Name: quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia del Giappone (KAKENHI) a K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) e una sovvenzione per lo studio del progetto di malattia intrattabile dal Ministero dell'economia Salute, lavoro e Welfare (K.Y. n. 201510032A). Ringraziamo il gruppo Esposito (www.edanzediting.com/ac) per la modifica di un progetto di questo manoscritto.

Consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Indossare guanti per ridurre al minimo la contaminazione del campione di pelle-derivato SM. Il presente protocollo è stato applicato alle cellule HeLa sviluppate in minimo essenziale supplementato dell'Aquila con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1.000 U/L penicillina e streptomicina 100 mg/L.
1. preparazione dei campioni del lipido
Nota: È importante che tutte le Vetrerie artistiche tra cui provette con tappo a vite in Teflon-foderato essere privo di detersivo.
<ol><li>Estrazione della frazione lipidica totale da omogeneato cella utilizzando il metodo Bligh & Dyer7<ol>
<li>Rimuovere la cultura (o condizionata) media dalla piastra di coltura di tessuto di 10 cm e sciacquare due volte con 6 mL di PBS ghiacciata.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata nella piastra di coltura del tessuto 10 cm mediante pipetta P1000. Raccogliere le cellule con raschietti di cella e raccogliere in tubi di plastica siliconate 2,0 mL.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione (1.000 × g, 5 min, 4 ° C), è necessario eliminare il surnatante mediante una pipetta P1000.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di metanolo. Vortice tubi brevemente e Sonicare a 200 W per 5 min in un sonicatore bagno-tipo. Nota: Regolare il livello dell'acqua in un sonicatore bagno-tipo in modo che il pellet cellulare in modo efficiente è omogeneizzato.</li>
		<li>Trasferire l'omogenato di cella in metanolo mediante pipetta in provette (13 x 100 mm) con tappo a vite Teflon-allineato.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di metanolo, 1 mL di cloroformio, 0,8 mL di acqua distillata doppia e 50 µ l di 10 µmol/L di standard interno d18:1 /(D31)-16:0 SM in ogni provetta.</li>
		<li>Vortice provette vigorosamente per 5 min a temperatura ambiente. Nota: A questo punto, una sola fase (cloroformio/metanolo/acqua = 1/2/0,8 (v/v/v)) è formata.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di cloroformio e 1,0 mL di acqua distillata doppia.</li>
		<li>Tubi di vortice vigorosamente a 2.500 rpm per 5 min a temperatura ambiente. Nota: A questo punto, l'acquoso fase (superiore) e la fase organica (inferiore) è separato.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), raccogliere e trasferire la fase inferiore in provette monouso (fase iniziale inferiore). Nota: Raccogliere la fase inferiore utilizzando una pipetta di Pasteur e di un filtro di pipetta di sicurezza. Inserire la punta della pipetta nella fase inferiore, comprimere il bulbo piccolo accanto la valvola 'E' di fornire la fase superiore e lanugine interfacciale dentro la punta della pipetta e poi sifone la fase inferiore nella pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di cloroformio nelle provette e vortexare i tubi vigorosamente a 2.500 rpm per 5 min a temperatura ambiente per sufficientemente mescolare con la fase superiore e lanugine interfacciale.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione (2.150 × g, 5 min, 25 ° C), raccogliere e trasportare la fase inferiore modificata nelle provette di vetro monouso con la fase iniziale inferiore come descritto nel passaggio 1.1.10.</li>
		<li>Posizionare i tubi di vetro sotto un flusso di azoto e rimuovere completamente i solventi organici nella fase inferiore raccolta.</li>
		<li>Ricostituire i campioni con 500 µ l di metanolo o etanolo, filtrato con un filtro di 0,02-µm e memorizzare in fiale di vetro a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione del campione per costruire la curva di calibrazione e la validazione del metodo<ol>
<li>Aggiungere 50 µ l di 0,1, 0,5, 1, 5, 10 o 50 µmol/L del composto standard (d18:1 /(D9)-18:1 SM) in provette con tappo a vite Teflon-allineato.</li>
		<li>Aggiungere cella omogeneato in ogni provetta e aggiungere 1 mL di metanolo. Nota: La quantità di omogenato di cella come una matrice varia secondo ogni esperimento. Se le specie di SM nei campioni derivati da cellule in un piatto di 10 cm cultura ordinariamente sono analizzate, la quantità di omogenato di cella in ogni provetta dovrebbe essere simile a quello delle cellule in una piastra di coltura di 10 cm.</li>
		<li>Estrarre la frazione lipidica totale come descritto nella procedura 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Preparare il controllo qualità (QC) campioni per la convalida del metodo, come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.3. Preparare i campioni con differenti concentrazioni di standard composto tre-QC (d18:1 /(D9)-18:1 SM): uno all'interno di 3 x il limite inferiore della curva standard (QC-basso, QC-L), uno vicino al centro (QC-middle, QC-M) e uno vicino al confine superiore della curva standard (QC-alta, QC-H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. SM analisi mediante LC-ESI-MS/MS
<ol><li>Preparazione della fase mobile<ol>
<li>Mescolare i solventi (acetonitrile/metanolo/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) per la fase acquosa e isopropanolo per la fase organica) in bottiglie di vetro con tappi a vite Teflon-allineato e Sonicare per 5 min in un sonicatore bagno-tipo.</li>
		<li>Aggiungere acido formico (concentrazione finale 26,4 mmol/L) e NH4OH (14,9 mmol/L) in ogni fase mobile.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi qualitativa di SM da LC-ESI-MS3<ol>
<li>Attivare il sistema di cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni, mettere i tubi di aspirazione in bottiglie di vetro contenenti fasi mobili e pulire le linee di HPLC. Collegare una colonna HPLC di18 C (1,5 mm i.d. × 100 mm lunghezza, particella 3.0 µm) per il sistema HPLC, mantenere la temperatura nel forno a colonna a 50 ° C e condizionare la colonna con la fase mobile acquosa a 100 µ l/min., mettere i campioni in un rack di campione nella autosampl er.</li>
