forti campioni che assorbono la luce, quali sospensioni di nanotubi di carbonio 20. Inoltre, grazie alla sua elevata risoluzione spaziale, questa tecnica può essere applicata a cellule biologiche. Per la sua applicazione alla biologia, questo metodo può anche essere combinato con altre tecniche di imaging, come la fluorescenza e l&#39;imaging Raman. Così, noi crediamo che il microscopio dispersione della luce dinamica è un potente strumento per una vasta gamma di campi di ricerca.

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 &#181;m or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions4. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.
Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy5,6, low-coherence dynamic light scattering7,8, diffusing-wave spectroscopy9,10, and differential dynamic microscopy11,12.
We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope1. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-isopropylacrylamide, 98%</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>toluene, 99%</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 &amp;deg;C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetramethylethylenediamine, 99%</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate, 98%</td><td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene latex suspension, 1 wt%</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>purity &gt; 99.999 vol.%</td></tr><tr><td>cavity slide</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>avalanche photodiode</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode</td><td></td></tr><tr><td>correlator</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Funzioni tempo di correlazione di intensità della luce diffusa per una sospensione di polistirene (raggio delle particelle: 50 nm) sono stati misurati in diversi punti focali, come mostrato nella Figura 2 (a). Queste funzioni di correlazione sono stati convertiti in funzioni di distribuzione del raggio idrodinamico per l&#39;inverso Laplace trasformazione (riferimento alla figura 2 (b) e (c)). Usando la stessa procedura, le funzioni di correlazione di tempo e funzioni di distribuzione del raggio idrodinamico della soluzione PNIPA stati ottenuti a 25 ° C e 35 ° C rispettivamente. Le figure 3 (a) e (b) mostrano le funzioni di correlazione temporale delle intensità della luce diffusa e le corrispondenti funzioni di distribuzione dimensioni della soluzione PNIPA sotto (25 ° C) e superiore (35 ° C) il LCST. Le funzioni di distribuzione di dimensione sono stati ottenuti dalla antitrasformata trasformazione seguita dalcorrezione del eterodina parziale. Il raggio medio idrodinamico sotto la LCST è diverse decine di nanometri, che è tipico per soluzioni polimeriche. Al contrario, il raggio idrodinamico sopra la LCST è di circa 1,0 micron. Questo risultato è coerente con il fatto che la soluzione è torbida sopra la LCST. Le linee rosse e blu in Figura 3 rappresentano la distribuzione delle dimensioni delle soluzioni PNIPA ottenuto immediatamente dopo e 20 minuti dopo che la soluzione divenne torbida, rispettivamente. Figura 3 (b) indica chiaramente la crescita della aggregazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del microscopio dispersione della luce dinamica. Pinhole (PH), fascio splitter (BS), polarizzatore (Pol), e fotodiodo a valanga (APD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere</a>una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi per una sospensione di polistirene. (A) funzioni di correlazione temporale delle intensità della luce diffusa per la sospensione di polistirene. Il raggio nominale è di 50 nm e la concentrazione è 0.1% in peso. Due insiemi di dati sono stati ottenuti da differenti punti di scattering. (B), (c) funzioni di distribuzione dimensioni corrispondenti per la sospensione polistirene lattice ottenuto dalla antitrasformata trasformazione di (a). La linea rossa corrisponde alla funzione di correlazione tempo la cui ampiezza iniziale è di circa 1,0, e la linea blu corrisponde a quella di ampiezza iniziale è circa 0,2. L&#39;asse orizzontale è stato calcolato senza (b) e (c) esaminare l&#39;effetto di eterodina parziale (PHD) quando A &lt;&lt;<html> ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi per una soluzione PNIPA. (A) le funzioni di correlazione Tempo di intensità della luce diffusa per la soluzione PNIPA. (B) le funzioni di distribuzione dimensioni corrispondenti per la soluzione PNIPA ottenuto dalla antitrasformata trasformazione di (a). L&#39;asse orizzontale è stato calcolato considerando l&#39;effetto di eterodina parziale per ciascun set di dati. La linea nera rappresenta i dati ottenuti a 25 ° C. La linea rossa rappresenta i dati ottenuti dopo la soluzione attivata torbida (35 ° C). La linea blu rappresenta i dati ottenuti dopo 20 min di misurazione della linea rossa./54885/54885fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Un protocollo per la misura diretta della distribuzione granulometrica in soluzioni concentrate utilizzando dinamica microscopia ottica di scattering viene presentato.

