Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Ministero dell'economia e competitività (MINECO) del governo di Spagna, SAF2016-78898-C2-2-R.

questo studio è stato effettuato in stretta conformità con entrambi i regolamenti spagnoli (Royal decreto 53/2013 - legge 32/2007) e orientamenti dell'Unione europea (direttiva 2010/63/UE) sull'uso di animali nella ricerca biomedica e manutenzione.
 1. Preparazione del ratto Nota: abbiamo effettuato gli esperimenti in ratti maschii di evitare cambiamenti ormonali.
<ol><li>Anesthetize l'animale utilizzando un mix di ketamina cloridrato (30 mg/kg) e xilazina cloridrato (5 mg/kg) iniettato per via intramuscolare; con questa dose, ratto dovrebbe essere anestetizzato per circa 1 h.</li>
	<li>Pizzicare il ratto &#39; punta s; assenza di un ritiro riflesso indica che l'animale è pienamente cosciente. Se il ratto risponde per il pizzico, dare l'anestesia complementare a un terzo della dose iniziale.</li>
	<li>Radere il cuoio capelluto e disinfettare l'area chirurgica con povidone-iodio.</li>
	<li>Metti l'animale su un rilievo di riscaldamento per mantenere una temperatura di 38 ° C e stabilizzare l'animale &#39; testa di s in una cornice stereotassica utilizzando due orecchio bar e un morso. Usare cautela per evitare piercing la membrana timpanica con le barre di orecchio.</li>
	<li>Proteggono gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico o siero salino per ciascun occhio.</li>
</ol> 2. Posizione di AC nell'osso temporale del ratto <ol><li>usando un bisturi praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre la superficie del cranio.</li>
	<li>Utilizzare una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente qualsiasi sangue che copre la superficie del cranio di visualizzare bregma, lambda e interaural 0 secondo l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto 22.</li>
	<li>Fare un'incisione nel muscolo temporale vicino suo inserimento dorsale sul cranio con un bisturi. Tirare il muscolo utilizzando un ago e sutura materiale e fissare il materiale di sutura alla cornice stereotassica; Questo esporrà l'osso temporale. Caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione salina sterile fredda.</li>
	<li>Inserire un ago sterile dritto nel micromanipolatore stereotassica, assicurandosi che sia completamente fissato.</li>
	<li>Abbassare lentamente l'ago fino a quando non è proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago è impostata su 0 interaural. Impostare questo punto come zero e determinarne le coordinate da questo punto.</li>
	<li>a seconda della zona del cervello di interesse, variare le coordinate stereotassica. Determinare le coordinate utilizzando l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto 22. Una volta che le coordinate sono determinate, spostare l'ago per abbinare quelle coordinate.</li>
	<li>Target l'AC utilizzando le coordinate dei seguenti quattro punti: r: A / P =-5,80 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-8,67 mm. abbassare l'ago a destra sopra l'osso temporale per visualizzare ciascuno di questi quattro punti. Usando un pennarello, segnare i punti sull'osso temporale e collegarli al fine di disegnare un rettangolo; il rettangolo servirà come guida per aprire una finestra nell'osso ( Figura 1).</li>
</ol> 3. L'esposizione chirurgica dell'AC <ol><li>Apri finestra utilizzando un trapano elettrico e un piccolo trapano bit (Ø 0,6 mm). Forare il perimetro del rettangolo a 8.000 giri/min fino a quando l'osso dà via. Raffreddare la superficie di perforazione di risciacquo con soluzione salina sterile freddo per evitare danni alle strutture subcortical. Quando l'osso dà modo, può essere rilevato un calo di resistenza. Fare attenzione a non forare il cervello.</li>
	<li>Quando i bordi sono sciolti, tirare verso l'alto l'osso di rivestimento con una pinzetta e memorizzarlo in soluzione fisiologica sterile fredda.</li>
</ol> 4. Ablazione di AC <ol><li>usando un microscopio chirurgico (10x), delicatamente tagliare le meningi con un coltello microsurgical e rimuoverli utilizzando due punte belle forcipe. Caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione salina sterile fredda.</li>
	<li>Aspirare delicatamente l'AC utilizzando un dispositivo di aspirazione chirurgico (pressione -0,24 bar) accoppiato ad un ago sterile di punta smussata 20 G. Questo punto è fondamentale e deve essere eseguita con molta attenzione: aspirare solo sei strati corticali e non la materia bianca sottostante.</li>
	<li>Aspirare fino a quando le arterie perforanti fermare emorragia.</li>
	<li>Quando l'aspirazione è finita, coprire la zona danneggiata con l'osso estratto e applicare una garza emostatica assorbibile.</li>