		<li>Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica per analisi di3 MS come elencato nella tabella 1 e tabella 2 così come il precursore di primo e secondo gli ioni delle specie di interesse SM e triplo quadrupolo.<ol>
<li>Fare doppio clic sull'icona del software per l'acquisizione dati, fare doppio clic su 'Configurazione Hardware', selezionare 'LC + QTRAP4500 + valvola' e fare clic su 'Attiva profilo'.</li>
			<li>Creare una nuova sottocartella facendo clic su 'Nuovo sottoprogetto' e 'OK'.</li>
			<li>Fare clic sulla scheda 'file', selezionare 'Nuovo' e selezionare 'Acquisizione Metodo' e 'OK'. Clicca sull'icona 'Spettrometro di massa' e 'MS' scheda selezionare Scan tipo come 'MS/MS/MS (MS3)', velocità di scansione come Da 10.000/s, polarità come 'Negativo' e 'Durata' come tutto il tempo per essere analizzati (min). Impostare il m/z del 'Start (Da)' e 'Stop (Da)' come l'intervallo da analizzare. Impostare il m/z degli ioni del precursore di 1a e 2a del bersaglio specie di SM di interesse. Nota: Per analizzare più specie di SM, evidenziare la '-MS3' icona, fare clic destro, selezionare 'Copia questo esperimento' e poi mettere la m/z degli ioni del precursore 1 ° e 2 ° di altre specie di SM.</li>
			<li>Selezionare la scheda 'Avanzate MS' e impostare ogni parametro come segue: modalità di scansione come 'Profilo', dimensioni di passaggio come 0,12 (Da), risoluzione Q1 e Q3 'Unità' e 'Illuminato', rispettivamente, soglia di intensità come 0, tempo di impostazione come 50 (ms), pausa tra intervalli di massa come 1,5 ms, selezionare ' dinamica riempire il tempo ', Q3 barriera all'ingresso come 8 V e il tempo di eccitazione come 25 ms.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante 'Modifica parametri' nella scheda 'MS' e selezionare 'origine/Gas' Tab. impostare i parametri della tenda gas, gas di collisione, ionspray tensione, temperatura, ione fonte gas1 e gas2 come elencato nella tabella 1. Quindi selezionare la scheda 'Compound' impostare i parametri del declustering potenziale, potenziale ingresso, energia di collisione, energia di eccitazione e l'energia di collisione diffondere come elencato nella tabella 2.</li>
			<li>Evidenziare 'Valvola integrata Valco' e selezionare 'Posizione nome per passo 0' come A impostare 'B' come posizione per totale tempo 5,0 min. Anche impostare 'A' come posizione per totale tempo 70,0 min.</li>
			<li>Evidenziare 'Shimadzu LC sistema'. Selezionare la scheda 'Pompa' e impostare la modalità di pompaggio come flusso binario, flusso totale come 0,28 mL/min e massimo di limiti di pressione come 20.0 MPa. Selezionare la scheda 'Autocampionatore' e impostare il volume di risciacquo fino a 200 µ l, ago colpo come 52mm, risciacquo velocità come 35 µ l/s, velocità come 5,0 µ l/s di campionamento, eliminare tempo come 25,0 min, sciacquare tuffo tempo come 5 s e modalità di risciacquo come 'Prima e dopo l'aspirazione'.<ol>
<li>Inoltre, attivare il refrigeratore, impostare la temperatura di raffreddamento fino a 4 ° C e la corsa di ago flacone di controllo come 52 mm. Selezionare la scheda 'Forno', abilitare il forno e impostare la temperatura del forno e la temperatura massima di 50 ° C e 85 ° C, rispettivamente.</li>
				<li>Selezionare la scheda 'Controller' e spunta la casella 'Accendere'. Selezionare la scheda 'Time Program' e impostare come segue i gradienti di solventi: solventi A / B con un rapporto di 100/0 per 5 min, programma lineare alterazioni a 80/20 in 4 minuti, fino a 35/65 in 50 minuti e a 25/75 in seguito oltre 1 min. , li tengono a 25/75 per 10 min, poi linearmente a 100/0 oltre 4 min. Quindi salvare il metodo.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Creare file batch<ol>
<li>Fare doppio clic sull'icona 'Costruire acquisizione Batch', fare clic su 'Aggiungi Set', 'Aggiungi Samples', impostare il numero di nuovi campioni e fare clic su 'OK'.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante ' Method Editor' e selezionare il metodo da utilizzare. Se più metodi sono utilizzati in un file batch, selezionare la casella di 'Uso più metodi' e selezionare il metodo di acquisizione per ogni campione. Rinominare ' campione ', impostare il numero appropriato per 'Flaconcino posizione' e mettere la quantità di volume di iniezione. Quindi salvare il file batch.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ottenere il prodotto di3 MS ione spettri delle specie di interesse SM di analisi LC-ESI-MS3<ol>
<li>Selezionare la scheda 'Invia' in file batch, evidenziare la riga di campioni da analizzare e fare clic sul pulsante 'Invia'.</li>
			<li>Scegliere il ' vista que ', 'Equilibrato' icona, selezionare il metodo di acquisizione da utilizzare, impostare ora come 1 min e fare clic su 'OK'.</li>
			<li>Disattivare 'Strumenti di riserva per Tuning' facendo clic sull'icona corrispondente. Quindi eseguire sequenza batch facendo clic sull'icona 'Avvia Sample'.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Assegnare ogni MS3 spettri di ioni prodotto della ESM confrontando la massa per caricare il rapporto (m/z) del prodotto spettri dello ione e la massa esatta della sfingoide LCB e N-frazione dell'acilico di interesse. Determinare il numero di atomi di carbonio e doppia obbligazioni nello sfingoide LCB e N-frazione di acil secondo gli ioni prodotto corrispondente.<ol>
<li>Verificare che sia selezionata la cartella appropriata sotto-progetto, quindi fare doppio clic sull'icona 'Apri File di dati' e selezionare i campioni da analizzare. Trascinare il picco nel cromatogramma per ogni specie di SM di destinazione e quindi fare doppio clic. Saranno presentati gli ottenuti spettri dello ione prodotto di3 MS entro l'area trascinata.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi quantitativa di SM da LC-ESI-MS/MS<ol>
<li>Impostare le fasi mobili e colonna HPLC come descritto al punto 2.1 e 2.2.1.</li>
		<li>Impostare i parametri del sistema di spettrometria di massa quadrupolo lineare trappola ionica per monitoraggio analisi (MRM) come indicato nella tabella 1 e tabella 2multiple della reazione e triplo quadrupolo.<ol>
<li>Effettuare le procedure come descritto al punto 2.2.2.1 e 2.2.2.2.</li>
