Questo lavoro è stato sostenuto da start up fondi dalla New York University. Ringraziamo Maitreya Dunham e Matt Brauer che ha inizialmente sviluppato l&#39;uso di bioreattori Sixfors come chemostati.

Il principio di coltura continuo utilizzando un chemostat può essere realizzato in una varietà di implementazioni. In tutti chemostati è essenziale per avere 1) metodi per mantenere la sterilità di tutti i componenti, 2) una cultura ben miscelato, 3) aerazione adeguata del recipiente di coltura e 4) in modo affidabile Inoltre media e rimozione cultura. Qui, descriviamo l&#39;uso di un bioreattore Sixfors (Infors Inc) come chemostat utilizzando metodi che possono essere facilmente adattato alle configurazioni alternative. 1. Montaggio delle navi chemostato <ol><li> Accendere i Sixfors utilizzando l&#39;interruttore principale. </li><li> Sciacquare accuratamente la nave chemostato, assemblaggio agitatore, e il tubo attaccato con acqua deionizzata (DI). Controllare tutti i tubi e anelli di tenuta e sostituire eventuali pezzi usurati cercando. </li><li> Assicurarsi che la base di supporto albero motore è rivolto verso l&#39;alto nel recipiente di vetro e che la parte superiore dell&#39;albero motore viene agganciato nella sua sede sul gruppo agitatore. Impostare il stirreassembly r nel recipiente di vetro garantendo fondo dell&#39;albero motore è seduto nel supporto dell&#39;albero motore. Utilizzare il morsetto per fissare il gruppo agitatore nel recipiente di vetro. </li><li> Riempire il serbatoio con circa 300 ml di acqua deionizzata. </li><li> Rimuovere i tappi da un ossigeno disciolto (DO 2) sonda e controllare il livello di elettroliti svitando il carter inferiore e fare in modo che il corpo inferiore è riempita a metà con soluzione elettrolitica. Riavvitare il carter inferiore e inserire nella porta sulla nave chemostato. Avvitare fino a stringerla. </li><li> Prendete una sonda pH e rimuoverlo dal suo buffer di memoria (3 M KCl). Rimuovere il tappo sonda pH e allegare al fermentatore 1. Utilizzando la schermata di controllo Sixfors, accedere al menu dei parametri fermentatore e selezionare &quot;calibrare pH&quot;. Posizionare la sonda pH in un buffer standard di pH 7 e la lettura record come Alta Read. Ripetere con pH 4 e la lettura record come Low lettura. Staccare la sonda pH dal fermentatore, lavare con acqua deionizzata e inserire la sonda into la porta sulla nave chemostato. Avvitare fino a stringerla. </li><li> Posizionare il vaso chemostato nel rack. Nota sulla nave che fermentatore (1-6) la sonda pH è stato collegato e calibrato. Mettere il tappo sonda pH sulla sonda pH. Utilizzando un foglio di coprire ermeticamente la parte superiore della sonda DO 2. </li><li> Piegare un foglio sopra le estremità del tubo attaccato alla nave chemostato. </li><li> Ripetere i passaggi 1,2-1,8 per tutte le navi. </li><li> Sterilizzare i vasi da essi autoclave per 15 minuti su un ciclo liquido. </li></ol> 2. Preparazione del supporto <ol><li> Stabilire la gamma di limitazione delle concentrazioni di una sostanza nutritiva crescendo culture lotti in diverse concentrazioni di nutrienti. Il nutriente è limitante nell&#39;intervallo in cui la densità cellulare finale è una funzione lineare della concentrazione iniziale di nutrienti (Figura 4). Seleziona una concentrazione di nutrienti ben all&#39;interno della gamma di limitazione. Esempi di composizione supporti standard per studi con Saccharomyces cerevisiae sono disponibili in 7-11. </li><li> Autoclave una damigiana vuota che viene ricoperto con un tappo di gomma contenente un ingresso e l&#39;uscita dei media dopo la prima garantire che l&#39;estremità del tubo supporto è coperto in un foglio. </li><li> In un recipiente separato preparare 10 L di media. </li><li> Attaccare una tazza di filtro da 500 ml per una bottiglia da 100 ml media. Rimuovere il filtro in cotone con una pinza sterilizzati in etanolo e collegare immediatamente alla porta filtrazione su damigiana media. </li><li> Fissare la damigiana media per una sorgente di vuoto e filtro sterilizzare i media aggiungendo alla coppa del filtro. </li><li> Quando la filtrazione dei media è completa, chiudere la porta di filtrazione con una fascetta di metallo. </li></ol> 3. Calibrazione DO 2 sonde e configurazione chemostato <ol><li> Dopo i vasi chemostato sono stati sterilizzati in autoclave e lasciato raffreddare luogo della nave nel suo corrispondente giacca calore. Collegare la sonda di temperatura, sonda pH, e DO sonda 2. Lasciate che ilnave sedersi con l&#39;alimentazione per almeno 6 ore per consentire DO 2 sonde per polarizzare. </li><li> Posizionare l&#39;estremità di ogni tubo effluenti in un recipiente di raccolta separata. Collegare l&#39;aria attraverso un filtro di autoclave e accendere il flusso d&#39;aria. L&#39;acqua in ogni nave deve fuoriuscire dei tubi effluenti, che indica che tutte le guarnizioni siano adeguatamente formate. </li><li> Regolare l&#39;altezza del tubo effluente secondo il volume di lavoro desiderata (ad esempio 300 ml). Usiamo un righello contrassegnato con posizionamenti tubo calibrato ai diversi volumi di lavoro. </li><li> Collegare la damigiana supporto alla nave chemostato. Utilizzare etanolo al fine di mantenere le estremità del tubo sterile come possibile. Infilare il tubo della pompa attraverso la pompa e pinza aperta. Premere