This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

Attenzione: consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) dei vari reagenti prima di utilizzarli. Molti dei prodotti chimici utilizzati durante la preparazione dei campioni sono tossiche, cancerogene, mutagene e / o tossiche per la riproduzione. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, pantaloni full-length, e scarpe chiuse) e il lavoro sotto una cappa aspirante durante la manipolazione del campione. Sezionamento il campione con un ultramicrotomo prevede l&#39;utilizzo di strumenti appuntiti e attento uso di questi strumenti è obbligatorio. Nei passi descritti di seguito, gli autori assumono che il campione è un campione di coltura cellulare. Il protocollo può essere necessario modificare secondo il tipo di campione, soprattutto le fasi di centrifugazione. 1. Preparazione di buffer e delle miscele <ol><li> Preparare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, e 1,76 mM KH 2 PO 4). </li><li> Preparare soluzioni contenenti il ​​30%, 50% e 70% etHANOL in PBS per la disidratazione del campione. Eseguire campione disidratazione incubando gradualmente il campione in concentrazioni crescenti di etanolo. </li><li> Preparare resina epossidica mescolando bisfenolo-A- (epicloridrina) (20 mL), dodecenil anidride succinica (9 mL), metil-5-norbornene-2,3-dicarbossilico (11 mL), e 2,4,6-tris ( dimetilamminometil) fenolo (0,7 mL); altri rapporti di miscelazione possono essere utilizzate a seconda della durezza desiderata della resina. </li><li> Preparare soluzioni contenenti il ​​30%, 50%, e resina epossidica 70% in etanolo per incorporamento campione. Eseguire embedding resina incubando gradualmente il campione con concentrazioni crescenti di resina. NOTA: I volumi delle soluzioni preparate dipendono dal tipo di campione che viene studiato. Altre soluzioni sono necessarie per tessuti che per colture cellulari. </li></ol> 2. Fissazione e colorazione del campione <ol><li> Centrifugare la coltura cellulare per 5 minuti a 5000 x g. Eseguire tutte le seguenti centrifugazioni utilizzando le stesse condizioni.</li><li> Eliminare il supernatante e fissare il pellet cellulare da risospendere in PBS (1 mL) con 4% paraformaldeide e glutaraldeide al 2%. Incubare a temperatura ambiente per 30 min (Figura 1A). In alternativa, fissare le cellule a 4 ° C durante la notte o durante il fine settimana. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere completamente gli agenti fissativi. </li><li> Post-fissare il campione con 1% OsO 4 in PBS (1 mL) per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere completamente i OsO 4. Disattivare la OsO 4 in olio e degli scarti. </li><li> Aggiungere 2% acetato di uranile in PBS (1 mL) come agente di contrasto e incubare il campione per 30 minuti a temperatura ambiente (Figura 1B). </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e lavare il pellet 3 volte con PBS (1 mL) per rimuovere l&#39;ac uranile non legatoetate; acetato di uranile contiene elementi radioattivi e deve essere smaltito in un contenitore dedicato ai rifiuti radioattivi. NOTA: I tempi di incubazione può essere modificato a seconda delle dimensioni del campione. Ad esempio, la fissazione e la colorazione dei campioni più spessi, come i tessuti campioni, richiedono tempi di incubazione più lunghi. tempi di incubazione più lunghi possono anche essere meglio per la disidratazione e le fasi di incorporamento. acetato di uranile può essere sostituita da una soluzione &quot;uranile-less&quot;, che contiene sali di gadolinio. </li></ol> Disidratazione 3. Campione <ol><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e incubare il campione per 30 minuti a 4 ° C in PBS (1 mL) con il 30% di etanolo (Figura 1C). </li><li> Ripetere il passaggio 3.1 utilizzando soluzioni con concentrazioni progressivamente crescenti di etanolo (50%, 70%, e fino al 100%). Durante queste fasi di disidratazione, di mantenere il campione a 4 ° C per scopi di conservazione del campione. </li><li> Dopo la centrifugazione, scartare il supernatformica e risospendere il pellet in etanolo puro (1 ml); incubare una notte a 4 ° C. </li></ol> 4. Resina Embedding <ol><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in etanolo con resina epossidica 30% (1 ml) per 30 minuti a RT (Figura 1D). </li><li> Ripetere passaggio 4,1 utilizzando soluzioni con concentrazioni resina gradualmente crescente epossidiche (50%, 70% e fino al 100%). </li><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet in resina epossidica pura (1 mL); incubare una notte a temperatura ambiente. La presenza di indurimento DMP-30 potrebbe innescare la polimerizzazione della resina; Se questo accade, preparare due lotti di resina epossidica, con e uno senza DMP-30. </li><li> Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 200 ml di resina epossidica pura (contenente il catalizzatore) in una capsula di plastica; il campione deve essere in fondo della capsula in plastica. </li></ol> 5. Resina polimerizzazione <ol><li> ioncubate la capsula di plastica contenente il campione in un incubatore a 60 ° C per 48 h; altri tipi di resina possono polimerizzare con impostazioni diverse. </li><li> Rimuovere la capsula dal termostato e verificare che la resina è polimerizzata; la resina dovrebbe essere difficile se premuto contro una superficie dura. </li><li> Aggiungere resina epossidica pura (contenente il catalizzatore) sulla parte superiore della resina polimerizzata contenente il campione; questo strato aggiuntivo di resina sarà più facile per tagliare il campione. Incubare la capsula a 60 ° C per 48 h. </li></ol> Sezioni 6. Campione <ol><li> Montare il campione capovolto in un portacampioni in modo che il campione sia verso l&#39;alto e fissarlo sul blocco rifilatura del ultramicrotomo. chiudere strettamente la leva per fissare il blocco di taglio al ultramicrotomo. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio o simile strumento tagliente, tagliare la capsula di plastica per separarlo dalla resina polimerizzata. Tagliare la resina in modo che il campione sia contieneed in resina o meno nella forma di una piramide. Non vi è alcuna necessità di rimuovere l&#39;intera capsula di plastica; rimuovere solo la parte che copre il campione polimerizzato. </li><li> Prendete la capsula e il titolare del campione fuori del blocco di taglio e installarli sul braccio mobile del ultramicrotomo. </li><li> Installare un coltello taglio sul blocco coltello e tagliare con precisione le facce della piramide. Si consiglia l&#39;uso di un binocolo per dare una forma perfetta alla piramide; meglio piramide, meglio sezioni saranno. </li><li> Rimuovere la lama di taglio e sostituirlo con un coltello istologico che può essere usato per tagliare sezioni che sono più spessi di 0,5 micron. </li><li> Dopo aver riempito la cuvetta del coltello istologico con la giusta quantità di acqua, portare il tagliente del coltello alla superficie del campione e utilizzare le binocoli per regolare l&#39;angolo capsule passo in modo che il coltello taglierà perpendicolarmente alla piramide. </li><li> Regolare la velocità di taglio secondo l&#39;desiderataspessore della sezione per recuperare sezioni omogenee. </li><li> Sia il galleggiante sezione sull&#39;acqua e pesce con un ciclo. </li><li> Spostare il loop verso una griglia di rame microscopia elettronica che è stato posto sopra la carta filtro. NOTA: La griglia deve essere stato precedentemente trattato per aumentare la sua idrofilia. Questo può essere eseguito con una penna grid-rivestimento. </li><li> A causa di assorbimento di acqua dalla carta da filtro, lasciare che la sezione bastone alla rete. Lasciare asciugare per qualche minuto prima di inserirla nel microscopio elettronico. </li></ol> 7. Progettazione del Attraverso-focale Tilt-series <ol><li> Raccogliere immagini attraverso-focale a intervalli costanti di messa a fuoco. NOTA: L&#39;inclinazione serie passante focale consiste di una serie di immagini attraverso focali che sono raccolti ad ogni angolo di inclinazione del tilt-serie. Il fuoco intero ampiezza dovrebbe essere sufficiente a coprire tutto lo spessore del campione. </li><li> Determinare il valore dell&#39;intervallo di messa a fuoco. Se l&#39;intervallo è uguale al dapprofondito lavoro di campo, raccogliere l&#39;intero campione a fuoco; questa impostazione rappresenta il più alto