			<li>Fare clic sulla scheda 'file', selezionare 'Nuovo' e selezionare 'Acquisizione Metodo' e 'OK'. Clicca l'icona 'Spettrometro di massa' e 'MS' scheda selezionare Scan tipo come 'MRM', 'Positivo' la polarità. Impostare 'Durata' come tutto il tempo per essere analizzati. Impostare il m/z [M + H]+ e 184 come 'Q1 massa (Da)' e 'Q3 massa (Da)' del bersaglio specie di SM di interesse, rispettivamente. Impostare 'Tempo' come 10 ms e 'ID' come il nome della destinazione specie di SM.</li>
			<li>Selezionare la scheda 'Avanzate MS' e impostare ogni parametro come segue: entrambi la risoluzione Q1 e Q3 come 'Unit', soglia di intensità come 0, impostazione ora come 0 (ms) e pausa tra intervalli di massa come 5 ms.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante 'Modifica parametri' nella scheda 'MS' e selezionare la scheda ' Origine/Gas' inserire il parametro di tenda gas, gas di collisione, ionspray tensione, temperatura, ione fonte gas1 e gas2 come elencato nella tabella 1. Quindi selezionare la scheda 'Compound' mettere i parametri di declustering potenziale, ingresso potenziale, energia di collisione e potenziale di uscita di cella di collisione come elencato nella tabella 2.</li>
			<li>Impostare la valvola come descritto nel passaggio 2.2.2.6.</li>
			<li>Impostare la condizione di LC come descritto nel passaggio 2.2.2.7. Quindi salvare il metodo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Creare il file batch come descritto al punto 2.2.3.</li>
		<li>Ottenere i dati di gestione record di messaggistica di ogni specie di SM da analisi LC-ESI-MS/MS come descritto al punto 2.2.4.</li>
		<li>Elaborare i dati di gestione record di messaggistica utilizzando il software per l'integrazione dei dati e ottenere i dati dell'area di picco per il cromatogramma di ioni estratti di ciascuna specie di SM.<ol>
<li>Fare doppio clic sull'icona del software per l'integrazione di dati in analisi quantitativa, fare clic sulla scheda 'Edit' e selezionare impostazioni predefinite utente integrazione. Impostare larghezza liscio gaussiana come 1,0 punto e fare clic su 'OK'. Fare clic sulla scheda 'Edit' e selezionare 'Nuova tabella risultati'. Selezionare il campione per essere integrato, fare clic su un pulsante freccia e fare clic su 'Avanti'. Selezionare 'Crea nuovo metodo', impostare il nome del metodo e fare clic su 'Avanti'. Fare clic su 'Avanti' e selezionare la casella di d18:1 /(D31)-16:0 SM così com'è, fare clic su 'Avanti' e fare clic su 'Fine'.</li>
			<li>Fare clic su 'Visualizza la recensione di picco' e confermare che i picchi del cromatogramma sono riconosciuti in modo appropriato. Va notato che il tempo di ritenzione di d18:1 /(D31)-16:0 SM è solitamente più piccolo di ~ min 0,3 rispetto a quella del MS 34-1 (di solito consiste di d18:1 / 16:0 SM).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantificare ogni specie di SM in base al rapporto del picco di ciascuna specie SM d18:1 /(D31)-16:0 standard interno di SM.<ol>
<li>Fare clic sulla scheda 'File', selezionare 'Esporta', selezionare 'Risultati Table', confermare il formato come 'MultiQuant', 'Esporta tutte le colonne' di colonne, righe come 'Esporta tutte le righe ad eccezione di quelli esplicitamente nascosti' e quindi fare clic su 'OK'.</li>
			<li>Aprire il file esportato nel software Excel. Normalizzare l'area del bersaglio specie SM per la zona di IS (d18:1 /(D31)-16:0 SM). Quindi moltiplicare per l'importo teorico dell'IS nel campione iniettato per calcolare la quantità di bersaglio specie di SM nel campione iniettato.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire la curva standard<ol>
<li>Ottenere i dati di gestione record di messaggistica di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM nei campioni per costruire la curva standard di analisi LC-ESI-MS/MS come descritto nel passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Ottenere i dati della zona di picco di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM come descritto al punto 2.3.5.</li>
		<li>Calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato come descritto nel passo 2.3.6.</li>
		<li>Costruire la linea di tendenza impostando l'asse x e y come l'importo nominale e la quantità calcolata di d18:1 /(D9)-18:1 SM e ottenere la formula di linea di tendenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Convalida del metodo quantitativo utilizzando Excel software<ol>
<li>Per la convalida del metodo, quantificare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM e d18:1 /(D31)-16:0 SM in QC campioni analizzando ogni QC assaggiare almeno tre volte in un giorno e ripetere almeno 3 giorni come descritto nel passo 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Ottenere i dati di zona di picco e calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato come descritto nel passo 2.3.5 e 2.3.6.</li>
		<li>Secondo la curva di calibrazione ottenuta, calcolare la quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM nel campione iniettato.</li>
		<li>Valutazione di precisione<ol>
<li>Calcolare la media e la deviazione standard della quantità di d18:1 /(D9)-18:1 SM ottenuti nel passaggio 2.5.3 sul set di dati del giorno intra- e Inter-day utilizzando Excel software.</li>
			<li>La media ottenuta al passaggio 2.5.4.1 è divisa per la deviazione standard ed espresso in %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Valutazione dell'accuratezza<ol>
<li>Calcolare la precisione di ogni dati come segue: [(L'importo calcolato ottenuto nel passaggio 2.5.3.) / (Importo nominale) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Calcolare la media del valore assoluto della precisione sul set di dati del intra- e Inter-giorno.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Nel presente metodo qualitativo, abbiamo ottenuto MS3 ioni prodotto di un SPC e un N-frazione di acil. È fondamentale per assegnare correttamente sia un SPC e un N-frazione di acil. A tal fine, si deve osservare che altre molecole contenenti fosforilcolina possono anche essere rilevati come gli ioni prodotto di3 MS. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e del plasmalogeno-PC sono abbondantemente presenti in cellule di mammifero, e loro idrofobicità è simile a quello della SM. Di consegue...