manualmente la pompa fin quando si inizia a fluire nel recipiente chemostat. Rilasciare il tubo dalla pompa, media dovrebbero fluire liberamente nel vaso chemostato. Quando i media raggiunge il tubo effluenti, riattaccare il tubo alla pompa e pinza. </li><li> Inizia running il programma di base con girante impostato a 400 rpm e la temperatura impostata a 30 ° C. </li><li> Per calibrare fare 2 sonde, spegnere alimentazione dell&#39;aria e passare a gas azoto. Attendere almeno un&#39;ora e registrare il valore di misura come &quot;basso read&quot;. Tornare alla alimentazione dell&#39;aria (ossia con concentrazione di ossigeno ambiente), attendere almeno un&#39;ora supplementare e misura record come &quot;high lettura&quot;. </li><li> Avviare la registrazione dei dati utilizzando il software Iris. </li></ol> 4. Inoculazione <ol><li> Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la parte superiore del recipiente di coltura. </li><li> Rimuovere la vite sulla parte superiore della nave e pipetta 1 ml di una cultura durante la notte nel vaso chemostato. Stringere nuovamente la vite. </li><li> Indicare il tempo di inoculazione in Iris. </li><li> Attendere circa 24 ore per le culture di raggiungere presto fase stazionaria. Come la cultura cresce, ossigeno disciolto e pH diminuisce. Nel caso di mezzi di glucosio-limitante, ossigeno disciolto tornerà ~ 100% in PHA stazionariaSE. Per altre limitazioni nutrienti ossigeno disciolto rimarrà &lt;100% in fase stazionaria. </li></ol> 5. Avvio Pompe e raggiungimento dello stato stazionario <ol><li> Il tasso di diluizione viene calcolata dividendo la portata (quante con fluido nel recipiente per ora) dal volume di coltura. Ad esempio, utilizzando un volume di 300 ml, un tasso di diluizione di 0,1 significa che 30 ml di supporto vengono aggiunti alla coltura ogni ora. Poiché il sistema è sotto pressione positiva lo stesso volume viene rimossa dal recipiente garantire che la cultura è continuamente diluito. Una gamma di tassi di diluizione (D) può essere usata che non superano il tasso massimo di crescita (μ max) delle cellule, oltre il quale le cellule verranno lavate fuori della chemostato. </li><li> Scegliere le impostazioni della pompa, che specificano il numero di secondi la pompa è accesa e spenta, per stabilire la portata desiderata. La pompa fornisce supporto ad una velocità di circa 0,11 ml / sec. </li><li> Definire un programma con l&#39;int Sixforserface che specifica la fasatura della pompa, la temperatura e la velocità girante. Avviare il programma. </li><li> Svuotare i recipienti di raccolta di liquido e registrare il tempo. </li><li> Dopo almeno due ore, utilizzare un cilindro graduato per misurare quanto i media è stato rimosso dal vaso. Questo sarà uguale al volume che è stato aggiunto al recipiente chemostat. Calcolare il tasso di diluizione (D = V effluenti / V cultura / tempo). Regolare le impostazioni della pompa se il tasso di diluizione calcolato non corrisponde alla percentuale di diluizione desiderata. </li><li> Allo stato stazionario, densità cellulare nel chemostato non cambia nel tempo. Questo può essere misurata senza perturbare la cultura campionando il deflusso. Noi definiamo operativamente il raggiungimento dello stato stazionario come misurazioni della densità delle cellule identiche che sono separati da almeno un raddoppio della popolazione. Raggiungere stato stazionario richiederà circa otto generazioni la cultura dopo l&#39;inizio della diluizione cultura. Allo stato stazionario, le cellule crescono in modo esponenziale (i.e. tasso di crescita costante nel tempo) in condizioni di nutrienti limitato. Il tempo di raddoppio della popolazione (tempo di generazione) è ln (2) / D. </li><li> Continua misurare periodicamente volumi di effluenti per la durata dell&#39;esperimento per garantire che un tasso di diluizione è mantenuta costante. </li></ol> 6. Applicazione 1: Studiare Cells crescendo a diversi tassi in condizioni di stato stazionario <ol><li> Allo stato stazionario nel chemostato, il tasso di crescita della popolazione di cellule è pari al tasso di diluizione. Alterando sistematicamente il tasso di diluizione è possibile coltivare cellule a velocità diverse. Ciò consente lo studio sistematico di parametri fisiologici che variano con il tasso di crescita compreso il volume delle cellule, stadio del ciclo cellulare e la resistenza allo stress. Inoltre, i profili steady-state di mRNA globale, proteine ​​e livelli dei metaboliti possono essere analizzati in cellule in crescita a ritmi diversi. Ci sono due modi per acquisire campioni: </li><li> I piccoli campioni possono essere passivamente obmantenuta inserendo l&#39;estremità del tubo effluente in una provetta da 1,5 ml o 15 ml. Un campione di 1-5 ml può essere ottenuta in pochi minuti (a seconda della portata). Molti parametri fisiologici possono essere misurati da questi campioni. </li><li> Espressione genica, o metabolita analisi richiedono grandi campioni che devono essere ottenuti più rapidamente possibile. Posizionare l&#39;estremità del tubo effluente in un tubo da 15 ml. Allentare la vite che fissa la fine del metallo del tubo effluenti e spingere delicatamente verso il basso. Un campione di 10 ~ ml sarà rapidamente riempire il vostro tubo. Tenete a mente che il volume nel recipiente chemostato è cambiato. Se vengono prese molti campioni consecutivi