campionamento possibile. Se l&#39;intervallo è maggiore della profondità di campo, alcune parti del campione non verranno acquisiti a fuoco, il che significa che alcune parti del campione non verranno raccolti a fuoco. </li><li> Calcolare la profondità di campo di un fascio di elettroni dalla lunghezza d&#39;onda del elettrone e la convergenza semi-angolo del fascio di elettroni. Considerando che la lunghezza d&#39;onda di elettroni è direttamente collegato alla tensione di accelerazione, utilizzare la convergenza semi-angolo fornito dal produttore microscopio elettronico o determinare sperimentalmente dal modello di diffrazione di un campione noto 16. Poiché elettroni accelerati ad una lunghezza d&#39;onda λ colpire il campione con una convergenza semi-angolo α in un microscopio elettronico, utilizzare la seguente equazione per determinare la profondità di campo-(DOF): <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> Designla serie focale, in modo che il fuoco intero ampiezza coprirà il campione a suo spessore apparente massimo (cioè, al massimo di inclinazione). NOTA: Un campione micron di spessore 0,75 avrà uno spessore apparente di 2.19 micron ad una inclinazione di 70 °, quindi l&#39;ampiezza attenzione dovrebbe essere maggiore di 2,19 micron. Per questo esempio, se l&#39;intervallo di messa a fuoco sopra determinato è pari a 50 nm, che richiederà 44 immagini (2.19 micron / 50 nm) per coprire il campione al suo spessore massimo apparente. Il fuoco intero ampiezza è uguale al valore dell&#39;intervallo fuoco moltiplicato per il numero di passaggi focali. Alla massima inclinazione (θ), lo spessore apparente campione è definito come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> Imaging 8. Campione NOTA: E &#39;oltre lo scopo di questo protocollo per descrivere come impostare un microscopio elettronico in modalità STEM; la maggior parte di queste informazioni si possono trovare in il manuale di riferimento fornito dal produttore microscopio elettronico. Tuttavia, tenere presente quanto segue: i) la dimensione del punto deve essere scelto in base alla ingrandimento desiderato; ii) il Ronchigram deve essere ben allineato; e iii) in modalità BF, la lunghezza telecamera deve essere regolata per selezionare elettroni unscattered pur mantenendo una buona illuminazione del rivelatore. sezioni resina depositati su griglie di rame di microscopia elettronica devono essere illuminati prima di acquisizione delle immagini per evitare il restringimento. ritiro in resina e gli effetti di ricarica potrebbero essere confusi durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. L&#39;uso di una apertura lente obiettivo potrebbe migliorare la stabilità di esempio quando si verificano effetti ricarica. Tuttavia, nel caso specifico delle configurazioni gambo, l&#39;apertura obiettivo non è compatibile con la modalità di imaging HAADF, e molto piccole aperture oggettivi non sono compatibili con la modalità di imaging BF. <ol><li> Utilizzando basso ingrandimento (circa 20,000X in STEM), sfogliare il campione e individuare la regione di interesse. </li><li> regolare tha eucentrica altezza (asse Z) in modo che la regione di interesse non allontanarsi durante la rotazione del campione. </li><li> Verificare che l&#39;oggetto di interesse rimarrà visibile su tutto il campo di inclinazione. </li><li> A causa del consistente numero di immagini acquisite nel corso di un passante focale tilt-serie, utilizzare un software automatico di raccolta. Utilizzare una soluzione commerciale o di progettare un software di raccolta dati personalizzati se lo si desidera. Verificare che il programma software è in grado di eseguire le seguenti tre fasi: <ol><li> Traccia e mettere a fuoco come in un sistema di raccolta tilt-serie standard. </li><li> Assicurarsi che le immagini attraverso-focale sovrappongono con la Z-posizione del campione. </li><li> acquisire automaticamente una serie di immagini attraverso focale ad ogni angolo di inclinazione. </li></ol></li><li> Dare il programma software i principali parametri del tilt-serie attraverso-focale (ovvero, gli intervalli di focale, passo focale, angolo minimo di inclinazione, angolo di inclinazione