	<li>Lasciare il muscolo temporale recupera la sua posizione originale e poi suturare la pelle utilizzando clip ferita (9 mm). Applicare la pomata antibiotica (Vedi la Tabella materiali). Continuare ad applicare unguento alla ferita due volte al giorno per tre giorni. 
	Nota: Ogni applicazione è costituita da un sottile strato applicato sulla ferita.</li>
	<li>Buprenorfina iniettare sottocute nella parte posteriore del ratto (0,05 mg/kg) come un analgesico 1 h dopo l'intervento chirurgico e poi ogni 8 h durante 72 h.</li>
	<li>Tenere l'animale il rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia e restituirlo alla sua gabbia di alloggiamento per recuperare.</li>
	<li>Casa animali individualmente per impedire che i compagni di gabbia toccando la zona suturata e fornire alcuni elementi di arricchimento. Cambiare la segatura ogni giorno per prevenire l'infezione e controllare attentamente che l'animale recupera correttamente e non mostra segni di disagio.</li>
</ol> 5. Raccolta di tessuto Attenzione: quando si maneggia la paraformaldeide (PFA), sia solido e acquoso, indossare dispositivi di protezione individuale (PPE) e utilizzare un armadietto di sicurezza.
 Nota: preparare 750 mL di soluzione di formaldeide sciogliendo 4% (p/v) PFA in 1 x soluzione tamponato fosfato (PBS) usando il calore (55 ° C). Filtrare la soluzione di formaldeide con carta da filtro. Preparare la suoneria &#39; s soluzione sciogliendo 8,5 g di NaCl, 0,25 g di KCl e 0,2 g NaHCO 3 in 1.000 mL di acqua (soluzione di pH = 6.9).
<ol><li>Lasciare l'animale di sopravvivere per quanto è necessario per lo studio. Una volta ultimata la ricerca effettuata con il ratto ablato AC, terminali di anestetizzare tramite l'iniezione intra-peritoneale di 0,1 mL di sodio pentobarbital (60 mg/kg). Valutare la profondità dell'anestesia di pizzico di punta e l'assenza del riflesso di ritiro.</li>
	<li>Quando l'animale è anestetizzato, eseguire una perfusione intracardiaca 23 di 125 mL di Ringer &#39; s soluzione seguita da 750 mL di soluzione di formaldeide utilizzando un calibro di 1,8 mm di diametro interno.</li>
	<li>Una volta ultimata l'aspersione, decapitare ratto alla prima vertebra cervicale.</li>
	<li>Usare le forbici per togliere la pelle e muscolo dalla testa ed esporre il cranio. Usare le forbici per tagliare e aprire il foro occipitale e rimuovere la parte posteriore del cranio.</li>
	<li>Fare un trasversale tagliato l'osso orbitale usando le forbici Spencer e Pinze ossivore per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello. Fare attenzione a non danneggiare il cervello.</li>
	<li>Una volta che il cervello è esposto, rimuovere con cautela il mater di dura usando il forcipe ammenda-aguzzo. Utilizzare un dito delicatamente scoop sotto ed elevare il cervello. Alzate il cervello e tagliate i nervi until è gratuito. Immergete il cervello in soluzione di formaldeide e conservarla a 4 ° C per 24 h.</li>
</ol> 6. Localizzazione delle lesioni AC <ol><li>dopo la post-fissazione, posizionare con cura il cervello in una matrice di cervello di ratto sagittale esponendo la superficie laterale del cervello.</li>
	<li>Inserire una fotocamera 21 cm sopra la superficie della corteccia utilizzando un supporto di fotocamera, selezionare il &#34; riprese macro super &#34; modalità e scattare una foto della superficie del cervello.</li>
	<li>Mettere il cervello in una matrice di cervello di ratto coronale esponendo la superficie dorsale del cervello e scattare un'altra foto.</li>
	<li>Utilizzando un programma di editor di immagini, aprire le immagini e scalarle giù 50% per renderlo più facile lavorare con loro. Identificare il bregma, lambda e 0 interaural riferimenti sulla foto secondo Paxinos e Watson coordinate 19 e segnare la loro posizione nelle immagini ( Figura 2). Disegnare il contorno dell'ablazione sull'immagine laterale del cervello. Calcolare il perimetro.</li>
	<li>Importazione la coordinata mappa dove il primario (A1) e regioni secondarie (cortecce ventrale e dorsale) di AC sono trova 18 per il file del programma editor dove si lavora con le immagini. Clicca sulla mappa e trascinarlo per esso a sovrapporre alla fotografia laterale del cervello ablato.
	<ol><li>Rendere il bregma e riferimenti di lambda della mappa delle coordinate coincidono con i riferimenti di bregma e lambda identificati nell'immagine del cervello laterale.</li>
		<li>Utilizzare la fessura rhinal come riferimento per regolare l'immagine del cervello per la mappa e farli coincidere ( Figura 2B).</li>
