Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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Questo lavoro è stato supportato da NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Riconosciamo che Mark Slabodnick e Natalie Kirkland per sviluppare le versioni iniziali di alcuni di questi protocolli e le discussioni ben informative. Ringraziamo Karina Perlaza e Greyson Lewis per lettura critica del manoscritto.

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	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Coltura Stentor presenta una serie di sfide. In primo luogo, per eseguire esperimenti che richiedono un numero elevato di cellule, uno ha bisogno di mantenere un gran numero di culture Stentor , come culture diventare malsane quando Stentor concentrazione supera 20 cellule/mL. In secondo luogo, gli organismi che possono contaminare Stentor culture spesso dividono più veloce di Stentor e sopraffare la cultura (un agente inquinante comune è rotiferi). Pertanto, è necessario controllare periodicamente la cultura sotto un microscopio e rimuovere i contaminanti. Occasionalmente, una nuova cultura deve essere avviato da un piccolo numero di cellule salvato manualmente da una cultura contaminata. Questo aumenta il tempo necessario per mantenere sano Stentor culture. In terzo luogo, espandendo una singola cella in una cultura di 400 mL richiede almeno un mese perché Stentor ciclo cellulare è 3-5 giorni. In quarto luogo, a differenza di altri modello ciliati, Stentor raramente andare in forma cistica ed essi non possono essere congelati.
Un aspetto importante della coltura Stentor è la selezione di un organismo di alimentazione adeguata. Precedentemente sono stati descritti vari metodi per la coltivazione Stentor . Uno di loro suggerisce di utilizzare latte scremato ai batteri di cultura che alimentano poi Stentor. Tale tecnica è efficace in coltura Stentor; Tuttavia, l'applicazione di tecniche genomiche richiede campioni puri per evitare confusione derivanti dalla genomiche letture da organismi non definito cibo. Utilizzando il protocollo attuale, Stentor può essere coltivata in massa e, perché il loro cibo, Chlamydomonas, è stato sequenziato, la presenza di contaminazione genomico dall'organismo dell'alimento possa essere rilevata e controllata per. Per ragioni sconosciute, tartaro dovuto ricostituire le sue scorte di ritornare dove trovò Stentor prima. Con il protocollo attuale, siamo stati in grado di mantenere Stentor per anni.
Esperimenti di rigenerazione con Stentor sono generalmente semplici, ma ci sono alcuni dettagli critici da tenere a mente. Per quanto riguarda la sezione 2, taglio Stentor cellule a metà possono essere masterizzate in pochi minuti. Mastering più avanzate procedure di microchirurgia di Stentor possono richiedere una settimana di pratica. Mentre effettuando un trattamento di saccarosio o urea (sezione 3), se all'inizio dell'imaging la maggior parte delle cellule hanno ancora loro bande membranellar, aumentare il tempo di incubazione di 10-30 s per quando saccarosio trattamento viene eseguito successivamente. Non aumentare il tempo di trattamento di saccarosio di là di incubazione 3 min perché il risultato sarà la morte delle cellule.
Imaging di Stentor rigenerazione richiede metodi di grandi cellule di immagine per lunghi periodi di tempo. Il metodo di imaging dettagliato nella sezione 4 è utilizzabile solo con un microscopio dritto. Se invece è disponibile un microscopio invertito, cellule posizionabile su una diapositiva o un vetrino coprioggetti in piccole camere. Un metodo è quello di creare una camera fuori di vaselina e coprire con un altro vetrino coprioggetto per evitare l'evaporazione. In alternativa, una camera per una singola cella può essere fatto facendo un buco con un punzone di foro della dimensione desiderata in un 1 x 1 cm2 quadrati di distanziatore di silicio (tabella materiali), posizionare il distanziale su un vetrino coprioggetti, mettendo le cellule nella camera e che copre la camera con un altro vetrino coprioggetti. Quando imaging, se Stentor non sono con l'orientamento corretto per osservare le caratteristiche di ogni fase di rigenerazione, picchiettare con decisione per rendere il contratto di cella. Guarda la cella estendere per identificare la fase di rigenerazione (estensione completa richiede circa 45 s). Se la cella è ancora nell'orientamento sbagliato, ripetere il tapping. Le immagini mostrate nella Figura 1 e Figura 6 sono state scattate da un microscopio stereo zoom; Tuttavia, tutti gli esperimenti dettagliati possono essere eseguiti utilizzando un 5 X stereo microscopio per dissezione.
Un'altra sfida oltre a coltura e imaging Stentor è il monitoraggio della rigenerazione, in particolare la quantità di tempo necessario per identificare le fasi. Se la cella rigenerante è perfettamente orientata con la regione del primordio orale chiaramente visibile, identificazione della fase richiede pochi secondi. A volte, tuttavia, la cella Stentor è in un orientamento prevenzione chiara assegnazione della fase di rigenerazione, tenendo così più tempo per identificare. La notevole quantità di tempo necessario alla fase di singole celle rigenerante potrebbero ritardare la quantificazione di tutte le cellule rigenerante, diminuendo così la precisione temporale della messa in scena e che richiedono l'osservatore ad aspettare e ricreare l'immagine la cella dopo esso ha spostato a un nuovo orientamento. Di conseguenza, questo esperimento è sia di tempo che di alta intensità di manodopera. Per questi motivi, sarebbe altamente auspicabile sviluppare metodi automatici per la rilevazione di cellule Stentor e assegnazione fasi di rigenerazione in dati video microscopia. Questi consentirebbe anche per ulteriori esperimenti riproducibili, aumenta la dimensione del campione e la rimozione dei pregiudizi umani.
L'emersione dei metodi altamente sensibili di genomica e proteomica ha cominciato a mettere gli studi delle singole cellule in reach. Per tali analisi unicellulare, il formato gigante di una cella Stentor rende auspicabile cavia per esperimenti di proof-of-concept. Per tali esperimenti essere possibili, coltura Stentor è fondamentale, e quindi i metodi descritti qui dovrebbero giocare un ruolo in ulteriore sviluppo delle tecniche più avanzate di cella singola.