può essere necessario per ridurre il flusso di mantenere un tasso di diluizione costante. </li></ol> 7. Applicazione 2: Misura precisa delle differenze nei tassi di crescita tra i genotipi in ambienti controllati mediante saggi Concorso basati Citometria a Flusso <ol><li> Chemostati possono essere utilizzati per quantificare con precisione l&#39;effetto della concentrazione di nutrientisulle differenze nei tassi di crescita (cioè fitness) tra i diversi background genetico. Da ceppi co-coltura marcati con proteine ​​fluorescenti differenti il ​​tasso di variazione relativa abbondanza durante la crescita esponenziale è determinata. L&#39;esecuzione di questo test a diverse velocità di diluizione (D) permette lo studio degli effetti della concentrazione di nutrienti (s) sulle differenze di fitness. </li><li> Stabilire culture stato stazionario dei due ceppi di navi chemostato separate con tassi di diluizione identici e un volume di 300 ml. </li><li> Passivamente campione 1 ml di ciascuna nave. Spin le cellule, risospendere in tampone fosfato (PBS), e posto a 4 ° C. Questi campioni contengono campioni di cellule omogenee, che sono controlli per la successiva analisi di citometria a flusso. </li><li> Posizionare il tubo effluenti da una nave in un cilindro graduato autoclave. Allentare la vite che fissa la fine del metallo del tubo effluenti e spingere delicatamente verso il basso per espellere le cellule dal chemostato. Quandoil volume raggiunge 150 ml, di ritorno alla fine metallo del tubo effluenti nella sua posizione originale (300 ml). Ripetere con il secondo recipiente, utilizzando un cilindro graduato differente. </li><li> Utilizzare etanolo al 70% per mantenere la sterilità durante la rimozione vite sulla parte superiore del recipiente chemostat. Mettere imbuto in apertura e versare 150 ml dalla altra cultura nel vaso chemostato. Stringere nuovamente la vite. Ripetere con la seconda sezione, utilizzando il secondo imbuto. Ogni nave chemostato ora contiene una miscela dei due ceppi. </li><li> Ottenere un campione di 1 ml da ogni nave con campionamento passivo ogni 2-6 ore. Spin le cellule, risospendere in PBS e conservare a 4 ° C. Continua il prelievo di campioni per 2-3 giorni con attenzione registrando il tempo di ogni campione è stato preso. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, ultrasuoni e diluire campioni a ~ 2 x 10 6 cellule / ml. Citometria a flusso, misurare la proporzione dei due ceppi in ciascun campione. Poiché entrambi i ceppi sono in crescita esponenziale, la differenza di tasso di crescita relativa èdeterminata mediante regressione lineare di ln (strain1/strain2) contro il tempo (misurato in generazioni). La pendenza della regressione è proporzionale alla differenza nel tasso di crescita (cioè il vantaggio fitness) di un ceppo rispetto all&#39;altro. </li><li> Come la coltura mista può richiedere un certo tempo per raggiungere un nuovo stato stazionario, punti di tempo iniziale possono adattarsi male alla regressione. Questo problema viene risolto meglio, consentendo 2-3 generazioni che deve trascorrere prima di iniziare il campionamento o rimuovere i primi punti che sono valori anomali chiare. Invece, una volta un ceppo ha outcompeted dall&#39;altro i dati non sono più utili e questi punti devono essere esclusi. </li></ol> 8. Applicazione 3: Evolution Sperimentale <ol><li> Evoluzione sperimentale eseguita in chemostati seleziona per mutanti che sono aumentati in palestra nell&#39;ambiente di nutrienti limitato. La selezione viene generalmente eseguita su centinaia di generazioni. </li><li> Stabilire una cultura chemostato steady-state utilizzando un ceppogenotipo di nota (e di sequenza del genoma, preferibilmente noto) e un nutriente-limite definito. </li><li> Per mantenere un &quot;fossile&quot; della popolazione che adegua passivamente Campione chemostato ogni 2-3 giorni e memorizzare il campione in 15% glicerolo a -80 ° C. </li><li> Monitorare il serbatoio media e ricostituire con mezzi freschi se necessario. </li><li> Mantenere la coltura in crescita esponenziale per diverse centinaia di generazioni. </li><li> Dopo il completamento della piastra di selezione di un campione di cellule su piastre di agar solido. Dopo che le cellule sono cresciute in colonie, raccogliere un campione imparziale delle colonie con stuzzicadenti e inoculare cloni in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 100 ml di media. Permettere ai campioni clonali di crescere durante la notte, aggiungere 100 ml di 30% di glicerolo e conservare in -80 ° C. </li><li> Caratterizzare cloni per intero sequenziamento del genoma e l&#39;esecuzione di analisi fenotipiche tra cui la valutazione di idoneità, utilizzando un ceppo di riferimento comune fluorescente, come descritto nella domanda 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Chemostati permettono la coltivazione di microbi in condizioni di steady-state di crescita controllata. Le cellule crescono continuamente ad una velocità costante risultante in un ambiente esterno invariante. Questo è in contrasto con i metodi di coltura batch in cui l&#39;ambiente esterno è in continua evoluzione e il tasso di crescita delle cellule è determinata dalla complessa interazione di ambiente e genotipo. Pertanto, un vantaggio importante di coltura microbi in chemostati oltre colture in lotti è la capaci...

