Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
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Gli autori riconoscono il sostegno dell&#39;Università di Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral oncologia condivisa in funzione che è sostenuta in parte dal premio P30CA047904.

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	<li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+telomeres+and+telomerase.">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Restriction+Fragment+(TRF)+Analysis.">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+Telomerase:+The+Means+to+the+End+(Nobel+lecture).">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Discovery:+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+(Nobel+lecture).">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li><li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Ends:+Just+the+Beginning+(Nobel+lecture).">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li><li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres,+Aging,+and+Plants:+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review.">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li><li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres-Structure,+Function,+and+Regulation.">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li><li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. 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Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li><li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-Associated+Aging+Disorders.">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).</li><li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer.">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li><li>Blackburn, E. H., Epel, E. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dopo l&#39;elettroforesi, la macchia genomica del DNA è superiore a 800 bp. Ciò può verificarsi se gli enzimi di restrizione sono difettosi o se sono necessari ulteriori enzimi (come sopra descritto). Una seconda possibile spiegazione è che la proteina è ancora attaccata al DNA. Nel determinare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro, il rapporto 260/280 dovrebbe essere di circa 1,8. Se questo rapporto è &lt;1,5, vi è contaminazione di proteine ​​che può interferire con la digestione dell&#39;enz...

I telomeri, situati alle estremità dei cromosomi, sono ripetuti nucleotidi della sequenza TTAGGG (sui cromosomi umani) che svolgono un ruolo fondamentale nella protezione delle informazioni genetiche cellulari 3 , 4 , 5 . Telomeres sono diverse migliaia di coppie di base in lunghezza e servono a proteggere l&#39;integrità del resto del cromosoma durante la replicazione del DNA. La replicazione dei cromosomi non è perfetta, con conseguente che le estremità del cromosoma non vengono completamente copiate. Questa inefficienza nella replica viene definita &quot;il problema di replicazione finale&quot; e provoca la perdita di alcune ripetizioni telomere durante ogni ciclo di replica 6 , 7 . La lunghezza del telomere può essere ripristinata dopo la divisione cellulare mediante telomerasi, un enzima che sostituisce le sequenze telomere perse 8 , 9 . La telomerasi, tuttavia, non lo èAttivato nella maggior parte delle cellule somatiche umane e, di conseguenza, nel tempo, i telomeresi accorceranno, determinando una senescenza cellulare 10 . A causa dell&#39;allungamento dei telomeri, i telomeri sono considerati biomarker dell&#39;invecchiamento e rischio di malattie legate all&#39;età 11 , 12 . Inoltre, la lunghezza del telomere può essere influenzata da fattori genetici, ambientali e di stile di vita e altri stimoli come lo stress ossidativo, che indica che la lunghezza del telomero può svolgere un ruolo di biomarker negli studi tossicologici, epidemiologici e comportamentali 13 , 14 , 15 . Questo articolo dimostra una tecnica per misurare la lunghezza del telomere utilizzando un&#39;analisi modificata del frammento di restrizione terminale (TRF) modificata da Mender e Shay 2 e Kimura et al. 16 , e simili a Herbert, Shay e WrigHt 1 e Haussmann e Mauck 17 . Tradizionalmente, l&#39;analisi TRF comporta una procedura di blot Southern. Le macchie meridionali sono considerate &quot;standard gold&quot; per studiare la lunghezza del telomere e sono attivamente utilizzate per esaminare la lunghezza del telomere di leucociti negli studi epidemiologici 18 . Questa analisi TRF utilizza il DNA genomico digerito lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri. I frammenti di DNA vengono quindi separati mediante elettroforesi a gel, denaturati e trasferiti a una membrana di nitrocellulosa. Le sequenze telomere sono ibridizzate ad una sonda di telomere oligonucleotide. Piuttosto che trasferire i telomeresi separati in una membrana, altre tecniche TRF utilizzano tecniche di ibridazione in-gel con e senza denaturazione del DNA. L&#39;inclusione della denaturazione è importante quando si considera la rilevazione di telomeri interstiziali, che