La coltura tissutale istotipica consente alle cellule di essere coltivate in tre dimensioni, creando così morfologie tissutali in vitro che imitano da vicino la funzione tissutale realistica, che può essere utilizzata come costrutti praticabili per la riparazione dei tessuti. Queste colture sono tipicamente strutture tridimensionali costituite da un singolo tipo di cellula cresciuta ad alta densità. La struttura tridimensionale, nota anche come impalcatura, imita la matrice extracellulare naturale. A seconda del tipo di cellula utilizzata, gli scaffold possono essere progettati per un'applicazione specifica e in genere fungono da modello per il tessuto bio-mimetico. Questo video introdurrà i fondamenti delle colture istotipiche di tessuto, una procedura per l'isolamento delle cellule e la fabbricazione e la cellularizzazione di un'impalcatura di tessuto di seta porosa per imitare il tessuto cardiaco.
Tutti i tessuti sono costituiti da due componenti fondamentali, la matrice extracellulare e le cellule tessuto-specifiche che la abitano. La matrice extracellulare è una rete di proteine strutturali che creano un ambiente tridimensionale per le cellule da occupare, e le cellule al suo interno hanno lo scopo di ricapitolare i processi fisiologici nativi del tessuto. Attualmente, una tecnica comune utilizzata per modellare il tessuto è la coltura tissutale bidimensionale, in cui le cellule vengono erogate su un substrato piatto e lasciate formare un film sottile. In generale, questo metodo non è affidabile per mantenere un fenotipo in vivo, funzioni organo-specifiche e interazioni contestuali cellula-cellula o cellula-substrato. La coltura tissutale istotipica allevia tali limitazioni fornendo un'impalcatura 3D su cui le cellule possono crescere, risultando in una fitta rete di cellule che imita più da vicino le morfologie cellulari native e facilita lo sviluppo di reti intercellulari realistiche e percorsi di comunicazione. Una varietà di reti polimeriche 3D, tra cui idrogel e tappetini di seta elettrodrodati, offrono modi convenienti per coltura di cellule tessuto-specifiche in tre dimensioni. Per popolare queste impalcature, le celle devono essere isolate. Le cellule primarie utilizzate in questo video vengono raccolte da tessuto vivo, che viene tritato e quindi digerito in una soluzione enzimatica per separare le cellule bersaglio dalla matrice extracellulare. Una volta isolate le cellule, ci sono due tecniche utilizzate per seminare le impalcature. La tecnica delle goccioline prevede il pipettaggio di una soluzione di cellule sull'impalcatura a una velocità lenta e costante. La seconda, o tecnica di sospensione cellulare, immerge l'impalcatura in una sospensione cellulare. Spesso, l'impalcatura e la sospensione vengono scosse per incoraggiare la migrazione cellulare nella matrice. Entrambe le tecniche si traducono in costrutti bioingecodificati con alte densità cellulari. Le seguenti procedure comporteranno l'isolamento delle cellule cardiache e la tecnica di sospensione cellulare per creare un'impalcatura specifica della cellula cardiaca, in quanto manterrà la morfologia del tessuto cardiaco nativo.
Per iniziare il processo di isolamento delle cellule dal tessuto del donatore, iniziare assicurandosi che l'area di lavoro e gli strumenti di dissezione siano sterilizzati. Quindi, posizionare un drappo sterile sul piano di lavoro nell'armadio di biosisia. Posizionare gli strumenti chirurgici sterili sul drappo senza toccarli, quindi aprire una lama sterile numero 20 bisturi. Dopo l'eutanasia del campione, sterilizzare l'area chirurgica con una garza imbevuta di betadine. Quando è pronto, fissare il campione e iniziare la procedura chirurgica per isolare il tessuto di interesse. In questo caso, sarà il cuore. Una volta asportato, mettere il tessuto su ghiaccio nella capsula di Petri contenente glucosio PBS. Rimuovere qualsiasi residuo di sangue o tessuto connettivo, quindi trasferire il tessuto in una capsula di Petri con glucosio PBS fresco. Quindi, utilizzando micro-forbici e pinza sterili, tritare accuratamente i campioni di tessuto in circa 1 millimetro cubo di pezzi. Utilizzando una pipetta, trasferire i pezzi e tamponare su un tubo conico. Quindi, rimuovere tutti tranne 10 millilitri di buffer. Aggiungere 7 millilitri di soluzione di collagenasi, quindi agitare la miscela a 37 gradi Celsius per 7 minuti. Quindi, pipettare delicatamente 10 volte per rompere i pezzi di tessuto. Lasciare che i pezzi si depositino, quindi aspirare il liquido e scartarlo. Quindi, ripetere la digestione e pipettare delicatamente la soluzione per rompere i pezzi di tessuto. Dopo che i pezzi si sono depositati, estrarre il surnatante e raccoglierlo in un tubo conico separato da 50 millilitro. Quindi, aggiungere 10 millilitri di soluzione STOP a ciascun tubo conico contenente surnatante per fermare la digestione.
