Name: transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da un Norwich Research Park Studentship (JR), l'ingegneria congiunta e Physical Sciences Research Consiglio/biotecnologici e Biological Sciences Research Council BBSRC-finanziato centro ricerca biologia sintetica OpenPlant concedere (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); un scambio di conoscenze di John Innes Centre e commercializzazione concedere (BB/KEC1740/1) (B.B.); e la concessione del programma strategico di BBSRC Istituto 'Molecole dalla natura' (BB/P012523/1) e la Fondazione di John Innes (A.O.). Vorremmo ringraziare George Lomonossoff per fornire i vettori pEAQ e Andrew Davis per la fotografia.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Alto-attraverso-ha messo sottovuoto infiltrazione permette questo protocollo essere utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per la produzione di preparativa del triterpene composti di interesse per varie applicazioni a valle. L'apparecchiatura di infiltrazione vuoto qui descritta è facilmente replicato. Aggiunta del serbatoio vuoto è consigliabile ridurre il tempo necessario per tirare il vuoto necessario, tuttavia è possibile riutilizzare semplicemente un forno sottovuoto non modificato come camera di infiltrazione. Proteggere la pompa del vuoto tramite aggiunta di un condensatore adatto è teoricamente sensata, ma nel nostro laboratorio abbiamo trovato questo per essere inutili.
Copertura di infiltrazione è compromessa se le foglie non sono completamente immersi nella sospensione di infiltrazione. Questo problema è ridotto al minimo, garantendo che il livello della sospensione raggiunge la superficie superiore del titolare all'impianto, e che il titolare di impianto è una misura stretta per il bagno di infiltrazione. Notare dalla Figura 2 che la superficie superiore del titolare pianta viene incassata al bagno infiltrazione quando in luogo. Questo avviene mediante pannelli sui bordi centrali del titolare che formano il punto di ancoraggio con la parte superiore del bagno infiltrazione. La sospensione di infiltrazione richiederà aggiunte periodiche per mantenere il livello di sospensione. Ciò si ottiene tramite l'aggiunta di sospensione di infiltrazione in eccesso per evitare riduzione graduale del OD600 nel corso di una grande infiltrazione batch-wise. Tuttavia, nelle nostre mani, sostituzione per acqua non sembra avere un effetto notevole sui rendimenti attesi su scala preparativa, anche se questo non è stato studiato quantità. Quante piante possono essere infiltrati da un lotto di sospensione di infiltrazione è ancora una questione aperta. Abbiamo ordinariamente infiltrarsi tra 100 e 200 piante con un unico batch di sospensione di infiltrazione. Inoltre, è normale per alcuni terreni a lisciviare nella sospensione infiltrazione nel corso del processo di infiltrazione. Questo non è stato trovato per avere un effetto notevole sull'efficacia di infiltrazione.
Durante la vendemmia è consigliabile (ma non critico) per raccogliere solo le foglie che si sono infiltrate (alcune foglie saranno cresciuta post-infiltrazione). Vendemmia selettiva impedisce la diluizione con tessuto improduttivo, che altrimenti sarebbe aumentare il rapporto di endogeno impurità rispetto al composto di interesse. Questo ha un impatto nominale sulla facilità di purificazione a valle e aumenta la scala di questi processi. Quando si utilizza tHMGR per aumentare la fornitura di precursore, un fenotipo necrosed è osservato spesso a sviluppare durante il periodo di crescita post-infiltrazione. Questo è normale e aiuta effettivamente la raccolta selettiva e il processo di essiccazione a valle. La polvere di foglia secca solitamente può essere conservata in un contenitore sigillato in un luogo fresco, asciutto e buio, ma idealmente in un essiccatore sotto vuoto. Questo dipende dalla stabilità del composto di interessati. Prestare attenzione se si sceglie di memorizzare in un congelatore a-80 ° C. Garantire che le secche foglie sono in un contenitore a tenuta stagna e il ritiro dall'ammasso, permetterà questo contenitore a temperatura ambiente prima dell'apertura. In caso contrario si comporterà Riumidificatore delle foglie, che ostacolano l'elaborazione a valle.
