Name: mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq
Uploaded: 2017-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq at JoVE.com

Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione di scienza di Israele (grant 748/14), Marie Curie integrazione concedere (CIG) - 7 ° PQ-persone-20013-CIG-618763 e programma del Planning e Budgeting Comitato e The Israel Science Foundation CORE concedere n. 41/11.

tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Bar Ilan e il protocollo segue linee guida fornite dal comitato che approva gli esperimenti.
 1. purificazione di ingenuo CD4 + cellule umane e polarizzazione di cellule Th2 e T Helper 1 (Th1) Nota: Qui descriviamo la procedura a partire da cellule mononucleari del sangue periferico umano congelato (PBMCs). Il primo passo consiste nell'isolare le cellule CD4 + utilizzando microsfere e colonne che di solito dare noi più del 95% delle cellule di CD4 +. Tuttavia, questo passaggio può variare secondo il protocollo preferito in ogni laboratorio. Il protocollo per l'attivazione delle cellule T e la polarizzazione è stato modificato da Jenner et al. (2009) 18. isolamento di CD4 + cellule da 10 milioni PBMCs dà luogo a 4 milioni di cellule CD4 +. Sono diviso in due boccette e cresciuti sotto Th1 e di polarizzazione Th2 condizioni ottenendo 3 milioni cellule Th1 e Th2 in appena una settimana.
 Nota: raffreddare la centrifuga a 4 ° C prima di iniziare.
<ol><li>Scongelare 1 mL di PBMCs umano (10 7 cellule) in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di medium RPMI supplementato con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e siero bovino fetale inattivati 10%. Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con una pipetta sterile 25 mL in 15 mL di medium RPMI completato. Trasferire le cellule (con una pipetta sterile 25 mL) in un pallone di cultura T75.</li>
	<li>Lasciare le celle durante la notte in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2).</li>
	<li>Trasferire le cellule galleggiante con una pipetta sterile da 25 mL per tubo da 50 mL. Determinare il numero di cell e attuabilità di esclusione del blu di trypan.</li>
	<li>Isolare CD4 + cellule da 10 milioni vivono antiaderente PBMCs di selezione positiva utilizzando microsfere di CD4 + e colonne secondo il produttore &#39; consigli s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) con i seguenti modifiche: 10 7 PBMCs sono etichettati con 30 µ l di microsfere di CD4 in 120 µ l di 0,5% BSA in PBS.</li>
	<li>Per attivare le cellule T CD4 + per 72 h rhIL-2 (10 ng/mL), associato a piastra anti-CD3 (5 µ g/mL) e solubile anti-CD28 (2 µ g/mL). Per polarizzazione Th1, aggiungere rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Per polarizzazione Th2, aggiungere rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).</li>
	<li>Le cellule della coltura per ulteriori 7 giorni in presenza di rhIL-2 (10 ng/mL) e le stesse citochine polarizzante (rhIL-12 per Th1 e rhIL-4 per Th2).</li>
</ol> 2. Isolamento di nuclei Nota: ATAC-seq viene eseguita con i nuclei intatti. Lysis buffer contenente 0,05% nonylphenyl polietilenglicole (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) è stato calibrato per isolare nuclei da cellule umane primarie di Th1 e Th2. Si consiglia di calibrare questo passaggio con i reagenti di laboratorio e le cellule. Un eccesso di cellule intatte da detersivo insufficiente diminuisce l'efficienza della reazione di trasposizione. Efficienza di lisi delle cellule è determinata dal numero dei nuclei (cellule positive del blu di trypan) rispetto al numero totale delle cellule. 
Nota: Preparare il tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl 2). Raffreddare una centrifuga con rotore a battente-benna a 4 ° C. cubettatura le cellule in una centrifuga di swing-secchio invece di una centrifuga ad angolo fisso riduce la perdita di nuclei e delle cellule. Per evitare i nuclei o perdita delle cellule, Pipettare attentamente quando scartare il surnatante.
<ol><li>Aggiungi fresco nonylphenyl polietilenglicole (a una concentrazione finale di 0.05%) e inibitori della proteasi (a una concentrazione finale di 1 x) per il buffer di lisi freddo immediatamente prima dell'uso: 100x. Mantenere il buffer su Ice.</li>
	<li>Cellule di T totali per determinarne la quantità e la redditività mediante metodo del blu di trypan. Vitalità che è inferiore al 90% di risultati superiore non specifico digestione.</li>
	<li>Trasferimento 0,5 x 10 6 T cellule (Th1 o Th2) per microprovette da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) soluzione. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi freddo (contenente nonylphenyl polietilene glicole e inibitori della proteasi). Tenere il tubo sul ghiaccio. Pipetta delicatamente per evitare di interrompere i nuclei.</li>
	<li>Rapidamente prendere 10 µ l e contare le celle con un contatore di cellule automatizzato mentre nella microprovetta con le cellule lisate è il ghiaccio. Questo passaggio non deve superare i cinque minuti per evitare di danneggiare i nuclei. Almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisati.</li>
	<li>Continua immediatamente con la reazione di trasposizione. Mantenere i nuclei preparati sul ghiaccio.</li>
</ol> 3. Reazione di trasposizione Nota: In questo passaggio, nuclei isolati sono incubati con procariotiche Tn5 transposase (TDE1) caricato con adattatori per il sequenziamento NGS. Tn5 iperattivo, contemporaneamente, frammenti di DNA e lega adattatori in regioni accessibili del genoma (processo tagmentation). Il rapporto tra nuclei e Tn5 transposase è critico per la scissione preferenziale alla cromatina accessibile. Questo protocollo è calibrato per 100.000 nuclei in un volume di reazione 100 μL. Tuttavia, la reazione può essere ridimensionata.
<ol><li>Set temperatura in uno shaker termale a 37 ° C.</li>
	<li>Trasferire 100.000 nuclei ad una microprovetta 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 500 x g per 10 min a 4 ° C e delicatamente rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere i componenti di reazione di trasposizione dei nuclei come specificato nella tabella 1.</li>
	<li>Risospendere pipettando delicato.</li>