Le cellule non sono semplici sacchetti di enzimi, ma piuttosto altamente complesse macchine i cui componenti sono accuratamente adattate alla dimensione corretta e disposti in posizioni ben definite. La morfogenesi delle cellule individuali rappresenta un processo chiave nella cellula e biologia dello sviluppo, ma il suo meccanismo molecolare è sconosciuto1,2. Mentre alcune cellule coltivate assomigliano a BLOB, organismi unicellulari possono estremamente complicato architetture, esemplificati dal complessi corticali modelli visti nelle ciliati3,4.
Forse l'esempio più estremo di una cellula altamente strutturata è Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliato in tiepidi Tetrahymena e Paramecium . Stentor è lungo 1 mm ed è coperto con più di 100 strisce longitudinali di pigmento blu alternate a righe di ciglia organizzato da stack in parallelo dei nastri dei microtubuli che corrono la lunghezza dell'intera cella. La cella è a forma di tromba (Figura 1), con una banda di membranellar e un apparato orale (OA) alle sue estremità anteriore e un peduncolo che si collega il cellulare al substrato alla sua estremità posteriore. Oltre la polarità chiaro antero-posteriore, la cella indica un distintivo patterning chirali, tale che la spaziatura tra righe ciliare gradualmente aumenta in senso orario. Questo si traduce in una discontinuità dove la riga più stretta incontra la riga più ampia e questa regione della superficie delle cellule, noto come il locus di contrasto striscia, può indurre la formazione del secondo set di strutture di estremità anteriore quando si innesta su un'altra cella5, rendendola formalmente equivalente all'organizzatore di Spemann. Così, tutti i processi chiave della biologia dello sviluppo hanno loro analoghi in Stentor: axiation, formazione di pattern e induzione. In un embrione, questi processi sono guidati da differenze di destino fra le diverse cellule, ma in Stentor, essi devono essere guidati da differenze di destino tra le diverse regioni all'interno di una singola cella. Ciò che definisce le differenze tra le regioni all'interno di Stentor è un mistero.
Se qualsiasi parte di Stentor è tagliato fuori, il pezzo mancante della cella può rigenerare per produrre una cellula normale in una questione di ore. Se una cella è tagliato a metà, o anche a pezzetti molto piccoli, ogni pezzo riorganizza in una cella di aspetto normale, ma più piccola e ripristina la proporzionalità tra cella parti6,7. Anche piccolissimi frammenti, 1/64th la dimensione della cella originale, sono in grado di rigenerare in una cella piccola ma normalmente proporzionata e quindi crescere per il full-size6. Stentor presenta dunque un'opportunità unica di studiare i meccanismi organello dimensione delle cellule e ridimensionamento della regolazione della crescita con metodi chirurgici che solitamente vengono applicate a livello di tessuti o interi organismi.
Una delle proprietà di Stentor che permette di rigenerare da una vasta gamma di operazioni chirurgiche è che contiene un macronucleo singolo nodulated (Figura 1) con circa 50.000 copie del genoma intero8. Come un frammento di cella contiene almeno un nodo macronuclear, ha la capacità di rigenerare completamente. Un'altra proprietà che sono alla base di Stentorabilità di rigenerazione è la sua capacità di guarigione prodigiosa. Anche se molti tipi delle cellule sono in grado di guarire le loro ferite9, Stentor è in grado di recuperare da una straordinaria gamma di perturbazioni fisiche. Un esempio di recupero Stentor da una perturbazione drastica, insieme ai metodi per visualizzare flusso citoplasmatico in Stentor10 precedentemente sono stati segnalati. Questi metodi consentono lo studio di come ferimento e successiva rigenerazione influenzano lo stato fisico del citoplasma.
Stentordi enormi dimensioni, capacità di rigenerazione straordinaria e il fatto che si manifesta molti dei fenomeni dello sviluppo visti in embrioni multicellulari (quali gli organizzatori, axiation e patterning) ha attirato molti biologi inerente allo sviluppo durante la girata del secolo scorso, tra cui Thomas Hunt Morgan7. Durante gli anni ' 50 e ' 60, approcci microsurgical hanno dimostrato una sorprendente gamma di processi rigenerativi e morfogenetici in questo organismo unicellulare11. Tuttavia, Stentor è stato sviluppato come un sistema di modello di biologia molecolare solo recentemente. Nel corso degli ultimi anni, il genoma di Stentor è stato sequenziato e assemblato8, e il metodo per perturbare l'espressione genica mediante l'alimentazione di RNAi è stato sviluppato12.
Uno dei motivi che Stentor è stato sviluppato in un organismo modello per la biologia molecolare moderna solo recentemente è stato la difficoltà di crescere grandi culture a causa di un lungo ciclo di cella (3-5 giorni). Tuttavia, i metodi moderni di genomica e proteomica richiedono meno materiale che hanno usato per, e il volume di una singola cella di Stentor è sufficiente per questi metodi, anche senza ricorrere a metodi ultrasensibili che sono stati sviluppati per l'analisi del singolo cellule che sono molto più piccole di Stentor. Sezione 1 del protocollo in dettaglio la procedura per la creazione di una grande cultura da una singola cellula Stentor . Lo stesso approccio può essere utilizzato per stabilire una grande cultura da un frammento di cellule ottenuta dal taglio di una cella. Sezione 1, inoltre, fornisce le linee guida per il mantenimento sano Stentor culture per lunghi periodi di tempo. Sezione 2 del protocollo fornisce la metodologia per indurre la rigenerazione delle cellule tagliando le celle manualmente con un ago di vetro. Sezione 3 del protocollo è dedicato ai due metodi di indurre la rigenerazione delle strutture cellulari specifici (membranellar band e orale apparato): trattando le cellule con saccarosio o urea conduce allo spargimento di queste strutture, seguite da loro rigenerazione. Sezione 4 del protocollo in dettaglio un metodo per l'imaging di singole celle rigenerante per lunghi periodi di tempo. Sezione 4 si conclude con la descrizione delle fasi di rigenerazione e suggerimenti sull'analisi delle dinamiche di rigenerazione.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