	</ol></li> <li>Calcola la percentuale della lesione rispetto all'area occupata dall'AC.</li></ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Un intervento chirurgico al cervello successo dipende da due fattori: mantenere l'animale vivo durante e dopo la procedura e localizzare con precisione l'area di interesse. Garantire che il ratto è anestetizzato durante l'intervento (test del riflesso di ritiro) e riceve un'adeguata analgesici e antibiotici non ototossici dovrebbero aiutare la sopravvivenza. Il ratto, inoltre, dovrebbe essere tenuto su un rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia dall'anestesia per evitare l'ipotermia. Sutura farà diminuire la suscettibilità all'infezione, e la tecnica corretta è fondamentale: gli animali vi verrà a prendere al loro clips di ferita, così che deve essere impiantati abbastanza stretto per impedire la rimozione senza porre troppa tensione sulla ferita.
Per individuare con precisione l'AC (o qualsiasi altra area corticale), è importante determinare la posizione di bregma, lambda e interaural 0 a utilizzarli come riferimenti per calcolare i limiti della regione di destinazione. Qualsiasi errore nel calcolo delle coordinate comporterà l'ablazione parziale di AC o l'aspirazione indesiderato di altre zone circostanti. Così, la punta dell'ago deve solo toccare l'osso a interaural 0 e poi tradurre le coordinate antero-posteriore e medio-laterale secondo ciò che è descritto in questo protocollo.
In questo manoscritto, abbiamo anche descritto come chirurgicamente esporre e l'ablazione l'AC. Ci sono tre fasi critiche: il processo di perforazione, l'apertura e la rimozione di meningi e l'ablazione di aspirazione. Foratura deve essere eseguito a bassa velocità con pressione minima, come un'alta velocità di perforazione genera calore che può interessare è vicino a strutture subcortical. Tuttavia, mantenere una bassa velocità e punto di foratura con soluzione salina sterile fredda di raffreddamento dovrebbe impedire eventuali danni. Inoltre, la pressione minima è essenziale per evitare una rottura improvvisa del cranio e del conseguente pregiudizio alla corteccia sottostante. L'apertura e la rimozione delle meningi che coprono l'AC deve essere eseguite con attenzione per evitare la rottura dei vasi sanguigni. Se il sanguinamento si verifica, la prognosi precoce e tardiva è generalmente sfavorevole ed è lecito chiedersi se tale animale soddisfa i criteri di inclusione per uno studio affidabile. Si consiglia in questo caso l'eutanasia. Infine, l'aspirazione (probabilmente l'aspetto più difficile nell'esecuzione di un'effettiva lesione), deve essere limitato alla materia grigia. Ci sono due indicatori che consentono di rilevare la presenza della materia bianca: (1) un cambiamento in contrasto di colore, come la materia bianca è più luminoso rispetto alla materia grigia; e (2) la cessazione del sanguinamento dalle arterie perforanti.
Dopo qualsiasi manipolazione eseguita nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione della procedura effettuata nella corteccia per la successiva analisi e validazione dei dati ottenuti dall'animale. In questo manoscritto, dettagliamo come localizzare l'ablazione eseguita nella corteccia usando una mappa delle coordinate precedentemente descritta dal nostro gruppo di18. Questa mappa è stata costruita utilizzando riferimenti anatomici ottenuti dalle ricostruzioni sezione seriale delle sezioni istologiche, correlate con l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto22. Di conseguenza, la mappa differenzia fra il primario (A1) e cortecce secondarie (dorsale e ventrale) di AC. Il vantaggio principale di questa mappa delle coordinate è che permette la rapida localizzazione della lesione sovrapponendo una foto scattata dalla superficie laterale del cervello inserito in una matrice sagittale del cervello. Un altro vantaggio è che i laboratori con meno esperienza in anatomia possono utilizzare la mappa adattandola ai loro modelli animali. Solo è necessario impostare le distanze tra bregma, lambda e interaural 0 riferimenti in un cervello di controllo irrorato e ridimensionare la mappa verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Utilizzare la fessura Rhinal come riferimento per regolare l'immagine del cervello alla mappa. La profondità dell'ablazione non può essere determinata in questa mappa delle coordinate, così dovrebbe essere determinato nelle sezioni istologiche del cervello.
La combinazione di metodi stereotactic con l'esposizione chirurgica dell'AC sono metodi di base che potrebbero essere facilmente adattati da qualsiasi ricercatore che vuole indirizzare l'AC nel ratto. Questo potrebbe essere per un esperimento acuto o uno che richiede l'impianto di dispositivi permanenti. Inoltre, l'ablazione chirurgica di AC è stato precedentemente utilizzato come modello per studiare gli effetti di privazione cronica corticale in udienza. Ablazioni AC potrebbero essere utilizzati anche per studiare gli effetti che ablazioni unilaterali di AC esercitano in altre aree corticali, o servono come un modello del colpo. Così, i disegni sperimentali descritti qui sono metodi utili che possono essere applicate singolarmente o in combinazione ad una vasta gamma di disegni sperimentali.