I passaggi di post-raccolta in questo protocollo sono forniti a scopo esemplificativo, e per aiutare quei ricercatori che hanno una limitata chimica pratica esperienza. Possono essere sostituiti per molte altre tecniche di estrazione/purificazione del prodotto naturale. Come spiegato nell'introduzione, PSE ha molti vantaggi, tuttavia la capitale costo dell'apparato PSE commercialmente disponibile può essere proibitivo, e non è essenziale. Il trattamento base di scambio ionico della resina è un metodo molto conveniente per sostituire la tradizionale saponificazione seguita da liquido/liquido di partizionamento. Tuttavia, non è adatto per prodotti contenenti gruppi carbossilici o gruppi funzionali che sarebbe essere idrolizzati in condizioni di base, come gli esteri. Questi prodotti dovrebbe essere mantenuto sulla resina base di scambio ionico. Tuttavia, esiste la possibilità di sfruttare questo per una cattura e rilascio procedura (non documentato qui). Dove saponificazione tradizionale sarebbe appropriato, trattamento di resina di scambio ionico base serve come una comoda alternativa. Il metodo di cromatografia descritto nel passaggio 9, è stato trovato per essere generalizzabile per i composti descritti nella Figura 3. Tuttavia, composti di maggiore polarità possono richiedere un lungo periodo di eluizione 100% acetato di etile. Con riferimento al punto 9.2, purificazione bene a valle è interamente composto specifico e dipende anche dalla scala. Ripetuti cicli di cromatografia flash su scala ridotta con gradienti ottimizzati, è solitamente sufficiente per raggiungere una purezza appropriata per analisi NMR. Su scala più ampia, la cristallizzazione è spesso una comoda alternativa. In casi difficili, preparativa o semi-preparatorio ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) può essere impiegata a seconda la quantità desiderata di composto isolato. Esempi di processi di depurazione a valle per una gamma di composti rappresentante possono essere trovati altrove8.
Il protocollo attuale, come presentato qui, è usato ordinariamente nel nostro laboratorio e ha dimostrato l'utilità. Tuttavia, c'è ancora un ampio margine per un'ulteriore ottimizzazione della piattaforma espressione. Lavoro è in corso nel nostro laboratorio per studiare come ulteriore ingegneria via e controllo differenziale dei livelli di espressione della proteina potrebbe migliorare triterpene produzione ulteriormente, mentre la mediazione della tossicità per le cellule dell'ospite. C'è anche il potenziale per indagare la manipolazione del trasporto intracellulare sistemi20,21e la direzione di enzimi diversi compartimenti cellulari22,23, viali che potrebbero migliorare l'efficienza di più eventi di ossidazione. Potenziali benefici per modificare la morfologia sottostante degli organelli chiave potrebbero anche essere esplorati. Ad esempio, la sovraespressione del dominio della membrana di Arabidopsis thaliana HMGR è stata osservata per indurre l'ipertrofia del reticolo endoplasmico in piante24; un sito chiave per attività di CYP450. Questo protocollo è ideale per la produzione di milligrammo per quantitativi di grammo-scala di prodotti triterpenici e possa essere impiegato in un ambiente di ricerca per accedere composti per studio a valle (ad esempio, l'esplorazione sistematica di struttura-attività le relazioni e le indagini preliminari alle proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche di composti di interesse clinico guida). Tuttavia, la piattaforma è linearmente e scalabile in modo affidabile semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate e la praticità di espressione transitoria tramite agroinfiltrazione è stata dimostrata su scala industriale per la produzione di proteine farmaceutici 14, così ci è potenziale per questa piattaforma essere esteso per la produzione commerciale di alto valore triterpeni. In alternativa, è anche possibile prevedere la produzione di trasformanti stabile portando via biosintetica multigenica del desiderio finalizzato, che permette la coltivazione di massa e continuo 'agricoltura' di transgenici benthamiana N. ceppi produzione di mescole differenti di valore commerciale.