Le cellule hanno bisogno per essere in grado di rigenerare le parti per recuperare da perturbazioni esterne. Il ciliato unicellulare Stentor coeruleus è un organismo modello eccellente per studiare la guarigione della ferita e la rigenerazione delle cellule successive. Il genoma di Stentor è diventato disponibile recentemente, insieme ai metodi di biologia molecolare moderna, ad esempio RNAi. Questi strumenti rendono possibile studiare unicellulare rigenerazione a livello molecolare. La prima sezione del protocollo copre che stabilisce Stentor colture di cellule da singole cellule o frammenti di cellule, insieme a linee guida generali per il mantenimento Stentor culture. Stentor la coltura in grandi quantità consente l'utilizzo di strumenti preziosi come biochimica, sequenziamento e spettrometria di massa. Le sezioni successive del protocollo coprono diversi approcci per indurre la rigenerazione in Stentor. Manualmente taglio cellule con un ago di vetro permette di studiare la rigenerazione di parti di grandi cellule, mentre trattando le cellule con saccarosio o urea permette di studiare la rigenerazione delle strutture specifiche sull'estremità anteriore della cella. Viene fornito un metodo per le immagini singole celle rigenerante, insieme a una rubrica per sosta e analizzare la dinamica della rigenerazione. L'intero processo di rigenerazione è diviso in tre fasi. Visualizzando la dinamica della progressione di una popolazione di cellule attraverso le fasi, è dimostrato l'eterogeneità nei tempi di rigenerazione.