massima, passo inclinazione e velocità di scansione). </li><li> Inizioil processo di raccolta di immagini e attendere che il programma software per terminare. </li></ol> Processing 9. Immagine NOTA: In questo protocollo, il trattamento attraverso focale tilt-serie è eseguita utilizzando ImageJ plug-17. Supplementare dei dati 1 mostra una macro ImageJ per la fase di allineamento (Turboreg) e per unire le informazioni di messa a fuoco (profondità di campo estesa) per un tilt-serie attraverso focale progettato con tre valori di messa a fuoco. <ol><li> Allineare le immagini raccolte con lo stesso angolo di inclinazione (ad esempio, le immagini attraverso-focale). Dal momento che le immagini non hanno le stesse informazioni di messa a fuoco, non porto le stesse caratteristiche di allineamento; eseguire l&#39;allineamento allineando immagini adiacenti a due a due (cioè, dopo una gerarchia piramidale, con i valori di messa a fuoco più vicini prime) utilizzando Turboreg 18, un plugin ImageJ. </li><li> Coerentemente verificare l&#39;allineamento delle immagini attraverso focali ad ogni angolo di inclinazione.Stack i allineate immagini attraverso-focale per migliorare l&#39;ispezione visiva. NOTA: solo la zona che è a fuoco dovrebbe muoversi durante la navigazione attraverso lo stack. allineamento accurato è la cosa più importante, poiché il passo successivo consiste nel recupero delle informazioni che è a fuoco da diverse immagini. </li><li> Unire le informazioni che è a fuoco con profondità di campo estesa 19, un plugin ImageJ; questo puo &#39;generare una singola immagine dalla pila di immagini. Diverse impostazioni possono essere utilizzati durante il recupero della profondità di campo, ma utilizzano le impostazioni più alte per preservare le informazioni dell&#39;immagine. NOTA: L&#39;inclinazione-serie è ora composta da una singola immagine per angolo di inclinazione, ogni immagine contenente le informazioni in-focus recuperato dalle immagini attraverso focali. </li><li> Elaborare i dati. NOTA: Gli strumenti standard per l&#39;allineamento e la ricostruzione può essere utilizzato in quanto i dati ora è stato ridotto a un tilt-serie standard. In questo protocollo, TomoJ noi èEd per l&#39;allineamento dei dati e la ricostruzione dei dati 20, 21. Maggiori informazioni su come utilizzare TomoJ possono essere trovati nella pubblicazione originale 22. </li><li> Eseguire bene allineamento del tilt-serie. NOTA: Una buona strategia è quella di utilizzare oro perle come marcatori fiduciali di monitorare con precisione spostamenti tra le immagini. minimi locali può essere utilizzata anche se perline oro non possono essere aggiunte al campione. </li><li> Eseguire una ricostruzione in 3D dei dati allineati; diversi algoritmi sono disponibili per eseguire le ricostruzioni nello spazio reale o spazio di Fourier, ciascuno con vantaggi e limitazioni. </li><li> Se l&#39;allineamento finale del tilt-serie è povero, apportare alcuni miglioramenti, ottimizzando le fasi iniziali. Ribadire le fasi di allineamento se la ricostruzione 3D finale appare sfuocata o deformata; in pratica, maggiore è il numero di piani focali raccolti, migliore è il contrasto e dettagli della ricostruzione 3D. NOTA: Seprogrammi software veral possono essere utilizzati per elaborare il passante focale tilt-serie. Tuttavia, gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono stati scelti perché, nella nostra esperienza, si sono esibiti i migliori. Turboreg 18 risultati migliori in termini di allineare le immagini quando un gradiente di concentrazione era presente. Maggiori informazioni possono essere trovate sul sito dedicato 23. La profondità di campo estesa plug-19 è comportato molto bene in termini di recupero delle informazioni di messa a fuoco da diverse immagini, mentre altri strumenti provocato pixel visibili modifiche. Maggiori informazioni, soprattutto per quanto riguarda la scrittura di script, si possono trovare su questo sito web dedicato 24. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles.">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li><li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

We have no conflict of interest to disclose.