Sfingomielina (SM) è un comuni sfingolipidi in cellule di mammifero. SM è sintetizzato intracellulare1 e presente come precursore per altri sfingolipidi come un sfingosina-1-fosfato e una ceramide, che hanno un ruolo cruciale nella immunitario cellulare traffico e omeostasi della barriera, rispettivamente2, la pelle 3. Pertanto, l'analisi precisa del metabolismo SM è importante per chiarire i ruoli fisiologici e patologici degli sfingolipidi.
SM è composto di una ceramide e un fosforilcolina che è collegato al 1-idrossi gruppo di ceramide, che ulteriormente si compone di un sfingosina e un N-frazione di acil. Una varietà nei numeri carbonio e doppio legame nella sfingosina e N-frazione di acil risultati nelle specie numero di ceramide (e SM). Gli avanzamenti recenti nella LC-ESI-MS/MS ha permesso un'analisi quantitativa e qualitativa di SM4,5. Nell'analisi qualitativa, il numero di carbonio e doppi legami di un sfingoide LCB di SM è stati identificati tramite l'assegnazione di spettri di ioni prodotto di LCB. Tuttavia, informazioni strutturali della N-frazione di acil non è stata ottenuta direttamente perché non sono stati segnalati relativi ioni prodotto corrispondente e quindi N-moiety acil sono state dedotte da analisi differenziale tra ioni precursori e ioni di prodotto corrispondente a LCB in entrambi ioni positivi e negativi modalità4,5. In questo rapporto, presentiamo un metodo per rilevare gli ioni prodotto di LCB e di N-frazione di acil simultaneamente in modalità di3 MS utilizzando triplo quadrupolo e spettrometria di massa quadrupole lineare trappola ionica, che facilita la precisa strutturale speculazioni di ogni specie di SM6.
Gli effetti di soppressione (o aumento) di ioni causati dalla matrice in campioni biologici ostacolano la quantificazione accurata in analisi LC-ESI-MS e pertanto, è auspicabile per costruire curve di calibrazione per tutti gli analiti di interesse nella matrice identica del campione biologico. Tuttavia, questa strategia non è fattibile perché è quasi impossibile preparare tutte le specie di SM nei campioni biologici, soprattutto in un'analisi completa. Così, è pratico costruire una curva di taratura e determinare l'intervallo quantitativa mediante una specie rappresentativa di SM a spillo nei campioni biologici. Abbiamo usato due specie di SM isotopicamente etichettato per costruire una curva di taratura; uno è stato usato per uno standard interno e l'altro per uno standard composto. Abbiamo rilevato una piccola quantità di specie di SM isotopicamente etichettato come un composto standard a spillo in campioni biologici e ottenuto con successo una curva di calibrazione e la gamma quantitativa6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 2.0 mL tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Test tube</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Teflon-lined screw cap</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Disposable glass tube</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &amp;micro;m 1.5 mm I.D. x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge holder</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropyl Alcohol)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Ammonia water</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (bath type)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer for glass test tube</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1.4 mL glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>8 mm septum</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum</td></tr><tr><td>Screw cap for 1.4 mm glass vial</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap with slit septum</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>The software for data acquisition and analysis of product ion spectra</td><td>SCIEX</td><td>Analyst</td><td></td></tr><tr><td>The software for data integration in quantitative analysis</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottle</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sphingomyelin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosylphosphorylcholine</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;s minimum essential medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative and qualitative method for sphingomyelin by lc-ms using two stable isotopically labeled sphingomyelin species