Il ratto è uno dei modelli animali più comunemente usati in neuroscienze uditiva. La robustezza del suo comportamento lo rende in grado di lavorare per centinaia di prove al giorno. La sua sensibilità e acutezza spettrale per udienza1,2e l'organizzazione anatomica e funzionale del suo sistema centrale, paragonabile ad altri mammiferi3, fare il topo un modello animale adatto per analizzare una vasta gamma di temi di ricerca in neuroscienze uditiva. La corteccia uditiva di ratto (AC), in particolare, è stato oggetto di numerosi studi anatomici e fisiologici che hanno cercato di capire la sua struttura, organizzazione e ruolo nell'elaborazione del suono3. Oggi, l'AC è diventato popolare tra i neuroscienziati interessati a plasticità esperienza-dipendenza, percezione uditiva, la base sinaptica dell'organizzazione del campo recettivo e del controllo corticale dell'elaborazione del suono nel subcortical uditivo i nuclei4,5,6,7,8,9. Per affrontare le sfide che pongono questi nuovi approcci, procedure che possono individuare con precisione ed esporre chirurgicamente l'AC accelerare gli sforzi di ricerca. Stereotactic tecniche lo rendono facile da localizzare specifiche regioni all'interno del cervello senza test di fisiologia. Anche se le dimensioni del cervello varia leggermente tra gli animali, la posizione di ogni area del cervello può essere determinata utilizzando le coordinate stereotactic impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello del ratto.
L'ablazione con restrizioni di AC è la rimozione chirurgica della regione sensoriale della corteccia più direttamente correlata con problemi di udito. A differenza di altri metodi utilizzati per bloccare l'attività di AC, come raffreddamento o locale lidocaina iniezioni10,11,12, l'ablazione chirurgica dei risultati AC la cronica perdita di funzione. Così, ablazioni AC sono più adatti per studiare gli effetti a lungo termine della privazione corticale, così come i successivi fenomeni di plasticità di lesione. La combinazione di metodi stereotactic con ablazioni chirurgiche di AC è stata utilizzata con successo per studiare gli effetti fisiologici, comportamentali e molecolari del controllo corticale privazione13,14,15 ,16,17,18,19. Ad esempio, un modello del ratto con ablazioni AC bilaterale è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'ablazione corticale nel riflesso dello startle uditiva e uditive del tronco cerebrale (ABR) risposte16. Recentemente, abbiamo confrontato gli effetti che unilaterali contro bilaterale ablazioni dei prodotti del ratto AC in soglie ABR, ampiezze e latenze in diversi momenti dopo l' infortunio18. Inoltre, il modello del ratto di ablazione AC restrittiva è stato utilizzato anche per studiare l'effetto di degenerazione di via corticofugal le inferiori collicus13,14,15 e l' orecchio interno17 ,19. Dopo una tale manipolazione avviene nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Anche se molto utile, la principale limitazione di tonotopico mappe basate su risposte neuronali20,21 sono le tecniche elettrofisiologiche necessarie per individuare i campi uditivi nel cervello del ratto. Poiché non tutti i laboratori hanno l'attrezzatura necessaria e/o perizia per fare tali registrazioni, abbiamo costruito una mappa delle coordinate basata sul trasferimento dei limiti cytoarchitectural di AC a un'immagine della superficie del cervello18. Questa mappa può essere molto utile per individuare l'AC senza test di fisiologia.
Il presente protocollo descrive un metodo per la posizione stereotactically guidate, l'esposizione chirurgica e ablazione di AC in ratti. Viene inoltre descritto come utilizzare la nostra mappa delle coordinate18 per localizzare facilmente l'estensione della lesione sopra un'immagine della superficie dei cervelli ablati.

