La cristallizzazione delle proteine è il processo per ottenere una forma solida reticolo di una proteina. Questi cristalli sono particolarmente preziosi per i biologi strutturali, assistendo nello studio della funzione proteica. Altre tecniche, come le specifiche di massa o SDS-PAGE, possono solo fornire informazioni sulla struttura unidimensionale delle proteine. La cristallizzazione delle proteine è completata dalle tecniche di espressione proteica ricombinante e diffrazione a raggi X. Questo video mostrerà i principi della cristallizzazione delle proteine, una procedura di laboratorio generale e molte delle sue applicazioni in campo biochimico.

Il primo passo richiesto nel processo è quello di ottenere quantità di milligrammi di proteine molto pure, in genere utilizzando l'espressione proteica ricombinante. Il gene corrispondente alla proteina di interesse viene clonato in un vettore di espressione e la proteina espressa viene fusa in un tag di affinità, come la poli-istidina, per aiutare nella purificazione mediante cromatografia di affinità. Per saperne di più, guarda il video di questa raccolta sulla cromatografia di affinità.

La formazione della proteina purificata in cristalli dipende dalla corretta combinazione di molti fattori, tra cui pH, forza ionica, concentrazioni di precipitante e proteine, temperatura e velocità di equilibrio. Il metodo più comune utilizzato è la diffusione del vapore, di cui esistono due categorie: goccia sospesa e goccia seduta. Una goccia contenente proteine pure, tampone e precipitante, che è un solido ionico che lega le molecole d'acqua, riducendo la disponibilità di acqua per la proteina e imitando una maggiore concentrazione proteica, si trova in un microwell chiuso con un serbatoio con una miscela più altamente concentrata dello stesso tampone e precipitante. All'inizio, le concentrazioni di proteine e precipitanti sono troppo basse per causare la cristallizzazione. Durante il corso dell'esperimento, l'acqua vaporizza dalla goccia e si raccoglie nel serbatoio; una diminuzione della quantità di acqua nella goccia fa sì che il sistema diventi supersaturo e può verificarsi la nucleazione, seguita dalla cristallizzazione. Il trasferimento netto di acqua dalla goccia è in equilibrio e il sistema viene mantenuto fino al completamento del processo.

Per visualizzare la struttura 3D, viene utilizzata la diffrazione a raggi X. Per ottenere dati a raggi X da un cristallo, viene posto in un fascio di raggi X monocromatico, dove è esposto al fascio a tutti gli angoli. Ogni esposizione fornisce un'immagine, in cui ogni punto è una radiografia diffratta, che emerge dal cristallo e viene registrata da un rilevatore. I dati sono combinati per produrre un modello della disposizione degli atomi all'interno del cristallo. La struttura cristallina risultante dimostra il posizionamento tridimensionale degli atomi, con una risoluzione tipica di 2 angstrom.

Ora che abbiamo coperto i principi della cristallizzazione delle proteine, diamo un'occhiata a un protocollo generalizzato.

Per iniziare la procedura un vettore di espressione contenente il gene di interesse viene trasformato in cellule. Le cellule vengono incubate e nella fase mid-log, l'espressione viene avviata aggiungendo un induttore, come IPTG, che innesca la trascrizione dell'mRNA del gene. Dopo l'espressione proteica, il materiale grezzo viene sospeso in un tampone di lisi e quindi chiarito mediante centrifugazione.

Il lisirato chiarificato viene quindi caricato su una colonna di nichel e la proteina marcata con poliistidina si lega alla colonna mentre tutte le altre biomolecole vengono lavate via.

Una volta ottenuti diversi milligrammi di proteina pura, è pronto per la cristallizzazione mediante diffusione del vapore. Un vassoio a goccia sospeso / seduto a 24 pozzetta è riempito con concentrazioni variabili di soluzioni tampone di cloruro di sodio e acetato di sodio. Per il metodo della goccia seduta, volumi uguali di proteine e soluzione di serbatoio vengono pipettati sul ripiano sopra ciascun pozzo, quindi il vassoio viene coperto con nastro trasparente. Il vassoio viene quindi posto in una camera di incubazione e i pozzedi vengono monitorati per la crescita il giorno seguente, quindi ogni pochi giorni.

Una volta ottenuto un cristallo adeguato, è pronto per l'analisi della diffrazione a raggi X. Il cristallo è montato su un goniometro per posizionare il cristallo agli orientamenti selezionati. Il cristallo è illuminato con un fascio monocromatico di raggi X a tutti gli angoli, producendo un modello di diffrazione. Il software converte le immagini bidimensionali, scattate con diversi orientamenti, in un modello tridimensionale della densità degli elettroni all'interno del cristallo determinando le posizioni degli atomi nel cristallo.

Ora che abbiamo esaminato una procedura, esaminiamo alcune utili applicazioni della cristallizzazione delle proteine e un'altra tecnica di cristallizzazione.

La cristallizzazione delle proteine può essere utilizzata per la progettazione di farmaci in silico. La struttura tridimensionale della proteina base 2 della polimerasi del virus dell'influenza, che è stata collegata all'infezione virale nei mammiferi, è stata determinata dalla cristallizzazione e dalla diffrazione a raggi X. Vengono visualizzati potenziali siti di legame nella proteina e, con l'uso di un programma di aggancio, è stata progettata una molecola tridimensionale che si inserirebbe in una fessura nella proteina.

Anche la co-cristallizzazione di complessi proteina-DNA è una tecnica utile. Le proteine leganti il DNA modulano un'ampia varietà di funzioni biologiche come la trascrizione e la polimerizzazione del DNA e la riparazione del DNA; e le strutture cristalline di questi complessi possono fornire informazioni sulla funzione, sul meccanismo e sulla natura dell'interazione specifica. La proteina E. coli SeqA, un regolatore negativo della replicazione del DNA, è stata co-cristallizzata con DNA emimetilato.

Le proteine di membrana integrali come i recettori accoppiati alla proteina G, o GCPR, sono difficili da cristallizzare a causa della loro quantità limitata di superficie polare disponibile per la formazione di contatti reticolari cristallini, che ha portato allo sviluppo della cristallizzazione proteica assistita da proteine di fusione. I geni che codificano per il recettore adrenergico β2, un GCPR e un lisozima sono stati inseriti in un vettore di espressione. La cristallizzazione della proteina di fusione β2AR-lisozima è stata ottenuta a causa dell'aumento della superficie idrofila extracellulare sul β2AR naturalmente idrofobo, fornito dal lisozima, necessario per formare interazioni di imballaggio nel reticolo cristallino.

Hai appena visto il video di JoVE sulla cristallizzazione delle proteine. Questo video ne descrive i principi, un protocollo generalizzato e alcuni dei suoi usi in campo biomedico. Grazie per l'attenzione!