La crescita delle cellule è regolata da complesse reti di interazione dei fattori genetici e ambientali 1,2. La regolazione multifattoriale della crescita cellulare richiede un approccio a livello di sistema allo studio. Tuttavia, lo studio rigoroso della crescita cellulare regolamentato è contestata dalla difficoltà di controllare sperimentalmente la velocità con cui le cellule crescono. Inoltre, anche nelle condizioni più semplici esperimenti extracellulari sono frequentemente dinamico e complesso come cellule alterano continuamente il loro ambiente mentre proliferano. Una soluzione a questi problemi è fornita dal chemostat: un metodo di coltura di cellule che consente il controllo sperimentale dei tassi di crescita delle cellule in ambienti definiti, invarianti e controllati. Il metodo di coltura continuo utilizzando un chemostat è stato descritto in modo indipendente da Monod 3 e Novick &amp; Szilard 4 nel 1950. Come originariamente concepito, le cellule sono coltivate in un volume fisso di supporto che è constantemente diluita con l&#39;aggiunta di nuovi media e la rimozione simultanea di vecchi media e cellule (Figura 1). Accoppiate equazioni differenziali ordinarie (Figura 2) descrivono il tasso di variazione della densità delle cellule (x) e la concentrazione di una sostanza nutritiva (s) crescita limitativo nel recipiente chemostat. È importante sottolineare che questo sistema di equazioni prevede un unico (diverso da zero) stabile allo stato stazionario (Figura 3) con l&#39;implicazione notevole che allo stato stazionario, il tasso di crescita specifico delle cellule (cioè il costante tasso di crescita esponenziale), è pari al tasso alla quale la coltura è diluito (D). Variando la velocità di diluizione è possibile stabilire popolazioni steady-state di cellule a tassi di crescita diversi e in diverse condizioni di scarsità di nutrienti. Il controllo sperimentale del tasso di crescita utilizzando chemostati è stato fondamentale per lo sviluppo di una comprensione di come i cambiamenti fisiologia cellularecon tassi di crescita 5,6. Tuttavia, questo ex pilastro dei metodi microbiologici divenne sempre più oscuro durante l&#39;esplosione nella ricerca di biologia molecolare nel corso del tardo ventesimo secolo. Oggi, rinnovato interesse nel controllo della crescita in entrambi i microbi e organismi multicellulari e l&#39;avvento di metodi genoma scala per analisi a livello di sistema ha rinnovato motivazione per l&#39;uso di chemostati. Qui, descriviamo tre applicazioni che capitalizzano il controllo preciso dei tassi di crescita delle cellule e l&#39;ambiente esterno che sono unicamente possibile con chemostati. In primo luogo, si descrive l&#39;uso di chemostati per studiare come l&#39;abbondanza di migliaia di biomolecole - come trascrizioni e metaboliti - sono coordinatamente regolato con il tasso di crescita. In secondo luogo, si descrive come chemostati possono essere utilizzati per ottenere stime precise delle differenze di tasso di crescita tra i diversi genotipi in ambienti nutrienti limitata con esperimenti di competizione. In terzo luogo, si descrive come chemostati puòessere usato per studiare l&#39;evoluzione adattativa di cellule che crescono in ambienti poveri di nutrienti costanti. Questi esempi esemplificano i modi in cui i chemostati stanno consentendo indagini sistemi a livello di regolazione della crescita delle cellule, geni da interazioni ambientali e l&#39;evoluzione adattativa.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td>
			<td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle 9.5 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-887-1</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinchcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-867</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper, Size 12, Green Neoprene</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-62991-42</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30703-02</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose ties 4 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9557052</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone Rubber</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>B000FMWTDE</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 7/32 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1E</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K164</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K161</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook Connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-66-18Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratchet Clamp</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06403-11</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Female</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45512-34</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Male</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45513-04</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MTGR05010</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9131037</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Air</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32047-77</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Nitrogen</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32048-63</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Proportioner Multitube Frames</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-50</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator, Two-Stage Analytical</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12-N145D580</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Adaptor, Stainless Steel</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y99-26450</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Male Adaptor</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>WES544</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norprene Tubing</td>
			<td>US Plastics</td>
			<td>57280</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod Base</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-58</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Cartridges</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03217-92</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboy 10 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-963-2A</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP-T10-RE</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-800-100</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride&middot;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424205000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423400010</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate&middot;5H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209198</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60400</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride&middot;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>I88-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate&middot;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium molybdate&middot;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC24330-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>folic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inositol (aka myo-inositol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC12226-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niacin (aka nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-aminobenzoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC14621-2500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9755</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>riboflavin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4500-25G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP892-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0155-08-5</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of chemostats in microbial systems biology