I triterpeni sono uno dei più grandi e la maggior parte delle famiglie strutturalmente diversificata di prodotti naturali vegetali. Nonostante la loro diversità immensa, tutti i prodotti naturali del triterpene sono creduti per essere derivato dalla stessa lineare precursore 2,3-oxidosqualene, un prodotto della via del mevalonate nelle piante. Ciclizzazione di 2,3-oxidosqualene è avviato e controllato da una famiglia di enzimi chiamati oxidosqualene ciclasi (OSSC). Questo passaggio di ciclizzazione rappresenta il primo livello di diversificazione, con centinaia di diversi triterpene impalcature che sono segnalate da natura1. Queste impalcature sono ulteriormente diversificate di sartoria enzimi tra cui, ma non limitato a, citocromo p450s (CYP450s)1,2. Tali vie biosintetiche possono portare a immensa complessità, a volte con conseguente prodotti finali che sono a malapena riconoscibili dal triterpene del padre. Ad esempio, la complessa struttura del potente insetticida e antifeedant Limonoide azadiractina è creduta per derivare da un triterpene tetraciclico del tirucallane tipo3.
Molti prodotti naturali derivati triterpenici, anche quelli con impalcature padre relativamente invariato, hanno dimostrati di possedere attività biologica in medicina pertinenti4,5,6,7. Tuttavia, finora questo potenziale non è tradotto in una pletora di farmaci derivati triterpenici nella clinica. Questo è probabilmente (almeno parzialmente) una conseguenza dell'accesso sintetico pratica limitata a questa classe di composti, un problema che può soffocare l'esplorazione delle relazioni struttura-attività e lo sviluppo di condurre i candidati da tradizionali medicinali flussi di lavoro di chimica.
L'espressione transitoria degli enzimi biosintetici del triterpene da altre specie di piante a foglie N. benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici (Figura 1). Questo processo può essere utilizzato per caratterizzare funzionalmente enzimi candidato e ricostruire le vie biosintetiche dei metaboliti importanti naturale. Ugualmente, può anche essere sfruttato negli approcci combinatoriali biosintetici di produrre prodotti di romanzo del triterpene, una strategia che può provocare nelle librerie di analoghi strutturalmente correlate, consentendo l'esplorazione sistematica delle relazioni struttura-attività 8,9i composti di piombo biologicamente attivo.
Agroinfiltrazione è uno strumento semplice ed efficace espressione transiente in N. benthamiana foglie. Il processo prevede l'infiltrazione di foglie con una sospensione di a. tumefaciens che trasportano il construct(s) di espressione binaria di interesse. Questo risultato è ottenuto tramite l'applicazione di pressione che costringe il liquido attraverso gli stomi, spostando l'aria nello spazio intercellulare e la sua sostituzione con la sospensione di a. tumefaciens . I batteri trasferire i rispettivi T-DNA all'interno delle cellule della pianta, con conseguente espressione della proteina localizzata e transitori in tessuto fogliare infiltrate.
Mentre qualsiasi vettore binario adatto per generazione di piante transgeniche possono essere impiegate per l'espressione transitoria, utilizziamo la Cowpea Mosaic Virus CPMV-derivato Hypertranslational (HT) proteina espressione sistema10, 11. in questo sistema il gene di interesse è fiancheggiato da regioni non tradotte (UTR) da CPMV RNA-2. 5' UTR contiene modifiche risultanti a livelli molto elevati di traduzione della proteina con nessun affidamento sulla replicazione virale12. Questa tecnica è stata sviluppata in serie di vettore binario di facile e rapido (pEAQ) che comprende la clonazione protocollo compatibile con costrutti (pEAQ -HT- DEST)10,11site-specific di ricombinazione. La maggior parte pEAQ vettori contengono anche un pomodoro bushy stunt virus-derivato P19 silenziamento suppressor gene13 all'interno della parte di T-DNA della cassetta di espressione, che aggira la necessità di coinfiltrate un ceppo P19-trasportare separato e offre molto espressione di proteine ad alto livello nell'ospite pianta cella10,11.