In questo articolo, vi presentiamo un protocollo convenzionale preparazione del campione insieme a una guida passo-passo per l&#39;esecuzione di analisi 3D su campioni biologici spessi usando STEM attraverso focale tomografia. Resina incasso di campioni biologici è stato utilizzato per decenni 26 e protocolli alternativi che si adattano a diversi tipi di campioni si trovano in tutta la letteratura 27. Al contrario, di imaging campioni spessi in staminali utilizzando metod...

Dall&#39;inizio degli anni 1970, tomografia avvicina in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di campioni biologici 1, 2, 3. Il ricorso della tomografia elettronica a trasmissione era che potrebbe essere utilizzata per studiare una vasta gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall&#39;architettura delle cellule e l&#39;ultrastruttura di organelli alla struttura di complessi macromolecolari e proteine. Tuttavia, tomografia elettronica a trasmissione non può essere usato per studiare campioni molto spessi (superiore a 0,5 micron). In effetti, i campioni di spessore producono troppi elettroni sparsi, generando basso rapporto segnale-rumore (SNR) immagini. Inoltre, tomografia comporta la raccolta di immagini di campioni inclinati, con lo spessore apparente del campione aumenta con l&#39;angolo di inclinazione. Anche se scattering anelastico può essere filtratautilizzando filtri di energia, la quantità critica di elettroni necessari per le immagini ad alta SNR è a malapena raggiunto in TEM. Quindi, campioni biologici di spessore sono stati studiati solo mediante sezionamento 4. Alcuni campioni non possono essere tagliati: alcuni potrebbero deteriorarsi se non vengono tagliati, e gli altri devono essere studiati nella loro interezza al fine di comprendere la loro complessità. Un approccio alternativo consiste nell&#39;utilizzare TEM in modalità 5, 6, 7, 8 scansione. In scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM), il percorso ottico degli elettroni è diversa da quella in TEM convenzionale. Gli elettroni che passano attraverso il campione senza dispersione possono essere raccolti sull&#39;asse ottico con un rivelatore 9 campo chiaro (BF), mentre quelli sparsi elasticamente possono essere raccolti in un certo angolo rispetto all&#39;asse ottico con un rivelatore di campo scuro (DF).L&#39;altro vantaggio di STEM è che il fascio elettronico focalizzato viene scansionato alla superficie del campione, consentendo la raccolta di pixel-per-pixel delle immagini. Anche se il fascio elettronico allarga mentre passa attraverso il campione 10, questo particolare sistema di raccolta è meno sensibile agli elettroni anelasticamente sparsi rispetto TEM convenzionale. Inoltre, non vi è nessun obiettivo post-campione in STEM, evitando le aberrazioni cromatiche che possono verificarsi in TEM. La lunghezza telecamera può essere regolata in modo che il rilevatore BF rileva principalmente elettroni unscattered. Utilizzando il rilevatore di DF per studiare campioni di spessore non è raccomandato a causa di scattering multiplo, che produce immagini imprecise. Invece, il rivelatore BF può essere utilizzato 11. Mentre staminali possono produrre alti immagini SNR, ha una relativamente bassa profondità di campo per la convergenza relativamente elevato fascio rispetto al TEM, diminuendo la quantità di informazioni approfondite che possono essere recuperate da spessaesemplari. Nel caso di microscopi STAMINALI aberrazione-corretto, in cui l&#39;angolo di convergenza può essere alto come 30 mrad, la profondità di campo-può essere sufficientemente bassa in modo che le informazioni che è a fuoco proviene da un piano focale di solo pochi nanometri . Impostazione del fascio di elettroni in modo parallelo aumenta la profondità di campo del fascio di elettroni a scapito della risoluzione 12. Tuttavia, questa configurazione non è sempre possibile. Qualora sia necessario utilizzare