Il nostro lavoro è stato reso possibile dal sostegno finanziario McKnight Endowment Fund for Neuroscience (PAS), del National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022; PAS) e un pre-dottorato NIH NRSA borsa di studio per PA (F31AA017042) dal National Institute on Alcohol Abuse e alcolismo. Il GIRK2-L257W mutante è stato fornito dal Dr. Prafulla Aryal. Microscopio a fluorescenza e sponsorizzazioni gentilmente fornito da strumenti Leica.

1. Mutagenesi sito Noi usiamo mammiferi plasmide di espressione pcDNA3.1 codifica di un cDNA per GIRK2 e introdurre una mutazione puntiforme utilizzando Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II sito-kit mutagenesi, secondo le istruzioni del produttore. Sequenza primer può essere facilmente generato usando in linea programma di progettazione fondo disponibile all&#39;indirizzo: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Nota: uso standard Eppendorf provette da 1,5 ml al posto del BD 14 mL descritte nel protocollo. Tuttavia, l&#39;uso di XL10-Gold ultracompetent E. coli pretrattati con β-mercaptoetanolo, 30s tempo shock termico e NZY + (o NZYM +) i media sono fondamentali per la mutagenesi di successo. Se possibile, ingegneria una mutazione ulteriore silenzioso che crea un nuovo sito di restrizione può essere conveniente per lo screening di colonie mutanti sotto. 2. Miniprep, sequenziamento del DNA e Maxiprep 2,1 Qiagen miniprep e sequenziamento. Singole colonie batteriche vengono raccolte e coltivate in brodo LB con ampicillina (AMP). Seguiamo le istruzioni del produttore per la purificazione del cDNA. Un digest restrizione semplice può essere utilizzato confermare il successo della mutazione, se un sito di restrizione è incorporato nel punto 1. Automatizzato sequenziamento del DNA viene fatto fuori sede, ed è essenziale per confermare la presenza della mutazione in cDNA, così come di valutare se ci sono mutazioni indesiderate. Questo passaggio è molto importante. Noi sequenza l&#39;intera sequenza codificante GIRK utilizzando promotore T7 avanti e indietro BGH primer di sequenziamento che fiancheggiano sito clonazione multiplo della pcDNA3.1 plasmide. Nota: è importante controllare con attenzione la sequenza elettroferogramma sufficiente per assicurare la qualità dei dati di sequenziamento. Elettroferogramma di alta qualità è forte, non sovrapponibili, con picchi di rumore di fondo poco. 2,2 Qiagen maxiprep. Seguiamo le istruzioni del produttore. Nota: questo passaggio è incluso nei nostri esperimenti per migliorare la purezza del cDNA, che troviamo è importante per la trasfezione efficiente. 3. Cultura e Transfection delle cellule HEK293T Tutti questi passaggi dovrebbe essere fatto in una cappa sterile coltura di tessuti. 3,1 Colture cellulari Cellule HEK293T sono comodi da usare perché sono facili alla cultura (37 ° C, 5% CO 2 umidificata incubatore), il tempo veloce della replica, ad alta efficienza di trasfezione e sono suscettibili di whole-cell patch-clamp elettrofisiologia. Cellule HEK293T esprimere SV40 antigene T grande che assicura la replicazione del plasmide episomiale pcDNA3.1. HEK293T cellule sono coltivate in condizioni di scarsa glucosio DMEM dei media integrato con L-glutamina e 10% siero bovino fetale (FBS). Per le celle passaging, aggiungere 0,25% tripsina / EDTA per confluenti (90-95%), le cellule HEK293T, attendere che le cellule si staccano dal tessuto piatto, quindi arrestare l&#39;attività enzimatica con l&#39;aggiunta di mezzi freschi contenente FBS /. Piastra ~ 1 x 10 5 cellule / pozzetto in un piatto ben 12 colture cellulari con 1 ml di antibiotico senza mezzi di coltura per bene. (1 x 10 5 cellule è ~ 350 ml di sospensione cellulare ottenuta da confluenti T25 fiasco risospeso con 10 mezzi ml). 