Presentiamo un metodo di analisi di sfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente di liquido cromatografia-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). SM è un comuni sfingolipidi formato da un fosforilcolina e una ceramide come le componenti idrofile e idrofobe, rispettivamente. Un numero di specie di SM è presente in cellule di mammiferi a causa di una varietà della sfingoide lunga catena base (LCB) e un N-frazione di acil nella ceramide. In questo rapporto, indichiamo un metodo per stimare il numero di carbonio e legami doppi in un LCB e un N-frazione di acil basato su loro corrispondenti ioni prodotto negli esperimenti di MS/MS/MS (MS3). Inoltre, presentiamo un metodo di analisi quantitativa per SM usando due isotopicamente etichettato SM specie stabili, che facilita la determinazione l'intervallo utilizzato nella quantificazione di SM. Il presente metodo sarà utile nella caratterizzazione di una varietà di specie di SM in campioni biologici e prodotti industriali come cosmetici.

Sintetizzato chimicamente d18:1 / 24:0 SM (Figura 1A) e d18:1 / 24:0 SM in campioni di lipidi estratti da cellule HeLa (Figura 1B) sono stati analizzati da LC-ESI-MS che impiegano3 [M + HCOO]– e [M-CH3]- come ioni precursori di primo e secondo, rispettivamente. Si noti che l'intensità dello spettro di demetilato-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (<em...