Le cellule regolano il loro tasso di crescita in risposta a segnali dal mondo esterno. Con la crescita della cellula, diversi processi cellulari devono essere coordinati tra cui la sintesi macromolecolare, metabolismo e infine, l&#39;impegno per il ciclo di divisione cellulare. Il chemostato, un metodo per controllare sperimentalmente tasso di crescita cellulare, fornisce un potente mezzo di sistematicamente studiare come impatti tasso di crescita processi cellulari - tra l&#39;espressione genica e del metabolismo - e le reti di regolazione che controllano il tasso di crescita delle cellule. Quando mantenuta per centinaia di generazioni chemostati può essere usato per studiare l&#39;evoluzione adattativa di microbi in condizioni ambientali che limitano la crescita cellulare. Descriviamo il principio di culture chemostato, dimostriamo loro funzionamento e fornire esempi delle loro varie applicazioni. Dopo un periodo di inattività dopo la loro introduzione a metà del XX secolo, la convergenza delle metodologie genoma scala con una rinnovata nelteresse nella regolazione della crescita cellulare e la base molecolare della evoluzione adattativa è stimolare una rinascita nell&#39;uso di chemostati nella ricerca biologica.

Uno dei principali vantaggi di chemostati è la capacità di controllare la velocità di crescita delle cellule sperimentalmente variando il grado di diluizione. Nel lievito erba, Saccharomyces cerevisiae, la morfologia di una cellula è informativo della fase del ciclo di divisione cellulare. Popolazioni con tassi di crescita contengono una percentuale maggiore di divisione attivamente cellule come determinato misurando la frazione di cellule unbudded (Figura 5A). Analisi di espressione mRNA globale di...