	<li>Incubare la reazione di trasposizione in uno shaker termale a 37 ° C per 30 min con lieve agitazione (500 giri/min). 
	Nota: Pulizia del DNA viene eseguita da fase solida reversibile immobilizzazione perline 19 (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) o colonne di purificazione di PCR. Al termine della pulizia, eluire i frammenti di DNA in 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitare di EDTA in tampone di eluizione.</li>
</ol> 4. Arricchimento di PCR delle librerie ATAC-seq Nota: questo passaggio si rivolge per amplificare i frammenti di ATAC-seq libreria cioè DNA con adattatori inseriti. Per consentire la miscelazione di diverse librerie di ATAC-seq nella stessa corsia di sequenziamento di nuova generazione (&#34; multiplexing &#34;) uso meno Primer 1 (Ad1_noMx) 1 per tutti i campioni, e una diversa indicizzati (codice a barre) 2 Primer (Ad 2.1-2.24) 1 per ogni campione. Le sequenze dell'iniettore sono fornite nell' completati Tabella di materiali/attrezzature.
<ol><li>L'amplificazione di PCR iniziale Nota: la concentrazione di lavoro di Primer 1 (Ad1_noMx) e 2 Primer è 25 µM. Tutti i primer sono diluiti da originale stock di 100 µM a 25 µM. In tutte le reazioni di PCR, utilizzare Primer 1 (Ad1_noMx) e solo uno dei 2 Primer indicizzata.
	<ol><li>Aggiungere i componenti della reazione PCR come specificato nella tabella 2 in una provetta sterile da PCR.</li>
		<li>Posto PCR tubo in un termociclatore ed eseguire l'amplificazione di PCR utilizzando i ciclismo condizioni dettagliate nella tabella 3.</li>
	</ol></li> <li>Valutazione del numero di cicli di amplificazione aggiuntiva Nota: il numero di ulteriori cicli di PCR dovrebbe produrre sufficienti quantità di libreria frammenti fo un successo sequenziamento di nuova generazione esegue, mentre ridotti al minimo per evitare GC e taglia bias 20. La determinazione del numero di cicli PCR (N) richiesti per l'amplificazione del frammento biblioteca ottimale avviene mediante PCR quantitativa (qPCR).
	<ol><li>Diluire 1 Primer (Ad1_noMx) e 2 (usato per l'amplificazione iniziale Biblioteca) da 25 µM a 6.25 µM.</li>
		<li>Aggiungere i componenti a tubi ottici di PCR o un piatto, come indicato nella tabella 4.</li>
		<li>Posto in un ciclo come specificato nella tabella 5 e strumento di qPCR.</li>
		<li>Per stimare il numero di cicli di amplificazione aggiuntiva (N), tracciare il numero di cicli sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y.</li>
		<li>Il numero di amplificazione ulteriore cicli (N) è 1/3 del numero di cicli in cui la reazione di qPCR raggiunto il plateau. Figura 2 fornisce esempi per tre librerie di ATAC-seq che raggiungessero plateau a ~ 2.350 unità relativa fluorescenza, RFU (linea verde spessa). Il numero di cicli PCR in cui un terzo dell'importo massimo (783 RFU, segnato sull'asse y) è amplificato corrisponde a 8 cicli per due delle librerie (curve di amplificazione rosso e blu) e 9 cicli PCR per la libreria terza (rosa).</li>
	</ol></li> <li>L'amplificazione di PCR finale <ol><li>amplificare il restante 45 µ l della reazione PCR. Inserire un tubo PCR contenente la reazione di amplificazione dal punto 4.1.2 in un termociclatore. Eseguire il programma PCR descritto nella tabella 6. Utilizzare il numero di determinati in precedenza (punto 4.2.5) di cicli di amplificazione (N).</li>
	</ol></li></ol> 5. Taglia selezione delle biblioteche di ATAC-Seq Nota: nella nostra esperienza, selezione della dimensione di amplificato ATAC-seq librerie migliora risultati di sequenziamento di nuova generazione perché Elimina frammenti di libreria ad alto peso molecolare dalla finale ATAC-seq biblioteca. 
Nota: Lasciare i branelli magnetici a temperatura ambiente 30 min prima dell'uso. 
Preparare fresco etanolo al 70% in acqua priva di nucleasi.
<ol><li>Risospendere i branelli magnetici mescolando.</li>
	<li>Aggiungere acqua priva di nucleasi per le librerie di ATAC-seq (ottenute al punto 4.3.1.) e portare fino a 100 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l (0.5 x) di sedimento biglie magnetiche di legame al DNA a 100 µ l di amplificato librerie. Mescolare pipettando su e giù almeno 10 volte. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. Se necessario, ruota velocemente giù le microprovette.</li>
	<li>Inserire il tubo su un appropriato supporto magnetico per 2 min separare i branelli magnetici dal surnatante. Dopo 2 minuti, trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta.</li>
	<li>Misurare il volume del surnatante pipettando e aggiungere 0,7 x di biglie magnetiche. Mix pipettando su e giù almeno 10 volte.</li>
	<li>Incubare 5 min a temperatura ambiente. Posto su un supporto magnetico per 2 min.</li>
	<li>Dopo il 2 min di incubazione, scartare il surnatante. Aggiungere 200 µ l preparata etanolo al 70% per lavare le perle mentre i tubi sono su supporto magnetico.</li>
	<li>Tenere il conetti sul magnete per 30 s e poi scartare l'etanolo. Ripetere il passaggio 5.7.for due lavaggi di etanolo finale.</li>
	<li>Rimuovere completamente le rimanenti etanolo e lasciare che asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è sul magnete. Se necessario, girare brevemente nella microprovetta. Rimuovere le tracce di etanolo con una punta di pipetta p10.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dal magnete e 22 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Non eluire le librerie di ATAC-seq in tampone contenente EDTA.</li>
	<li>Incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e poi mettete sul supporto magnetico.</li>
	<li>Quando la soluzione è limpida, trasferire una nuova microprovette sterili 20 µ l di librerie eluite.</li>
	<li>Store la dimensione selezionata ATAC-seq librerie a -20 ° C.</li>