<table><tbody><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental micromotor</td><td>W&amp;amp;H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>Diamond burr</td><td>B Braun</td><td>GD021R</td><td>0.6 mm</td></tr><tr><td>Surgical suction device</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodine</td><td>Meda</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>sterile saline serum</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G sterile needle</td><td>Terumo Neolus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture material</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>Surgical needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>Spencer scissor</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsurgical knife</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable hemostatic gauze</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital rat Brain Matrix</td><td>Activational systems Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Olympus 5.1 MP</td><td>C-5060 wide zoom</td><td>lens F2.8-4.8</td></tr><tr><td>Wound clips</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>Canvas 12</td><td>ACD Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>needle gauge</td><td></td><td></td><td>diameter 1.8 mm</td></tr><tr><td>Separatory funnel</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GluA2 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td></tr><tr><td>GluA3 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

La corteccia uditiva di ratto (AC) sta diventando popolare tra gli investigatori di neuroscienze uditiva che sono interessati a plasticità esperienza-dipendenza, processi percettivi uditivi e controllo corticale di elaborazione nei nuclei uditivi subcorticali del suono. Per affrontare nuove sfide, una procedura per individuare con precisione e chirurgicamente esporre la corteccia uditiva sarebbe accelerare questo sforzo di ricerca. Neurochirurgia stereotassica è usata ordinariamente in ricerca pre-clinica in modelli animali per attecchire un ago o un elettrodo ad una posizione pre-definita all'interno della corteccia uditiva. Nel protocollo seguente, usiamo metodi stereotactic in modo inedito. Identifichiamo i quattro punti di coordinate sulla superficie del temporal bone del ratto per definire una finestra che, una volta aperto, accuratamente espone sia il primario (A1) e secondario (dorsale e ventrale) cortecce del AC. utilizzando questo metodo, quindi eseguiamo un chirurgico ablazione di AC. Dopo una tale manipolazione viene eseguita, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Così, inoltre descriviamo un metodo per individuare facilmente l'autopsia di ablazione AC utilizzando una mappa delle coordinate costruita trasferendo i limiti cytoarchitectural di AC alla superficie del cervello. La combinazione della posizione stereotactically-guida e l'ablazione di AC con la localizzazione della zona danneggiata in un post mortem delle coordinate mappa facilita la convalida delle informazioni ottenute dall'animale e conduce ad una migliore analisi e comprensione dei dati.