Uso di N. benthamiana come un host di espressione ha particolari vantaggi quando si lavora con vie biosintetiche pianta. L'architettura cellulare supporta intrinsecamente appropriato mRNA e proteina elaborazione e compartimentalizzazione corretta, oltre a possedere le necessari co-enzimi, riduttasi (per CYP450s) e precursori metabolici. Fonte di carbonio è la fotosintesi; così, piante possono essere coltivate semplicemente in compost di qualità buona, che richiedono solo acqua, CO2 (dall'aria) e luce del sole come input. La piattaforma è anche estremamente conveniente per la co-espressione di diverse combinazioni di proteine, come questo può essere raggiunto facilely per co-infiltrazione di diversi ceppi di a. tumefaciens, negando la necessità di costruire grandi espressione multigenica cassette. Inoltre, il processo può essere linearmente e affidabile scalato semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate nell'esperimento.
Lavoro precedente nel nostro laboratorio ha dimostrato l'utilità di questa piattaforma per esperimenti su scala preparativa. Questo incluso la preparazione di triterpeni romanzo per uso in saggi di bioattività e scala fino a raggiungere la quantità di grammi di prodotto isolato. Inoltre, può essere aumentato accumulo di prodotti eterogenei triterpene molteplice di co-espressione di una forma N-terminal-troncato, feedback-insensibile di 3-idrossi, 3-methyglutary-coenzima A reduttasi (tHMGR), una limitazione della velocità a Monte enzima in mevalonate pathway8.
Chiave per tali esperimenti preparativo-scala è la capacità di up-scala convenientemente il processo di infiltrazione. In un tipico esperimento, decine o centinaia di piante possono essere necessaria per raggiungere la quantità di destinazione del prodotto isolato. Le singole foglie di infiltrazione a mano (usando una siringa inutile) è funzionalmente esigente e spesso costi proibitivi che richiede tempo, rendendo questo metodo poco pratico per scale-up routine. Infiltrazione vuoto offre vantaggi rispetto l'infiltrazione di mano, poiché non è dipenda dal livello di abilità dell'operatore e consente l'infiltrazione di una maggiore area della superficie fogliare. Questa procedura è usata commercialmente per la produzione su larga scala di proteine farmaceutici14. Questo protocollo utilizza un apparato di infiltrazione vuoto facilmente replicabili, che può essere costruito da parti commercialmente disponibili. Questo consente l'infiltrazione simultanea di fino a 4 piante, offrendo l'infiltrazione batch-wise rapido e pratico di centinaia di piante in un breve periodo di tempo (Figura 2a -2b). L'apparato di infiltrazione vuoto è costituito da un forno sotto vuoto che forma la camera di infiltrazione (Figura 2f). Il forno è collegato ad una pompa tramite un serbatoio a vuoto. Questo riduce notevolmente il tempo necessario per ottenere il vuoto desiderato nella camera di infiltrazione. Le piante sono fissate in un supporto su misura e invertite in un bagno di 10 L d'acqua in acciaio inox riempito con sospensione a. tumefaciens (Figura 2a -2C). Completa immersione delle parti aeree delle piante è importante per l'infiltrazione efficace. Bagno d'acqua viene poi collocato all'interno della camera di infiltrazione (figura 2d -2e) e il vuoto applicato per disegnare l'aria fuori gli spazi interstiziali di foglia. Una volta che la pressione è stata ridotta da 880 mbar (un processo che dura circa 1 min) la camera di infiltrazione è portata rapidamente indietro a pressione atmosferica oltre 20-30 s aprendo la valvola di aspirazione del forno, dopo di che l'infiltrazione è completa.