</ol> 6. Analisi della qualità delle librerie ATAC-Seq <ol><li>convalida della qualità dell'ATAC-seq librerie di Real-Time PCR Nota: è importante valutare il rapporto segnale-rumore delle librerie ATAC-seq prima della prossima generazione sequenziamento. Questo viene fatto determinando la relativa quantità di frammenti di DNA da loci accessibile e inaccessibili mediante PCR quantitativa (qPCR). I loci inaccessibili (controllo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) sono amplificati da coppie di primer 1 e 2. I loci accessibili (controllo positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) sono amplificati da coppie di primer 3 e 4. Loci positivi e negativi sono stati definiti dai profili di accessibilità (DHS-seq) cromatina delle cellule CD4 + umane (ENCODE adesioni ENCSR000EQE ed ENCSR000EQG). Negativo iniettore 1 si trova in una grande regione intergenica heterochromatic (230 kb da TRADB2 e 88 kb da FOXD2). Regione di controllo negativo 2 è all'interno del primo introne del gene CDC73. A valle del gene di Cyclin E (CCNE1) mentre la coppia di primer positivo 4 positivo coppia di primer 3 è all'interno di una regione aperta della cromatina è centrato all'interno il promotore della proteina chinasi C substrato 80K-H (PRKCSH). D'importanza, questi loci di controllo mostrano un modello simile di accessibilità in altri tipi di cellule umane del progetto ENCODE 3, suggerendo che possono essere applicate per monitorare ATAC-seq librerie da un ampio spettro di tipi della cellula umana. Primer efficienza e specificità di tutte le coppie di primer è stata verificata da qPCR su una diluizione seriale di DNA genomic (da cellule umane Th) e un'analisi della curva di fusione dei prodotti amplificati ottenuti.
	<ol><li>Isolare DNA genomico utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature).</li>
		<li>Diluire l'ATAC-seq amplificato libreria 01:10 (1 µ l libreria + 9 µ l di acqua priva di nucleasi) e DNA genomico a ~ 5 ng / µ l.</li>
		<li>Preparare la miscela di reazione (tabella 7) per ogni coppia di primer di controllo positivi e negativi, tenendo conto che le reazioni vengono eseguite in triplice copia.</li>
		<li>Incubare in termociclatore qPCR secondo il protocollo consigliato dal fornitore di mix master qPCR.</li>
		<li>Analizzare i risultati in qPCR strumento &#39; software s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature). Scegliere il DNA genomico come un campione di controllo. I valori ottenuti rappresentano un arricchimento delle regioni accessibili (amplificati di primer di controllo positivo). Un esempio è illustrato nella tabella 8. 
		Nota: Stima della libreria di media dimensione e concentrazione: la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del DNA dalle librerie di ATAC-seq è determinata dai sistemi automatizzati elettroforesi ad alta sensibilità secondo il produttore &#39; s istruzioni. Si consiglia di misurare la concentrazione del campione su un fluorometro utilizzando kit di dsDNA ad alta sensibilità e almeno 2 µ l di ciascun campione di DNA. 
		Nota: Sequenziamento di nuova generazione - prima del funzionamento in multiplex le librerie, calcolare la molarità di ciascuna libreria di ATAC-seq utilizzando la formula: (ng / µ l x 10 6) / (660 x libreria media frammento lunghezza). Obiettivo per &#62; 30 milioni letture di ciascuna libreria di ATAC-seq per valutare la cromatina aperta regioni di campioni umani. Se si desidera determinare se la libreria è abbastanza buona per il sequenziamento NGS, inizialmente obiettivo per letture 10 milioni (5% della corsia di sequenziamento a strumento di sequenziamento del DNA in modalità di esecuzione rapida). Tenete a mente che per dedurre nucleosoma posizionamento, accoppiato-fine sequenziamento è necessaria 1.</li>
	</ol></li></ol> 7. Analisi dei risultati di sequenziamento Next-Generation ottenuti <ol><li>dedurre la qualità del sequenziamento legge controllando i file FastQC, separatamente per ogni libreria.</li>
	<li>Allineare le letture al genoma umano riferimento (Assemblea hg19) utilizzando Bowtie 21 software in ambiente Unix/Linux. Il comando è &#39; bowtie -m 1 - q -S genoma directory reads.fastq output_aligned.sam &#39;. Directory di genoma sta per la cartella dove sono memorizzati gli indici di genoma di Bowtie. Il parametro -m 1 è per non permettere che l'allineamento di letture per più di un locus nel genoma, - q è per il file di input che deve essere nel formato fastq -S è per l'output in formato SAM.</li>
	<li>Rimuovere duplicate letture utilizzando SAMtools 22 rmdup opzione in ambiente Unix/Linux. I comandi sono &#39; samtools Mostra output_aligned.sam -b -S | samtools ordinare -o-output_aligned &#62; output_aligned.bam &#39;, samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam &#39;. Il primo comando, Visualizza, cambia il formato di SAM in formato BAM che viene quindi ordinata. L'opzione di rmdup è quindi applicato il file ordinato di BAM. Opzionalmente si possono regolare le letture per il sito di inserzione del trasposone, come descritto nell'originale carta di ATAC-seq 1. Questa operazione viene eseguita utilizzando BEDtools i comandi 23 in ambiente Unix/Linux. I comandi sono &#39; bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam &#62; output_aligned _rmdup.bed &#39;, &#39; shiftBed -i genoma di output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g &#62; output_aligned _rmdup_adjusted.bed &#39;. Il primo comando, bamTobed, cambia il formato BAM in formato letto, che può quindi essere utilizzato per il comando di shiftBed. Il file di genoma è un file delimitato da tabulazioni che contiene la lunghezza di ciascun cromosoma nel genoma. Di solito viene aggiunto il file nella directory BEDtools.</li>
	<li>Eseguire chiamate di picco mediante analisi basata su modello di ChIP-seq (MACS2) 24 software nell'ambiente di Unix/Linux sul file letto spostato con i seguenti parametri: - nomodel - extsize 75-- spostamento -30. Questi parametri vengono utilizzati per regolare le letture, in modo che il sito di inserzione del trasposone è al centro di ogni lettura di sequenziamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide.">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).</li><li>Thurman, R. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo di ATAC-seq descritto qui è stato impiegato con successo per l'analisi della cromatina accessibile in cellule primarie (umano Th1, Th2 cellule e cellule di B) così come le linee di cellule in coltura (cellule di cancro al seno umane MCF10A e U261 le cellule di glioblastoma). L'applicazione di ATAC-seq per altri tipi di cellule può richiedere alcune ottimizzazione dei protocolli, soprattutto nel passaggio lisi. Se la concentrazione del detergente non ionico è troppo alto, potrebbe trattarsi di una percen...