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Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare e qualificare ogni specie di sfingomielina utilizzando Monitoraggio multiplo di reazione e la modalità di MS/MS/MS, rispettivamente.

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Views.  Teikyo University. Qui, presentiamo un protocollo per quantificare e qualificare ogni specie di sfingomielina utilizzando Monitoraggio multiplo di reazione e la modalità di MS/MS/MS, rispettivamente.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Ricerca

Bioingegneria

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Biochimica

LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

LC-MS Analisi delle piastrine umane come una piattaforma per lo Studio del metabolismo mitocondriale

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

Ambiente

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Chimica

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Spettrometria di massa, di antigeni glicosfingolipide

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Immunologia e infezioni

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether sphingolipids are altered in a disease and investigate whether sphingolipids can be targeted clinically. However, properly powered prospective studies that acquire tissues directly from the surgical suite can be time consuming, and technically, logistically, and administratively challenging. In contrast, retrospective studies can take advantage of cryopreserved human specimens already available, usually in large numbers, at tissue biorepositories. Other advantages of procuring tissues from biorepositories include access to information associated with the tissue specimens including histology, pathology, and in some instances clinicopathological variables, all of which can be used to examine correlations with lipidomics data. However, technical limitations related to the incompatibility of optimal cutting temperature compound (OCT) used in the cryopreservation and mass spectrometry is a technical barrier for the analysis of lipids. However, we have previously shown that OCT can be easily removed from human biorepository specimens through cycles of washes and centrifugation without altering their sphingolipid content. We have also previously established that sphingolipids in human tissues cryopreserved in OCT are stable for up to 16 years. In this report, we outline the steps and workflow to analyze sphingolipids in human tissue specimens that are embedded in OCT, including washing tissues, weighing tissues for data normalization, the extraction of lipids, preparation of samples for analysis by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS), mass spectrometry data integration, data normalization, and data analysis.

Sphingolipids are bioactive metabolites with well-established roles in human disease. Characterizing alterations in tissues with mass-spectrometry can reveal roles in disease etiology or identify therapeutic targets. However, the OCT-compound used for cryopreservation in biorepositories interferes with mass-spectrometry. We outline methods to analyze sphingolipids in human tissues embedded in OCT with LC-ESI-MS/MS.

Preparazione di tessuti umani incorporati in un composto di temperatura di taglio ottimale per l'analisi della spettrometria di massa

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

Ricerca sul cancro

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Biologia

Screening delle strutture lipidiche mediante marcatura di isotopi stabili

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

Autore in primo piano: Quantificazione di campioni lipidomici complessi utilizzando la marcatura di isotopi stabili

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

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