Cinque giorni dopo l'infiltrazione di materiale vegetale è pronto per la raccolta e la successiva estrazione e l'isolamento del prodotto desiderato. Da questo punto il processo è semplicemente uno dei prodotto naturale estrazione e purificazione da materiale del foglio, un flusso di lavoro che è familiare a qualsiasi chimico prodotto naturale. Molti metodi diversi per l'iniziale estrazione e purificazione successiva esistono15. La scelta più appropriata di metodi e le condizioni esatte utilizzate dipende fortemente le particolari proprietà chimiche del composto di interesse, oltre alla disponibilità di competenze e/o attrezzature. Non è possibile includere in questo protocollo un metodo completamente generalizzabile, passo-passo per l'elaborazione a valle del materiale raccolto pianta foglia isolato prodotto che potrebbe essere seguito ciecamente per qualsiasi prodotto del triterpene di interesse, né sarebbe appropriato per tentare di farlo. Tuttavia, questo protocollo fornirà una panoramica del flusso di lavoro base utilizzato nel nostro laboratorio e alcuni metodi per le fasi iniziali del processo, che nella nostra esperienza si sono rivelati generalizzabile per prodotti di triterpene aglicone più ossigenati. Questo include due tecniche relativamente rari, vale a dire, estrazione pressurizzata di solvente (PSE) e un metodo conveniente fase eterogenea per la rimozione di clorofilla utilizzando una resina a scambio ionico fortemente basico.
PSE è una tecnica altamente efficiente per l'estrazione di piccole molecole organiche da matrici solide. Le estrazioni vengono eseguite sotto pressione (ca. 100-200 bar), scegliere il vantaggio principale è la possibilità di utilizzare alleviò le temperature che superano il punto di ebollizione del solvente di estrazione. Questo può ridurre significativamente il tempo e la quantità di solvente necessario per ottenere un'estrazione esaustiva, rispetto ad altre tecniche di solvente caldi come semplice riflusso o Soxhlet estrazioni16. Strumenti commerciali di PSE banco sono disponibili, che utilizzano cellule di estrazione intercambiabili e solvente automatizzati movimentazione, riscaldamento e monitoraggio. Questo rende questa tecnica estremamente conveniente. È anche probabilmente meno pericoloso, in particolare per gli operatori con esperienza di chimica pratica limitata.
Saponificazione di estratti grezzi foglia sotto riflusso seguita da liquido/liquido partizionamento è una tecnica comune per la rimozione di massa delle clorofille prima purificazione successiva o analisi. Tuttavia, questo può spesso essere operativamente esigenti su scala più ampia. Inoltre, la rilevazione dell'interfaccia, o della perdita del prodotto dovuta alla formazione di emulsioni può essere problematico. L'uso di resine scambiatrici di ioni fortemente basico per eseguire idrolisi in fase eterogenea può servire come una comoda alternativa. La parte pigmentata della clorofilla idrolizzata rimane aderita alla resina e può essere semplicemente rimossi per filtrazione. Questo protocollo utilizza un adattamento di scala preparativa di un procedimento analitico precedentemente segnalati17 che si avvale di una resina a scambio ionico base disponibili in commercio.
Qui di seguito descriviamo un protocollo dettagliato e rapido per la produzione su scala preparativa di triterpeni che utilizzano questa piattaforma vegetale. Questo protocollo viene utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per preparare decine o centinaia di milligrammi del triterpene isolato prodotto per applicazioni tale caratterizzazione strutturale mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), e/o ulteriore studio in funzionale saggi.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

I triterpeni sono uno dei più grandi e la maggior parte delle famiglie strutturalmente diversificata di prodotti naturali vegetali. Molti derivati triterpenici hanno dimostrati di possedere attività biologica in medicina pertinenti. Tuttavia, finora questo potenziale non è tradotto in una pletora di farmaci derivati triterpenici nella clinica. Questo è probabilmente (almeno parzialmente) una conseguenza dell'accesso sintetico pratica limitata a questa classe di composti, un problema che può soffocare l'esplorazione delle relazioni struttura-attività e lo sviluppo di condurre i candidati da tradizionali medicinali flussi di lavoro di chimica. Nonostante la loro diversità immensa, triterpeni sono tutti derivati da un singolo precursore lineare, 2,3-oxidosqualene. L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in N. benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti di alto valore triterpene che non sono prodotte naturalmente da questo host. Agro-infiltrazione è uno strumento semplice ed efficace espressione transiente in N. benthamiana. Il processo prevede l'infiltrazione delle foglie delle piante con una sospensione di Agrobacterium tumefaciens che trasportano il construct(s) di espressione di interesse. Co-infiltrazione di un ulteriore a. tumefaciens ceppo che trasportano un costrutto di espressione codifica un enzima che aumenta il rifornimento di precursore significativamente aumenta produce. Dopo un periodo di cinque giorni, il materiale infiltrato foglia possa essere raccolti ed elaborato per estrarre e isolare i prodotti triterpene risultante. Si tratta di un processo che è scalabile in modo lineare e affidabile, semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate nell'esperimento. Qui è descritto un protocollo per produzione rapida di preparativo-scala di triterpeni che utilizzano questa piattaforma vegetale. Il protocollo utilizza un apparato di infiltrazione vuoto facilmente replicabili, che permette l'infiltrazione simultanea di fino a quattro impianti, consentendo l'infiltrazione batch-wise di centinaia di piante in un breve periodo di tempo.