ATAC-seq1,2 è un metodo affidabile che consente l'identificazione di regioni di cromatina aperta regolamentare3 e posizionamento nucleosoma. Questa informazione viene applicata per dedurre la posizione, identità e attività di fattori di trascrizione. Sensibilità del metodo di misurazione quantitativa delle variazioni nella struttura cromatinica permette lo studio dell'attività dei fattori della cromatina, compreso remodelers della cromatina e modificatori, come pure l'attività trascrizionale di RNA polimerasi II1. Così ATAC-seq fornisce un approccio potente e imparziale per decifrare i meccanismi che governano la regolazione trascrizionale in qualsiasi tipo di cellula di interesse. Descriviamo l'adattamento di ATAC-seq per cellule umane primarie di Th1 e Th2.
ATAC-seq, iperattivo Tn5 transposase caricato con adattatori per frammentazione del DNA di sequenziamento di nuova generazione (NGS) coppie con la codifica del DNA con adattatori (cioè, il processo di "tagmentation")1. In seguito l'amplificazione di PCR, le librerie di DNA risultante sono pronte per il sequenziamento di nuova generazione (Figura 1). Il tagmentation preferenziale della cromatina accessibile viene rilevato dall'analisi dell'arricchimento locale di letture di sequenziamento ATAC-seq.
La breve procedura sperimentale e requisito per meno materiale di partenza, rispetto al altri metodi per misurare l'accessibilità della cromatina e posizionamento nucleosomal dnasi-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, ha promosso l'uso di ATAC-seq in più sistemi biologici tra cui cellule primarie umane1,7 e campioni clinici8, così come organismi unicellulari9, piante10, mosche della frutta11 e vari mammiferi12.
L'identità della trascrizione, fattori che sono associati ai loci accessibile possono essere scoperta dalla analizzando l'arricchimento dei loro motivi di sequenza di associazione o combinando ATAC-seq con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da (sequenziamento del DNA di alto-rendimento ChIP-seq). Questo approccio ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione lineage-specifici importanti per l'ematopoiesi in mouse13. La natura imparziale e globale di ATAC-seq permette di studiare la regolazione genica negli organismi per i quali i reagenti come gli anticorpi per l'analisi di ChIP non sono disponibili. Ad esempio, variazioni di evolutive in cis-regioni regolarici sono state identificate attraverso lo studio di cellule neurali craniche della cresta da esseri umani e scimpanzé14, variazioni inerenti allo sviluppo di elementi regolatori durante primo mouse l'embriogenesi15, cambia nel panorama normativo durante un ciclo di vita di unicellulari owzarzaki c.9e l'evoluzione dei promotori e rinforzatori attraverso 20 mammifero specie12.
ATAC-seq è stato strumentale per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, così rivelando variabilità all'interno di popolazioni di cellule, che solitamente sfugge genoma studi7,16. Inoltre, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti che si verificano in condizioni di malattia, in cui i campioni sono rari nelle regioni regolatrici del DNA. Ad esempio, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nel panorama normativo durante l'insorgenza della leucemia mieloide acuta (AML)17 o Ras-driven oncogenesi11.

