MUB40 è un nuovo marcatore neutrofilo, che si lega alla lattoferrina e consente un rilevamento specifico nel campione di tessuto umano e di tutti i mammiferi testato finora. Etichettare i neutrofili con MUB40 è facile, veloce e specifico. Ora è ampiamente usato nel nostro laboratorio e l'implicazione di questa tecnica si estende verso la diagnosi di malattie infiammatorie.
Per iniziare, preparare le soluzioni una, due e tre in base al protocollo di testo e posizionarle in un armadio anossico durante la notte. Quindi, centrifugare i tubi del sangue raccolto a 650 g per 20 minuti per separare le cellule dalla frazione plasmatica. Senza disturbare il sangue separato, trasferire i tubi nell'armadio anossico e trasferire le frazioni plasmatiche in un tubo conico da 50 millilitri.
Successivamente rimuovere il tubo di plasma dall'armadio anossico e centrifugarlo a 2900 g per 20 minuti. Facendo attenzione a non interrompere le piastrine pelletate, trasferire il tubo nell'armadio anossico e pipettare il plasma povero di piastrine in un tubo fresco da 50 millilitri. Utilizzando i tubi di raccolta del sangue, unire i globuli rossi in un tubo conico da 50 millilitri.
Quindi, aggiungere la soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% fino a quando il volume totale non raggiunge i 44 millilitri e aggiungere sei millilitri del 6%dextran. Invertire il tubo da 10 a 20 volte per mescolare delicatamente il sangue e la miscela di dextran e lasciare che il tubo sedimenti per almeno 30 minuti. Mentre il tubo sedimenta, preparare un gradiente di Percoll aggiungendo 4,2 millilitri di soluzione Percoll a 5,8 millilitri di plasma e invertire il tubo per mescolare.
Successivamente, raccogliere il neutrofilo contenente la frazione superiore del dextran, facendo attenzione a non pipettare i globuli rossi. Stringere il tappo a vite, rimuovere il tubo di dextran dall'armadio anossico e centrifugare il tubo a 300 g per 10 minuti. Facendo attenzione a non disturbare le cellule pellettate, riposizionare il tubo nell'armadio anossico.
Quindi, rimuovere il liquido tubazione. Riutilizzare delicatamente il pellet in un millilitro di plasma. Aggiungere lentamente le celle rimescolate alle parti superiore della soluzione Percoll.
Rimuovere con cura il tubo di soluzione Percoll dall'armadio anossico e centrifugarlo a 800 g per 20 minuti per separare i PBBC dai neutrofili. Successivamente, preparare 14 millilitri di soluzione tampone di lavaggio secondo il protocollo di testo. Quindi, posizionare il tubo Percoll nell'armadio anossico.
Utilizzare una pipetta per rimuovere il Percoll e il PBPC e rimorsi il neutrofilo contenente pellet in un millilitro di soluzione tampone di lavaggio. Aggiungere quindi 200 microlitri di perline magnetiche alle cellule rimorsi. Mescolare e incubare delicatamente le cellule e le perline per almeno 15 minuti.
Dopo questo, lavare due volte una colonna di separazione, con due millilitri di tampone di lavaggio. Tenendo un nuovo tubo conico da 15 millilitri sotto la colonna, pipettare lentamente la miscela di globuli rossi neutrofili attraverso la colonna. Il flusso dalla colonna dovrebbe essere torbido e perdere il suo colore rosso, confermando la separazione totale dei neutrofili dai globuli rossi rimanenti.
Aggiungere due millilitri di tampone di lavaggio nella parte superiore della colonna e raccogliere il flusso nello stesso tubo. Entro la fine di questo lavaggio, il flusso dovrebbe essere chiaro. Mescolare delicatamente il tubo di raccolta per assicurarsi che i neutrofili siano distribuiti uniformemente.
Quindi raccolti 10 microlitri del flusso attraverso il conteggio delle cellule. Successivamente, rimuovere il tubo neutrofilo dall'armadio anossico e centrifugare il tubo a 300 g per 20 minuti. Riposizionare i neutrofili sedimentati nell'armadio anossico e rimuovere il tampone di lavaggio tramite pipettazione.
Quindi, resuspend il pellet nel plasma. Aggiungere un microlitro di RI-MUB40-Cy5 a un millilitro di mezzo RPMI-1640, senza rosso fenolo, e mescolare tramite pipettazione. Quindi, aggiungere un microlitro di soluzione FMLP e pipetta da mescolare.
Trasferire la miscela su un piatto di microscopia con fondo di vetro. Quindi aggiungere un volume appropriato di cellule purificate al piatto. Infine, posizionare il piatto in un microscopio fluorescente invertito e avviare l'acquisizione dell'immagine.
In questo protocollo, MUB40 è stato utilizzato sulle cellule viventi per rilevare la secrezione di neutrofili durante la simulazione con FMLP. La dinamica del rilascio del contenuto di granuli, compresa la lattoferrina, può essere vista nel tempo, qui a Magenta. MUB40 può essere utilizzato anche su neutrofili fissi.
Qui, fagocitizzando le perle fluorescenti in una serie a tempo. Il contenuto del granulo neutrofilo è etichettato qui in blu. I neutrofili hanno mostrato poca o nessuna colorazione cellulare nei primi punti di tempo e gradualmente, l'etichettatura RI-MUB40 è aumentata nel tempo, sia sulla membrana plasmatica che sulla superficie del tallone.
MUB40 può essere utilizzato anche su tessuti infiammatori fissi per rilevare specificamente i neutrofili, come mostrato nelle figure di testo. Descriviamo qui la procedura di purificazione dei neutrofili, applicata regolarmente nel nostro laboratorio. Qualsiasi altro metodo è adatto, l'etichettatura MUB40-Cy5 funzionerà ancora.
Neutrofilo può essere specificamente etichettato con MUB40 dopo la purificazione, o direttamente in tessuto infiammato da pazienti o modelli animali. Diversi derivati MUB40 sono stati progettati per ampliarne l'uso. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada al ricercatore nel campo dell'infiammazione, per esplorare il reclutamento neutrofilo e l'attivazione nelle malattie infiammatorie.