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The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

the-use-of-chemostats-in-microbial-systems-biology

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Views.  New York University.  Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare. 

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Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Indagare la comunità microbica nel hindgut Termite - Intervista

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

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The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life activities. Its high prevalence in general population and the severe limitations it causes, point out the necessity to find new efficient strategies to treat it. Together with the cognitive-behavioral treatments, relaxation represents a useful approach for the treatment of GAD, but it has the limitation that it is hard to be learned. The INTREPID project is aimed to implement a new instrument to treat anxiety-related disorders and to test its clinical efficacy in reducing anxiety-related symptoms. The innovation of this approach is the combination of virtual reality and biofeedback, so that the first one is directly modified by the output of the second one. In this way, the patient is made aware of his or her reactions through the modification of some features of the VR environment in real time. Using mental exercises the patient learns to control these physiological parameters and using the feedback provided by the virtual environment is able to gauge his or her success. The supplemental use of portable devices, such as PDA or smart-phones, allows the patient to perform at home, individually and autonomously, the same exercises experienced in therapist's office. The goal is to anchor the learned protocol in a real life context, so enhancing the patients' ability to deal with their symptoms. The expected result is a better and faster learning of relaxation techniques, and thus an increased effectiveness of the treatment if compared with traditional clinical protocols.

The Project on Virtual Reality Intelligent Multi-sensor System for the Treatment of Anxiety-related Disorders (INTREPID) is aimed at developing a multi-sensor context-aware virtual reality system for the treatment of anxiety-related disorders.

L&#39;uso del Biofeedback in Clinica Realtà Virtuale: Il Progetto INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

Finestra su un micromondo: Sistemi Microfluidic semplice per studiare il trasporto microbica in mezzi porosi

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinare il contributo dei sistemi di energia durante l&#39;allenamento

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Collegamento rischio di predazione, stress Herbivore fisiologica e decomposizione microbica dei Rifiuti vegetali

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...