<table><tbody><tr><td>50 mL tubes</td><td>Lumitron</td><td>LUM-CFT011500-P</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Axygen Inc</td><td>MCT-175-C</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>25 mL serological pipettes</td><td>Corning Costar</td><td>4489</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Tissue culture flask</td><td>Lumitron</td><td>LUM-TCF-012-250-P</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Countes Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td></td></tr><tr><td>Peripheral blood mononuclear cells&amp;nbsp;(PBMC)</td><td>ATCC</td><td>&amp;nbsp;PCS&amp;shy;800&amp;shy;011</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS),&amp;nbsp;Heat Inactivated, European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>MACS CD4 microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD4 FITC</td><td>Biogems</td><td>06121-50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype Control FITC</td><td>Biogems</td><td>44212-50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 (OKT3)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>40-0037</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD28 SAFIRE Purified</td><td>Biogems</td><td>10311-25</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL4</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL12 p70</td><td>Peprotech</td><td>200-12</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)</td><td>Tonbo</td><td>40-7048</td><td></td></tr><tr><td>LEAF&amp;nbsp;Purified anti-human IFN-&amp;gamma;</td><td>BioLegend</td><td>506513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, analytical grade</td><td>Carlo Erba</td><td>479687</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>800682</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Tris, ultra pure, 99.9% pure</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol)</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Protease Inhibitors</td><td>Sigma</td><td>P2714</td><td>this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.</td></tr><tr><td>Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads</td><td>Beckman</td><td>63881</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>HyLabs</td><td>EX-GP200</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;CFX Connect Real-Time PCR&amp;nbsp;Detection&amp;nbsp;System</td><td>Bio-rad</td><td>185-5200</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>CFX Manager Software</td><td>Bio-rad</td><td>1845000</td><td></td></tr><tr><td>master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5124</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Qubit fluorometer 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Magnet for eppendorf tubes</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004527</td><td>Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.</td></tr><tr><td>Thermo-shaker</td><td>MRC</td><td></td><td>Can be from other vendors.</td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>4200 TapeStation system</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>Tape-based platform for&amp;nbsp; electrophoresis</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer name and sequence</td><td>Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ad1_noMX: 5&#039;-AATGATACGGCGACCACCGAGA&lt;br/&gt; TCTACACTCGTCGGCAGCGTC&lt;br/&gt; AGATGTG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad1-noMx: 5&#039;-P5 sequence-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.1_TAAGGCGA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.1_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.2_CGTACTAG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.2_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.3_AGGCAGAA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.3_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.4_TCCTGAGC: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.4_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.5_GGACTCCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.5_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.6_TAGGCATG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.6_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.7_CTCTCTAC: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.7_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.8_CAGAGAGG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.8_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.9_GCTACGCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.9_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.10_CGAGGCTG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACG&lt;br/&gt; AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG&lt;br/&gt; GCTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.10_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.11_AAGAGGCA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACG&lt;br/&gt; AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.11_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.12_GTAGAGGA: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACG&lt;br/&gt; AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt; CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.12_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.13_GTCGTGAT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.13_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.14_ACCACTGT: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.14_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.15_TGGATCTG: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.15_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.16_CCGTTTGT: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.16_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.17_TGCTGGGT: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.17_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.18_GAGGGGTT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.18_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.19_AGGTTGGG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.19_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.20_GTGTGGTG: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.20_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ad2.21_TGGGTTTC: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt; TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.21_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.22_TGGTCACA: 5&#039;- CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt;TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.22_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.23_TTGACCCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC&lt;br/&gt;TCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.23_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td>Ad2.24_CCACTCCT: 5&#039;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA&lt;br/&gt; GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG&lt;br/&gt;CTCGGAGATGT-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td>Ad2.24_expected index sequence read: 5&#039;-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3&#039;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F1: 5&#039;-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R1: 5&#039;-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F2: 5&#039;-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R2: 5&#039;-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F3: 5&#039;-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R3: 5&#039;-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4: 5&#039;-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R4: 5&#039;-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3&#039;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping genome-wide accessible chromatin in primary human t lymphocytes by atac-seq