sono stati riportati in alcune specie 19 . Le procedure che non hanno la denaturazione fanno solo rilevareI DNA a singolo filamento presentano sovrapposizioni nei telomeresi terminali e non si legano alle sequenze telomeriche interstiziali 18 . Oltre all&#39;analisi TRF, ci sono diverse altre tecniche per misurare la lunghezza del telomere che ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. La tecnica Flow-FISH può misurare la lunghezza media del telomero di singole cellule di un tipo cellulare distinto utilizzando la citometria a flusso 16 , 20 . Mentre può accuratamente tagliare telomeri con sonde altamente specifiche e ridurre l&#39;errore umano attraverso l&#39;automazione, Flow-FISH è costoso, meno efficiente e richiede campioni freschi e un tecnico altamente qualificato, limitando la sua capacità di studi epidemiologici 16 . Inoltre, questo metodo non tiene conto delle potenziali variazioni del numero di cromosomi nella popolazione cellulare. Un&#39;altra tecnica, qPCR, è ampiamente accettata come mezzo per misurare la lunghezza del telomere per studi epidemiologici <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 a causa della sua elevata produttività, basso costo e requisito per piccole quantità di DNA rispetto ad altri metodi. Tuttavia, qPCR può misurare solo il contenuto medio del DNA telomerico rispetto a un singolo gene della copia ed è quindi una stima indiretta della lunghezza media del telomero. Fornisce anche un elevato coefficiente di varianza negli studi di confronto, rispetto alle macchie meridionali, portando ad una precisione discutibile 21 . La procedura TRF ha delle proprie carenze che limitano l&#39;uso di alcuni studi. Le tecniche TRF richiedono una grande quantità di DNA rispetto ad altri metodi (tra 2 e 3 μg per campione). Ciò limita le applicazioni della tecnica per esaminare la lunghezza del telomero di campioni clinici per i quali può essere raccolto un sufficiente DNA genomico e non può essere utilizzato su campioni di DNA degradati. Inoltre, l&#39;analisi TRF è costosa e intensa e richiede 4-5 giorni per produrre risultati. Tuttavia, il TRF produce un basso coefficiente di varianzaConcedendo la sua riproducibilità. Mentre questo protocollo è diverso dalla macchia tradizionale Southern (utilizzando l&#39;ibridazione gel in situ ), le due tecniche sono fondamentalmente le stesse. La tecnica presentata qui è una combinazione di una blotta Southern e l&#39;ibridazione in gel; Associando il processo di denaturazione del DNA da macchie di Southern con l&#39;ibridazione in gel. Questa combinazione ha il vantaggio aggiunto di una migliore resistenza del segnale della sonda rispetto alla macchia Southern e ha costantemente reso quantificabili risultati all&#39;interno del nostro laboratorio. Inoltre, l&#39;uso di sonde radioattive piuttosto che le sonde chemiluminescenti produce un&#39;intensità del segnale più elevata e consente la visualizzazione e la quantificazione con un fosforimagno, rendendo le analisi del TRF facile da usare.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Biologics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, restriction enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL, DNA digestion.&amp;nbsp; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td></tr><tr><td>Hinf1, restriction enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL, DNA digestion.&amp;nbsp; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>electrophoresis grade agarose</td></tr><tr><td>Optikinase&amp;nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polynucleotide Kinase</td></tr><tr><td>SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene DNA Ladder 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>C-Strand Probe (3&#039;-(G3AT2)4-&#039;5)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Custom ordered DNA oligonucleotide</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radioisotope</td></tr><tr><td>Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>For purification of readioactive oligo probe</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>non-ionic synthetic polymer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment/Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Nylon mesh, 50, 12&quot; x 12&quot;</td><td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor Screen Exposure Cassette</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Hybridzation Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Cylindrical hybridization tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>The Belly Dancer orbital shaker</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>For imaging of gels and phosphor screens</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad</td><td>Version 6.05</td><td>Graphing Program</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>Spreadsheet program</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td><td>Spectrophotometer</td></tr></tbody></table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