Stentor culture sono state stabilite in modo affidabile e mantenute da singole celle o frammenti di cellule utilizzando la sezione 1 del protocollo. Un esempio rappresentativo di una grande cultura sana è mostrato nel Video 1.
Il corso di tempo di rigenerazione è stato misurato in Stentor utilizzando il metodo di trattamento di saccarosio per l'avvio di rigenerazione descritta nel passo 3.1, combinato con l'imaging e il metodo di analisi descritto nella sezione 4 (Figura 7). Questo grafico indica che c'è una diffusione di uno-ora-lungo del tempo impiegato dalla popolazione delle cellule di raggiungere qualsiasi particolare fase. Questo tipo di analisi permette lo studio dell'eterogeneità temporale nel processo di rigenerazione in una popolazione di rigenerazione delle cellule.
Di seguito è riportato un riepilogo dei tempi di rigenerazione che sono stato osservato finora dopo decine di trattamenti di saccarosio (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 è quando Stentor cellule sembrano lacrime senza qualsiasi banda di membranellar (questa fase inizia immediatamente dopo l'interruzione di saccarosio). Questa fase dura per 3-6 h. fase 2 è quando una banda di membranellar apparirà e cresce (3-6 h dopo il trattamento di saccarosio). Questa fase dura per 3-4 h. Stage 3 è quando un primordio orale viene visualizzato all'estremità posteriore della band membranellar (6-8 h dopo il trattamento di saccarosio), entrambe le strutture vengono spostate verso l'estremità anteriore della cella. Questa fase dura per 1-2 h. Quando la band di membranellar sia l'apparato orale ha raggiunto l'estremità anteriore della cella, questo indicato il completamento della rigenerazione. La cella ha adottato caratteristica Stentor tromba-come forma. Le cellule erano completamente rigenerati 8-9 h dopo il trattamento di saccarosio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Figura 1. Istantanea di Stentor. La band membranellar e apparato boccale è mostrato all'estremità anteriore della cella. Il peduncolo è all'estremità posteriore della cella. Stentor macronucleo è nodulated. Un ben nutrito Stentor ha verdi vacuoli alimentari contenenti principalmente Chlamydomonas. Barra della scala è di 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Figura 2. Set-up taglio Stentor . Il taglio delle cellule avviene modificando manualmente un ago di vetro mentre guardando la cella utilizzando un microscopio stereo da dissezione commercialmente disponibile. Lo scopo della carta è quello di fornire lo sfondo bianco per vedere le cellule meglio. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Nella figura 3. Istantanee di 3 Video che illustra come tagliare un Stentor con un ago di vetro. (A) A Stentor immediatamente prima l'ago tocca. (B) un Stentor spremuto leggermente tra una diapositiva di ferro e vetro. (C) A contratto Stentor reagire alla forza dell'ago. (D) A Stentor taglianda premendo delicatamente sulla cella con il lato dell'ago. (E) A Stentor ora tagliata in due, ma non separati. (F) due Stentor frammenti. Barra della scala è di 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Figura 4. Visualizzazione schematica della sezione 3 e sezione 4 del protocollo. Si tratta di un protocollo illustrato per l'esecuzione di saccarosio o urea trattamento e l'osservazione di rigenerazione delle cellule. Il tempo indicato nel pannello inferiore è misurato dall'inizio del lavaggio 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Figura 5. Il programma di installazione per l'osservazione diretta e/o formazione immagine di rigenerazione con un microscopio dritto. In ogni goccia di 4 µ l appesi il vetrino coprioggetto, c'è una cella in fase di rigenerazione. Acqua nei pozzetti della piastra spot vetro limita l'evaporazione delle goccioline. Questa configurazione permette dopo la rigenerazione delle cellule multiple in parallelo. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Nella figura 6. Istantanee di Stentor in ogni fase della band membranellar e la rigenerazione dell'apparato orale. (A) fase 1 è caratterizzata da una forma a goccia-tipo delle cellule e l'assenza della band membranellar. (B) fase 2 è caratterizzato dalla comparsa della membranellar band, una struttura basata su ciglia che batte continuamente. Membranellar bande sono contrassegnati con linee bianche tratteggiate nei pannelli B - D. (C e D) fase 3 è caratterizzata dalla comparsa di primordio orale (contrassegnato con una freccia). Orale primordio appare come un'invaginazione all'estremità posteriore della band membranellar. Il primordio orale si muoverà quindi verso l'anteriore della cellula per diventare l'apparato orale. (E) rigenerazione viene completata quando la cella ha adottato la caratteristica forma a tromba Stentor , e apparato boccale (contrassegnato con una freccia) si è allargato all'estremità anteriore della cella. Barra della scala è di 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Figura 7. Impilati visualizzando trama scatola come proporzioni delle cellule in tutte le fasi di rigenerazione dopo il trattamento di saccarosio cambia nel passare del tempo. Il grafico mostra eterogeneità nella sincronizzazione delle fasi di rigenerazione all'interno di una popolazione di cellule rigenerante. "Numero di registrazione fine" indica il completamento della rigenerazione. Il numero di celle: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Video 1. Esempio di una sana cultura Stentor . In genere, se una cultura è questo concentrato, spaccare la cultura è raccomandato. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Video 2. Rallentare Stentor con metilcellulosa. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Video 3. Taglio Stentor. Singole celle possono essere tagliate manualmente in più parti sotto uno stereo microscopio per dissezione premendo un ago di vetro attraverso la cella. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema con la cultura</td>
			<td>Possibile rimedio</td>
			<td>Prevenzione possibile</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura è sopraffatto da rotiferi o altri organismi di grandi dimensioni.</td>
			<td>Rimuovere altretante Stentor possibili in una nuova piastra di coltura. Quindi lavare le cellule tre volte.</td>
			<td>Lavare accuratamente Stentor quando riceverli, anche quando li acquista da un fornitore commerciale.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cultura è sopraffatto da funghi o altri piccoli organismi.</td>
			<td>Identificare un angolo dove ci sono meno Stentor. In quella zona, rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor e aggiungere nella nuova PSW. Mescolare delicatamente ma accuratamente per distrubuire gli organismi invasori. Saltare l'alimentazione successiva e Stentor li mangerà.</td>
			<td>Osservare la cultura regolarmente e rimuovere piccoli contaminanti attraverso lo scambio di supporti per PSW fresco.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor stanno ponendo in cima a vicenda.</td>
			<td>Dividere la cultura in modo che la concentrazione è inferiore a 20 cellule/mL.</td>
			<td>Dividere culture più spesso.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor cellule sono accoppiamento.</td>
			<td>Alimentazione ogni 4 giorni invece di ogni 5 giorni.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>La cultura ha un sacco di materiale di scarto scuro.</td>
			<td>Rimuovere la maggior quantità di materiale scuro, Stentor rifiuti, possibile senza rimuovere le cellule. Se Stentor sono attaccati al materiale scuro, pipettare su e giù per rilasciare le cellule Stentor dai loro rifiuti e quindi rimuovere il supporto con i rifiuti senza rimuovere le cellule. O, rimuovere quelli Stentor e mangimi di conseguenza meno.</td>
			<td>Alimentazione Stentor 1ml meno cibo per 100 mL di cultura.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dall'aspetto malsano (vacuolato/gonfio o arrotondati) Stentor.
</td>
			<td>Rimuovere tanto mezzi possibili senza rimuovere molti Stentor celle e aggiungere nuova PSW.</td>
			<td>Scambiare i media regolarmente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Guida alla risoluzione dei problemi per la coltura Stentor.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

Il gigante ciliati, Stentor coeruleus, sono un ottimo sistema per studiare la rigenerazione e la guarigione delle ferite. Vi presentiamo le procedure per stabilire colture cellulari Stentor da singole cellule o frammenti di cellule, inducendo la rigenerazione di cellule di taglio, chimicamente che inducono la rigenerazione della banda membranellar e apparato orale, imaging e l'analisi della cella rigenerazione.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K Views.  University of California San Francisco. Il gigante ciliati, Stentor coeruleus, sono un ottimo sistema per studiare la rigenerazione e la guarigione delle ferite. Vi presentiamo le procedure per stabilire colture cellulari Stentor da singole cellule o frammenti di cellule, inducendo la rigenerazione di cellule di taglio, chimicamente che inducono la rigenerazione della banda membranellar e apparato orale, imaging e l'analisi della cella rigenerazione.

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Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Medicina

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neuroscienze

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biologia

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

<meta charset="utf8"></head><body>Un modello murino standardizzato di terapia extracorporea con onde d'urto indotta dalla rigenerazione dei tessuti molli

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Un modello murino standardizzato di terapia extracorporea con onde d'urto indotta dalla rigenerazione dei tessuti molli

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Metodi per lo studio della rigenerazione in Stentor

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