Dosaggio per cromatina Transposase-accessibile con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo utilizzato per l'identificazione di regioni aperte (accessibile) della cromatina. Queste regioni rappresentano elementi di DNA regolatori (ad es., promotori, enhancers, locus control regioni, Isolatori) a cui trascrizione si legano fattori. Il paesaggio di cromatina accessibile la mappatura è un approccio potente per scoprire elementi regolatori attivi in tutto il genoma. Questa informazione serve come un approccio imparziale per scoprire la rete di fattori di trascrizione pertinenti e meccanismi della struttura della cromatina che governano programmi di espressione genica. ATAC-seq è un'alternativa robusta e sensibile alla dnasi analisi di ipersensibilità accoppiato con formaldeide-assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE-seq) per l'analisi del genoma della cromatina e sequenziamento di nuova generazione (DNasi-seq) accessibilità e per il sequenziamento di micrococcal siti sensibili nucleasi (MNase-seq) per determinare il posizionamento nucleosoma. Vi presentiamo un dettagliato protocollo di ATAC-seq ottimizzato per cellule umane primarie immuni cioè CD4 + linfociti (T helper 1 (Th1) e cellule Th2). Questo protocollo completo inizia con la raccolta delle cellule, quindi descrive la procedura molecolare di cromatina tagmentation, preparazione del campione per il sequenziamento di nuova generazione e include anche metodi e considerazioni per l'analisi computazionali utilizzati per interpretare i risultati. Inoltre, per risparmiare tempo e denaro, abbiamo introdotto misure di controllo di qualità per valutare la libreria ATAC-seq prima del sequenziamento. Importante, i principi esposti nel presente protocollo consentono il suo adattamento ad altre cellule primarie umane immuni e non immuni e linee cellulari. Queste linee guida sarà anche utile per i laboratori che non sono abili con metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Il risultato finale di questo protocollo è una libreria di ATAC-seq di in genere 3-20 ng / µ l. Quando eseguito su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature), essi mostrano la scala-come l'apparenza2 (Figura 3A). La dimensione media dei frammenti del DNA è in genere ~ 450-530 bp.
Controllo di qualità adeguat...