Abbiamo effettuato una posizione stereotactically guidate, l'esposizione chirurgica e ablazione unilaterale di AC in tre ratti Wistar. La localizzazione della lesione ha confermato che ablazioni eseguite nei tre ratti ha invaso le principali suddivisioni di AC (cortecce primarie, dorsale e ventrale) e comprende una gamma di 80 al 100% dell'area totale di AC (Figura 2B).
Il protocollo descritto qui per eseguire ablazioni AC restrittive è stato utilizzato in precedenza nel nostro laboratorio per studiare gli effetti a lungo termine della privazione di controllo corticale nei nuclei uditivi subcorticali, così come i successivi fenomeni di plasticità. In questi studi, il protocollo di ablazioni di AC è stato convalidato applicando fisiologico (ABR), comportamentali (startle risposte, prepulse inibizione; PPI) e molecolari (DNA microarrays, qPCR e Western Blot) metodi13,14,15,16,17,18,19. Qui, per dimostrare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo lasciato tre ratti AC ablazione sopravvivere per una settimana, e raccolti le coclee durante l'accumulazione del tessuto passo per studiare i cambiamenti nell'espressione delle subunità AMPA più rilevanti presenti nella coclea adulta , GluA2 e GluA3, di qPCR. Il confronto tra le trascrizioni da AC ablazione ratti e animali di controllo sham dove tutto il processo di chirurgia ma non l'ablazione corticale è stato effettuato ha mostrato una down-regulation per GluA2 e un su-regolamento per GluA3 a due coclee (Figura 3) , che è in accordo con il nostro precedente studio19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figura 1: immagini dell'osso temporale del ratto alle tre diverse fasi chirurgiche. (A) trasferimento delle coordinate stereotassiche di AC all'osso temporale. Le coordinate dei quattro punti sono: r: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-8,67 mm. (B) le coordinate vengono utilizzate come riferimento per disegnare un rettangolo sulla superficie dell'osso temporale che guiderà l'apertura di una finestra. (C) Mostra la finestra aperta nell'osso dopo la foratura. Le meningi con vasi sanguigni possono essere osservate sulla superficie del cervello. R: rostrale, d: dorsale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figura 2: procedura per l'individuazione di lesioni nel cervello del ratto. (A) fotografia della superficie dorsale di un cervello di AC ablazione con aghi stereotactically impiantati in Lambda e Bregma (secondo Paxinos e Watson coordinate19). Linee tratteggiate segnare la posizione di Bregma e Interaural 0 nella griglia 9 x 9 cm, così come la superficie dorsale del cervello. (B) fotografia della superficie laterale del cervello ablato sovrapposto alla mappa delle coordinate di AC. Il perimetro della lesione è etichettato in rosso nella foto. Il perimetro dell'area di AC è etichettato in nero nella mappa. In questo esempio, la percentuale di ablazione AC rispetto all'area totale occupata dall'AC è 84,79%. AC: corteccia uditiva, IA: inter aural, FR: Rhinal fenditura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figura 3: cambiamenti nei livelli di mRNA di subunità del recettore AMPA GluA2 e GluA3 dopo post-lesione unilaterale del di 7 giorni di AC ablazioni. Risultati sono presentati come media ± deviazione standard del cambiamento di piega. Modifiche per GluA2 trascrizioni sono rappresentate in blu. Cambiamenti per le trascrizioni GluA3 sono presentati in rosso. Una diminuzione significativa in GluA2 e un aumento in GluA3 è osservati in due coclee (ipsi - e controlaterale l'ablazione) relativi comandi finti con nessun ablazioni corticale a 7 giorni dopo l'intervento chirurgico; Questo è in accordo con i nostri precedenti risultati19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