Ora che le cellule primarie sono state isolate, fabbrichiamo un'impalcatura porosa di tessuto di seta. Per iniziare, versare 30 millilitri della soluzione di seta in uno stampo. Quindi, spargere 60 grammi di cloruro di sodio setacciato uniformemente sulla soluzione. Quindi, lasciare polimerizzare la seta indisturbata a temperatura ambiente per 48 ore. Quindi, posizionare lo stampo in un forno a 60 gradi per 1 ora per finalizzare la reticolazione ed evaporare il liquido rimanente. Una volta polimerizzato, immergere lo stampo in un becher di acqua distillata per 48 ore per eliminare il sale. Quindi, rimuovere l'impalcatura dallo stampo e tagliare piccoli dischi con un punzone per biopsia da 5 millimetri. Tagliare i dischi ad un'altezza di 2 millimetri e, infine, rimuovere i centri di ciascun pezzo con un pugno biopsia da 2 millimetri per creare un anello. Infine, autoclave i ponteggi in ciclo umido per 20 minuti.
Con l'impalcatura preparata, iniziamo il processo di semina cellulare. Per prima cosa, posizionare un'impalcatura sterile per pozzetti in una piastra da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere il terreno di coltura cellulare per immergere le impalcature e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di colture tissutali per equilibrarle per almeno 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo in eccesso e quindi aggiungere la sospensione cellulare primaria isolata agli scaffold. Quindi, restituire la piastra all'incubatore e lasciare durante la notte per le cellule da attaccare alle impalcature. La mattina seguente, aspirare accuratamente le cellule non attaccate e sostituirle con 200 microlitri di terreno di coltura cellulare fresco per pozzo. L'impalcatura risultante è un costrutto poroso con un'alta densità di celle pronto per essere utilizzato.
Ora che hai imparato come eseguire la coltura tissutale istotipica, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni pratiche di questi materiali. La coltura tissutale istotipica può creare micro-ambienti cellulari che imitano i tessuti nativi e, di conseguenza, sono in grado di fornire un modello adatto per lo studio del comportamento cellulare riguardante un singolo tipo di cellula. Ad esempio, la fibra 3D negli scaffold, che imita più accuratamente la nicchia delle cellule staminali trovata in vivo, può essere seminata con cellule staminali pluripotenti per lo screening di segnali biologici e determinare i loro effetti sulla differenziazione delle cellule staminali. Questo lavoro può in definitiva fornire una maggiore comprensione di come le cellule staminali si differenziano e può offrire approfondimenti sul miglioramento della differenziazione e della rigenerazione cellulare per le applicazioni di ingegneria tissutale. Come le colture dinamiche, il condizionamento meccanico può anche migliorare l'impalcatura del tessuto 3D sottoponendolo a vari carichi meccanici che il tessuto naturale può sperimentare in vivo. Applicando carichi di compressione e biassiali durante la crescita cellulare, la morfologia cellulare e la matrice extracellulare vengono alterate per riflettere tali carichi meccanici. Ciò si traduce in un'impalcatura tissutale bioingecostruita precondizionata con una struttura cellulare simile al tessuto nativo, che lo rende ideale per l'impianto in aree che possono sperimentare forze meccaniche simili. Infine, i costrutti tissutali ingegnerizzati possono anche essere utilizzati per sostituire o riparare i difetti dei tessuti. Per raggiungere questo obiettivo, l'impalcatura del tessuto deve essere prima vascolarizzata, consentendo così al sangue di muoversi liberamente attraverso il costrutto. Una volta vascolarizzato, l'impalcatura può essere trasferita e impiantata nel difetto tissutale per avviare la riparazione. Il successo dell'innesto può essere successivamente confermato attraverso l'istologia, che rivela se il costrutto tissutale ha completamente riparato l'area danneggiata.
Hai appena visto l'introduzione di Jove alla coltura tissutale istotipica. Ora dovresti capire come vengono preparate semplici strutture 3D, come le cellule primarie vengono isolate e seminate su un'impalcatura e le varie applicazioni di queste colture nel campo della bioingegneria. Grazie per l'attenzione.