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Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

mapping-genome-wide-accessible-chromatin-primary-human-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

17.9K Views.  Bar-Ilan University. Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.

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An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of associated loci. In addition, the presence of specific modifications has been used to determine the position and identity non-coding functional elements such as enhancers. In recent years, chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) has become a powerful tool in determining the genome-wide profiles of individual histone modifications. However, it has become increasingly clear that the combinatorial patterns of chromatin modifications, referred to as Chromatin States, determine the identity and nature of the associated genomic locus. Therefore, workflows consisting of robust high-throughput (HT) methodologies for profiling a number of histone modification marks, as well as computational analyses pipelines capable of handling myriads of ChIP-Seq profiling datasets, are needed for comprehensive determination of epigenomic states in large number of samples. The HT-ChIP-Seq workflow presented here consists of two modules: 1) an experimental protocol for profiling several histone modifications from small amounts of tumor samples and cell lines in a 96-well format; and 2) a computational data analysis pipeline that combines existing tools to compute both individual mark occupancy and combinatorial chromatin state patterns. Together, these two modules facilitate easy processing of hundreds of ChIP-Seq samples in a fast and efficient manner. The workflow presented here is used to derive chromatin state patterns from 6 histone mark profiles in melanoma tumors and cell lines. Overall, we present a comprehensive ChIP-seq workflow that can be applied to dozens of human tumor samples and cancer cell lines to determine epigenomic aberrations in various malignancies.