un fascio convergente di elettroni, si dovranno impiegare tecniche che esaltano la profondità di campo del fascio elettronico studiando campioni spessi. Recenti studi hanno riportato l&#39;acquisizione di immagini multiple in diversi piani focali per tutto il campione di recuperare la massima quantità di informazioni di messa a fuoco 13, 14. I due studi descrivono modi diversi per gestire le informazioni dai diversi piani focali. Hovden et al.combinati nello spazio di Fourier le immagini che sono stati raccolti in diversi piani focali, e la ricostruzione finale è stato ottenuto direttamente dalla inversa 3D trasformata di Fourier 13. Al contrario, Dahmen et al. sviluppato un motore ricostruzione fascio convergente ricostruire nello spazio reale volume 3D dai vari piani focali 14. Il nostro laboratorio ha anche sviluppato un metodo per l&#39;imaging campioni biologici spessi. La nostra strategia era diverso dai due metodi descritti in precedenza in quanto ci siamo fusi l&#39;informazione che è a fuoco nei vari piani focali e ricostruito il volume 3D finale nello spazio reale utilizzando un proiettore fascio parallelo 15. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo che può essere facilmente eseguito in qualsiasi laboratorio di microscopia elettronica. A questo scopo, abbiamo voluto raccogliere le immagini focali in una quantità limitata di tempo, paragonabile al lasso di tempo di esperimenti tomografia convenzionali. Inoltre, il metodo proposto could essere adattato per l&#39;uso con differenti tipi di allineamento e software di ricostruzione. Nel contesto della nostra pubblicazione dal 2015 15, volevamo visualizzare e caratterizzare il recupero della profondità di campo, quindi abbiamo usato una grande convergenza semi-angolo di 25 mrad. Qui, vi presentiamo un protocollo step-by-step per l&#39;esecuzione tramite-focale di imaging in STEM secondo il metodo messo a punto nel nostro laboratorio nel 2015 15, e presentiamo come i dati a partire dal 2015 è stato elaborato. Questo metodo recupera informazioni a fuoco da diversi piani focali tutta una (750 nm) campione biologico spessore e permette ricostruzioni 3D di alta qualità. Se del caso, vengono anche presentate le differenze in questa metodologia rispetto i metodi utilizzati da altri gruppi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &#176;C. 
			Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin Capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triming and Histo knives</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>Diatome diamond knives</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy copper grid</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Pen</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>70624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Holder</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EM-21311 HTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Nel nostro studio, gli elettroni sono stati accelerati a 200 kV nel microscopio elettronico a trasmissione pistola emissione di campo. Le immagini sono state raccolte in modalità STEM BF utilizzando un tempo di sosta di 20 ms. Per quanto riguarda il disegno del tilt-serie passante focale, abbiamo riscontrato che gli intervalli di messa a fuoco di 150 nm hanno dato risultati soddisfacenti per lo studio ultrastrutturale di un campione, anche se la profondità di campo-del fascio di elettr...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Video: Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Ricerca

Biologia

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia elettronica a scansione (SEM) Protocolli per problematico Plant, oomicete, e campioni fungine

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

Flusso di lavoro di tomografia ad array per l'acquisizione mirata di informazioni sul volume utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...