Descriviamo un metodo per la posizione stereotactically-guida, l'esposizione e l'ablazione della corteccia uditiva in ratti. La localizzazione dell'ablazione è valutata usando un post mortem delle coordinate mappa.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

JoVE Journal

Behavior

11.5K Views.  University of Salamanca. Descriviamo un metodo per la posizione stereotactically-guida, l'esposizione e l'ablazione della corteccia uditiva in ratti. La localizzazione dell'ablazione è valutata usando un post mortem delle coordinate mappa.

Video: Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

FMRI simultanea ed Elettrofisiologia nel cervello roditori

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Ricerca

Neuroscienze

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer scale. However, current methods mostly rely on tethered cable recordings or only use unidirectional systems, allowing either recording or stimulation of neural activity, but not at the same time or same target. Here, a new wireless, bidirectional device for simultaneous multichannel recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats is described. The system operates through a single portable head stage that both transmits recorded activity and can be targeted in real-time for brain stimulation using a telemetry-based multichannel software. The head stage is equipped with a preamplifier and a rechargeable battery, allowing stable long-term recordings or stimulation for up to 1 h. Importantly, the head stage is compact, weighs 12 g (including battery) and thus has minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire, making the method applicable to a broad set of behavioral tasks. Moreover, the method has the major advantage that the effect of brain stimulation on neural activity and behavior can be measured simultaneously, providing a tool to assess the causal relationships between specific brain activation patterns and behavior. This feature makes the method particularly valuable for the field of deep brain stimulation, allowing precise assessment, monitoring, and adjustment of stimulation parameters during long-term behavioral experiments. The applicability of the system has been validated using the inferior colliculus as a model structure.

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A wireless, bidirectional system for multi-channel neural recordings and stimulation in freely behaving rats is introduced. The system is light and compact, thus having minimal impact on the animal&#180;s behavioral repertoire. Moreover, this bidirectional system provides a sophisticated tool to assess causal relationships between brain activation patterns and behavior.

Una connessione Wireless, interfaccia bidirezionale per registrazione In Vivo e la stimolazione dell'attività neurale a comportarsi liberamente ratti

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Comportamento

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

La chirurgia stereotassica della lesione eccitotossico di specifiche aree cerebrali nel ratto adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microelettrodo guidata impianto di elettrodi nel subtalamico Nucleo di Ratti per lungo termine stimolazione cerebrale profonda

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...

Concurrent Recording of Co-localized Electroencephalography and Local Field Potential in Rodent

Although electroencephalography (EEG) is widely used as a non-invasive technique for recording neural activities of the brain, our understanding of the neurogenesis of EEG is still very limited. Local field potentials (LFPs) recorded via a multi-laminar microelectrode can provide a more detailed account of simultaneous neural activity across different cortical layers in the neocortex, but the technique is invasive. Combining EEG and LFP measurements in a pre-clinical model can greatly enhance understanding of the neural mechanisms involved in the generation of EEG signals, and facilitate the derivation of a more realistic and biologically accurate mathematical model of EEG. A simple procedure for acquiring concurrent and co-localized EEG and multi-laminar LFP signals in the anesthetized rodent is presented here. We also investigated whether EEG signals were significantly affected by a burr hole drilled in the skull for the insertion of a microelectrode. Our results suggest that the burr hole has a negligible impact on EEG recordings.