Misura della dimensione delle particelle di distribuzione in torbidi soluzioni da Dynamic Light Scattering Microscopia

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

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14.3K Views.  University of Tokyo.  Un protocollo per la misura diretta della distribuzione granulometrica in soluzioni concentrate utilizzando dinamica microscopia ottica di scattering viene presentato. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Ricerca

Bioingegneria

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersione dei nanomateriali in mezzi acquosi: verso l'ottimizzazione dei protocolli

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Ambiente

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

Sintesi controllata e fluorescenza di monitoraggio altamente uniforme Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgel

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

Chimica

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Applicazione di tensione nell'analisi dinamica delle particelle di dispersione della luce

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful platform for exploring the physics of polyelectrolyte interactions and also offer a promising solution to the pressing problem of delivering therapeutic oligonucleotides in vivo. Developing predictive structure-property relationships for PCMs has proven difficult, in part due to the presence of strong kinetic traps during nanoparticle self-assembly. This article discusses criteria for choosing polymers for PCM construction and provides protocols based on salt annealing that enable assembly of repeatable, low-polydispersity nanoparticles. We also discuss PCM characterization using light scattering, small-angle X-ray scattering, and electron microscopy.

We provide protocols and representative data for designing, assembling, and characterizing polyelectrolyte complex micelles, core-shell nanoparticles formed by polyelectrolytes and hydrophilic charged-uncharged block copolymers.

Assemblaggio e caratterizzazione di Micelle complesse di polielettroliti

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood banks. Cells fragment off microparticles (MP) when they are stressed. Blood and blood components may contain cellular fragments from a variety of cells, most notably from activated platelets. When performing their roles as innate immune cells and major players in coagulation and hemostasis, platelets change shape and generate microparticles. With dynamic light scattering (DLS)-based microparticle detection, it is possible to differentiate activated (high microparticle) from non-activated (low microparticle) platelets in transfusions, and optimize the use of this scarce blood product. Previous research suggests that providing non-activated platelets for prophylactic use in hematology-oncology patients could reduce their risk of becoming refractory and improve patient care. The goal of this screening method is to routinely differentiate activated from non-activated platelets. The method described here outlines the steps to be performed for routine platelet inventory management in a hospital blood bank: obtaining a sample from a platelet transfusion, loading the sample into the capillary for DLS measurement, performing the DLS test to identify microparticles, and using the reported microparticle content to identify activated platelets.

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative in hospital blood banks. The goal is to differentiate activated from non-activated platelets to optimize the use of platelets. Providing non-activated platelets to hematology-oncology patients might reduce their high risk to become refractory.

Routine di metodo di Screening per microparticelle in trasfusioni della piastrina

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Medicina

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

Quantificazione della dinamica del citoscheletro mediante microscopia dinamica differenziale

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Biologia

Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally heterogeneous nanoparticle complexes, which exhibit varying sensitivity to the conditions required for the methodologies available to physicochemically characterize these agents. Currently, the critical quality attributes of iron-carbohydrate complexes have not been fully established. Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a fundamental method to determine intact particle size and distribution. However, challenges still remain regarding the standardization of methodologies across laboratories, specific modifications required for individual iron-carbohydrate products, and how the size distribution can be best described. Importantly, the diluent and serial dilutions used must be standardized. The wide variance in approaches for sample preparation and data reporting limit the use of DLS for the comparison of iron-carbohydrate agents. Herein, we detail a robust and easily reproducible protocol to measure the size and size distribution of the iron-carbohydrate complex, iron sucrose, using the Z-average and polydispersity index.

Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a suitable assay for evaluating the particle size and distribution of intravenously administered iron-carbohydrate complexes. However, the protocols lack standardization and need to be modified for each iron-carbohydrate complex analyzed. The present protocol describes the application and special considerations for the analysis of iron sucrose.

Analisi dinamica della diffusione della luce per la determinazione della dimensione delle particelle dei complessi ferro-carboidrati

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally ...

Misura della dimensione delle particelle di distribuzione in torbidi soluzioni da Dynamic Light Scattering Microscopia

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