Here, we describe an optimized high-throughput ChIP-sequencing protocol and computational analyses pipeline for the determination of genome-wide chromatin state patterns from frozen tumor tissues and cell lines.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible chromatin. In this paper we present an improved ATAC-seq protocol that reduces contaminating mitochondrial DNA reads. While previous ATAC-seq protocols have struggled with an average of 50% contaminating mitochondrial DNA reads, the optimized&#160;lysis buffer introduced in this protocol reduces mitochondrial DNA contamination to an average of 3%. This improved ATAC-seq protocol allows for a near 50% reduction in the sequencing cost. We demonstrate how these high-quality ATAC-seq libraries can be prepared from activated CD4+ lymphocytes, providing step-by-step instructions from CD4+ lymphocyte isolation from whole blood through data analysis. This improved ATAC-seq protocol has been validated in a wide range of cell types and will be of immediate use to researchers studying chromatin accessibility.

Here, we present a protocol to perform an assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) on activated CD4+ human lymphocytes. The protocol has been modified to minimize contaminating mitochondrial DNA reads from 50% to 3% through the introduction of a new lysis buffer.

ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Genetica

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin accessibility profiling. This technique has been useful for understanding the regulatory mechanisms of gene expression in a range of biological processes. Although ATAC-seq has been modified for different types of samples, there have not been effective modifications of ATAC-seq methods for adipose tissues. Challenges with adipose tissues include the complex cellular heterogeneity, large lipid content, and high mitochondrial contamination. To overcome these problems, we have developed a protocol that allows adipocyte-specific ATAC-seq by employing fluorescence-activated nucleus sorting with adipose tissues from the transgenic reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse. This protocol produces high-quality data with minimal wasted sequencing reads while reducing the amount of nucleus input and reagents. This paper provides detailed step-by-step instructions for the ATAC-seq method validated for the use of adipocyte nuclei isolated from mouse adipose tissues. This protocol will aid in the investigation of chromatin dynamics in adipocytes upon diverse biological stimulations, which will allow for novel biological insights.

We present a protocol for assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifically on adipocytes using nucleus sorting with adipose tissues isolated from transgenic reporter mice with nuclear fluorescence labeling.

ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a robust technique that enables genome-wide chromatin ...

CATCH-UP: A High-Throughput Upstream-Pipeline for Bulk ATAC-Seq and ChIP-Seq Data

Assay for transposase-accessible chromatin (ATAC) and chromatin immunoprecipitation (ChIP), coupled with next-generation sequencing (NGS), have revolutionized the study of gene regulation. A lack of standardization in the analysis of the highly dimensional datasets generated by these techniques has made reproducibility difficult to achieve, leading to discrepancies in the published, processed data. Part of this problem is due to the diverse range of bioinformatic tools available for the analysis of these types of data. Secondly, a number of different bioinformatic tools are required sequentially to convert raw data into a fully processed and interpretable output, and these tools require varying levels of computational skills. Furthermore, there are many options for quality control that are not uniformly employed during data processing. We address these issues with a complete assay for transposase-accessible chromatin sequencing (ATAC-seq) and chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) upstream pipeline (CATCH-UP), an easy-to-use, Python-based pipeline for the analysis of bulk ChIP-seq and ATAC-seq datasets from raw fastq files to visualizable bigwig tracks and peaks calls. This pipeline is simple to install and run, requiring minimal computational knowledge. The pipeline is modular, scalable, and parallelizable on various computing infrastructures, allowing for easy reporting of methodology to enable reproducible analysis of novel or published datasets.

ATAC-seq and ChIP-seq allow detailed investigation of gene regulation; however, processing these data types is challenging and often inconsistent between research groups. We present CATCH-UP: an easy-to-use computational pipeline that allows standardized and reproducible data processing and analysis of new and published ATAC/ChIP-seq datasets.

Assay for transposase-accessible chromatin (ATAC) and chromatin immunoprecipitation (ChIP), coupled with next-generation sequencing (NGS), have ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Isolamento dei nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo con risoluzione a singola cellula

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Autore in primo piano: Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per la profilazione dell'epigenoma e dell'espressione genica con risoluzione di una singola cellula  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Isolamento di nuclei da cellule progenitrici cardiache di topo per il profilo dell'epigenoma e dell'espressione genica a risoluzione di singole cellule

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Biologia dello sviluppo

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Biologia

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Mappatura del genoma della cromatina accessibile in linfociti T umani primari da ATAC-Seq

Riepilogo

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