This protocol describes a simple method for concurrent recording of co-localized electroencephalography (EEG) and multi-laminar local field potential in an anesthetized rat. A burr hole drilled in the skull for the insertion of a microelectrode is shown to produce negligible distortion of the EEG signal.

Registrazione simultanea di co-localizzato elettroencefalografia e potenziali di campo locale nel roditore

Although electroencephalography (EEG) is widely used as a non-invasive technique for recording neural activities of the brain, our understanding of the ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

In vivo Positron Emission Tomography to Reveal Activity Patterns Induced by Deep Brain Stimulation in Rats

Deep brain stimulation (DBS) is an invasive neurosurgical technique based on the application of electrical pulses to brain structures involved in the patient&#39;s pathophysiology. Despite the long history of DBS, its mechanism of action and appropriate protocols remain unclear, highlighting the need for research aiming to solve these enigmas. In this sense, evaluating the in vivo effects of DBS using functional imaging techniques represents a powerful strategy to determine the impact of stimulation on brain dynamics. Here, an experimental protocol for preclinical models (Wistar rats), combined with a longitudinal study [18F]-fluorodeoxyclucose positron emission tomography (FDG-PET), to assess the acute consequences of DBS on brain metabolism is described. First, animals underwent stereotactic surgery for bilateral implantation of electrodes into the prefrontal cortex. A post-surgical computerized tomography (CT) scan of each animal was acquired to verify electrode placement. After one week of recovery, a first static FDG-PET of each operated animal without stimulation (D1) was acquired, and two days later (D2), a second FDG-PET was acquired while animals were stimulated. For that, the electrodes were connected to an isolated stimulator after administering FDG to the animals. Thus, animals were stimulated during the FDG uptake period (45 min), recording the acute effects of DBS on brain metabolism. Given the exploratory nature of this study, FDG-PET images were analyzed by a voxel-wise approach based on a paired T-test between D1 and D2 studies. Overall, the combination of DBS and imaging studies allows describing the neuromodulation consequences on neural networks, ultimately helping to unravel the conundrums surrounding DBS.

In vivo Positron Emission Tomography to Reveal Activity Patterns Induced by Deep Brain Stimulation in Rats

We describe a preclinical experimental method to evaluate metabolic neuromodulation induced by acute deep brain stimulation with in vivo FDG-PET. This manuscript includes all experimental steps, from stereotaxic surgery to the application of the stimulation treatment and the acquisition, processing, and analysis of PET images.

In vivo Tomografia ad emissione di positroni per rivelare i modelli di attività indotti dalla stimolazione cerebrale profonda nei ratti

Deep brain stimulation (DBS) is an invasive neurosurgical technique based on the application of electrical pulses to brain structures involved in the ...

Implanting a Wireless Bidirectional Microelectrode System in a Rat Brain

Source: Melo-Thomas, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56299">A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a procedure for implanting a wireless bidirectional multichannel electrode unit into a rat brain to record and stimulate multichannel neural networks.

Impianto di un sistema di microelettrodi bidirezionali wireless in un cervello di ratto

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

A Stereotactically Guided Ablation Technique for Auditory Cortex Removal in Rats

Source: Lamas, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56429">Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a stereotactically-guided surgical procedure for ablating the auditory cortex in a rat. The steps include identifying anatomical landmarks in an anesthetized rat secured in a stereotactic frame, creating a window on the skull above the auditory cortex, aspirating the cortical layers, and providing post-operative care to assess the impact of the ablation on sound processing.

Source: Lamas, V., et al. Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain.&#160;J. Vis. Exp. ...

Stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

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