Ci sono diverse tecniche per misurare la lunghezza del telomere, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. L&#39;approccio tradizionale, l&#39;analisi del frammento di restrizione di Telomere (TRF), utilizza una tecnica di ibridazione del DNA in cui i campioni di DNA genomici vengono digeriti con enzimi di restrizione, lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri e qualche DNA sub-telomerico. Questi sono separati dall&#39;elettroforesi del gel agarosio, trasferiti su una membrana filtrante e ibridati a sonde di oligonucleotide tagliate con chemiluminescenza o radioattività per visualizzare i frammenti di restrizione telomere. Questo approccio, pur richiedendo una maggiore quantità di DNA rispetto ad altre tecniche come la PCR, può misurare la distribuzione della lunghezza del telomere di una popolazione di cellule e consente la misurazione espresso in kilobasi assoluti. Questo manoscritto dimostra una procedura di ibridazione del DNA modificata per determinare la lunghezza del telomero. Il DNA genomico viene prima digerito con enzimi di restrizione (che non taglianoTelomeri) e separati da elettroforesi con agarosio gel. Il gel viene quindi asciugato e il DNA viene denaturato e ibridato in situ ad una sonda oligonucleotidica radiolabeled. Questa ibridazione in situ evita la perdita del DNA del telomere e migliora l&#39;intensità del segnale. Dopo l&#39;ibridazione, i gel vengono immagazzinati utilizzando schermi di fosforo e la lunghezza del telomero viene quantificata utilizzando un programma di grafica. Questa procedura è stata sviluppata dai laboratori del Dott. Woodring Wright e Jerry Shay presso l&#39;Università del Texas Southwestern 1 , 2 . Qui presentiamo una descrizione dettagliata di questa procedura, con alcune modifiche.

Sono state analizzate tre concentrazioni di DNA (1, 2 e 3 μg) isolate dalla linea cellulare BJ-hTERT (telomerasi immortalizzate di fibroblasti umane prepuntite) 22 e cellule mononucleate periferiche umane umane (PBMCs) per lunghezza telomere. La tabella 1 mostra le assegnazioni della corsia per ciascun campione di DNA. La figura 1 mostra una macchia fluorescente dell&#39;acido nucleico del gel. Gli standard di peso m...

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Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un&#39;analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere.

Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l&#39;ibridazione in gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

modified-terminal-restriction-fragment-analysis-for-quantifying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.8K Views.  University of Pittsburgh.  In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere. 

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Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

L&#39;esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal pancreatectomy, laparoscopic pancreatoduodenectomy (LPD) has not yet obtained wide acceptance, probably due to technical challenges, especially regarding the pancreatic anastomosis.
The study describes and demonstrates all steps of LPD, including the modified Blumgart pancreaticojejunostomy. Indications for LPD are all pancreatic and peri-ampullary tumors without vascular involvement. Relative contra-indications are body mass index &#62;35 kg/m2, chronic pancreatitis, mid-cholangiocarcinomas and large duodenal cancers.
The patient is in French position, 6 trocars are placed, and dissection is performed using an (articulating) sealing device. A modified Blumgart end-to-side pancreaticojejunostomy is performed with 4 large needles (3/0) barbed trans-pancreatic sutures and 4 to 6 duct-to-mucosa sutures using 5/0 absorbable multifilament combined with a 12 cm, 6 or 8 Fr internal stent using 3D laparoscopy. Two surgical drains are placed alongside the pancreaticojejunostomy.
The described technique for LPD including a modified Blumgart pancreatico-jejunostomy is well standardized, and its merits are currently studied in the randomized controlled multicenter trial. This complex operation should be performed at high-volume centers where surgeons have extensive experience in both open pancreatic surgery and advanced laparoscopic gastro-intestinal surgery.

Laparoscopic pancreatoduodenctomy (LPD) may offer advantages over open pancreatoduodenectomy, including early postoperative mobilization, less delayed gastric emptying and a shorter hospital stay. However, LPD is technically challenging and not well-standardized, especially regarding the pancreatic anastomosis. We describe a standardized technique for the pancreatic anastomosis during LPD: modified Blumgart pancreaticojejunostomy.

Pancreatoduodenectomy laparoscopica con modificate Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Ricerca sul cancro

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Genetica

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione accurata della lunghezza dei telomeri negli studi sulla popolazione umana

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esplorare l'impatto del trauma sull'invecchiamento cellulare

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Misurazione quantitativa della lunghezza dei telomeri PCR multiplex monocromatica 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Quantificazione della lunghezza dei telomeri mediante rilevamento a chemiluminescenza non radioattiva

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio della lunghezza dei telomeri TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l'ibridazione in gel

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