Rendimenti tipici isolati dipendono dalla combinazione enzima/enzima sotto inchiesta, la stabilità chimica del composto di destinazione e come contestare il processo di purificazione è stato. Precedentemente abbiamo segnalato isolati rendimenti di β-amirina derivati dai nostri esperimenti di biosintesi combinatoria che vanno da 0,12 a 3,87 mg per grammo di N. benthamiana foglia polvere secca. Questi composti hanno variato ampiamente nel livello di ossidazione e incluso innaturale combinazioni di enzimi (Figura 3)8. Questo protocollo è utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per produrre decine o centinaia di milligrammi di prodotto purificato per la caratterizzazione strutturale mediante spettroscopia NMR e saggi funzionali a valle. Abbiamo anche dimostrato l'utilità preparativa di questa piattaforma producendo 0,8 g del triterpene impalcatura β-amirina una purezza superiore al 98%. Questo esperimento 459 piante usate e rappresenta un rendimento isolato di 3,3 mg per grammo di a secco N. benthamiana foglia polvere8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figura 1: riepilogo schematico. Rappresentazione schematica del processo sfruttando l'espressione transitoria degli enzimi biosintetici in foglia N. benthamiana per deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione preparativa di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figura 2: vuoto infiltrator costruzione e processo. un) Bespoke pianta titolare un'ala distaccata. b) Bespoke ali di titolare pianta attaccate. c) inversione e sommersione delle piante. d) inserimento del bagno infiltrazione. bagno e) infiltrazione nel posto all'interno della camera di infiltrazione. f) Complete infiltrator vuoto: pompa per vuoto (1) (2) collegamento dalla pompa alla valvola d'isolamento serbatoio serbatoio a vuoto vuoto (3) (4) collegamento tra serbatoio a vuoto e la valvola di aspirazione (5) manometro (6) aria di infiltrazione camera (7) Serbatoio vuoto di infiltrazione camera (8). g) rappresentante foglie da una pianta infiltrata con un costrutto di espressione per la proteina fluorescente verde (GFP) dopo la crescita post-infiltrazione di cinque giorni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figura 3: precedentemente segnalati risultati rappresentativi per la preparativa produzione di β-amirina derivati utilizzando questo protocollo8. Questa tabella è ordinata da rendimenti isolati. Colonne sono formattate in modo condizionale con indicazione di colore del valore relativo. Rosso = alto, verde = basso (anche se intermedio giallo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K Views.  John Innes Centre. L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ricerca

Ambiente

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In piante di tabacco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Bioingegneria

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Biochimica

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biologia

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Estrazione e purificazione efficiente di GFP-His dalle foglie di N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dell'estrazione delle proteine apoplast per un recupero efficiente delle proteine ricombinanti dalle cellule vegetali

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Metodo basato sull'estrazione di Apoplast per migliorare la purezza delle proteine ricombinanti prodotte dalle piante  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

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