3,2 Transfection Dopo 8-24 ore, le cellule HEK aderisce alla plastica e sono pronti per la trasfezione. Trasfezione delle cellule con 0,2 mcg canale cDNA, 0,4 mg M2R recettore cDNA e 0,04 mcg YFP cDNA utilizzando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: si usa una piccola quantità di YFP cDNA per determinare quali cellule sono transfettate con successo (le cellule verdi probabilmente contengono entrambi i canali GIRK e recettori M2). La concentrazione di cDNA da utilizzare dovranno essere regolati per ciascun clone. 3,3 visualizzazione fluorescenza delle cellule trasfettate. Luogo 12-pozzetti sul palco di un microscopio invertito a fluorescenza, ed esaminare le cellule per l&#39;espressione YFP. Confronta con l&#39;immagine DIC e prendere nota del numero approssimativo di cellule verdi. Questo fornisce una stima della efficienza di trasfezione. 3.4 Preparazione di ben 24 piatti e poli-D-lisina scivola copertina patinata Pulire 12 millimetri scivola copertura in vetro (Warner, CS-12R) agitando per una notte con Radiacwash, seguita da lavaggio con acqua deionizzata e pernottamento agitazione in etanolo al 95%. Conservare il coprioggetto pulito nel 70% di etanolo fino al momento dell&#39;uso. Coperchio scivola posto in piastre di Petri con l&#39;etanolo, fiamme al largo di etanolo con pinze e bruciatore, unluogo d in un pozzetto di una sterile 24 pozzetti. Coprire ogni bene con 250 microlitri di poli-D-lisina (PDL), soluzione [0,2 mg / ml] e lasciare che il coprioggetto sedersi durante la notte immerso in una soluzione PDL sotto cappa sterile. Avvolgere il piatto ben 24 in Parafilm per evitare l&#39;evaporazione. La mattina dopo, aspirare PDL e lavare 2x con acqua sterile. Lasciare aperte le piastre ad asciugare sotto il cofano, poi coprire. I 24 piatti ben rivestiti con la polizza di copertura può essere avvolto in un foglio di alluminio sterile e conservato a temperatura ambiente per settimane. 3,5 cellule HEK293T Placcatura transfettate sulla copertina scivola 24 ore dopo la trasfezione delle cellule, suddivisi in ben 24 piatti (~ 4 X 10 3 cellule / pozzetto) contenente copertura in vetro scivola rivestito con poli-D-lisina. Nota: le cellule transfettate può essere utilizzato fino a 24-72 ore dopo la trasfezione. Le cellule sono divise per fornire scivola copertura individuale per l&#39;esperimento di patch clamp elettrofisiologia. 4. Elettrofisiologia 4,1 Soluzioni Preparazione Extracellulare (bagno) soluzione: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 HEPES mM (pH 7.4 insieme con NaOH). Aliquota 20K soluzione del bagno e aggiungere modulatori appropriato <ul><li> 20K + Ba 2 +: soluzione contenente 1 mM BaCl 2: uno specifico inibitore di rettificare le correnti verso l&#39;interno </li><li> 20K + carbacolo: soluzione con mM carbacolo 5: un agonista M2R specifico; coppie M2R a G-proteine ​​che canali aperti GIRK </li><li> 20K + Etanolo: soluzione bagno contenente 100 mM EtOH per attivare canali GIRK direttamente </li></ul> Bagno di soluzioni luogo in siringhe (contenitori soluzione) del sistema rapido di perfusione a scambio. Nota: Usiamo un sistema pizzico Warner valvole per controllare le soluzioni bagno. Tubi in PE è raccomandato. Interno / soluzione elettrodo: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl 2, 10 HEPES mM (pH 7,4) con 2,5 mM K 2 ATP e 0,3 mM GTP Li 2. Noi facciamo la soluzione elettrodo senza ATP e GTP. Noi a parte preparare aliquote di ATP e GTP, che sono conservati a -80 ° C, e aggiungere alla soluzione elettrodo, il giorno dell&#39;esperimento. Manteniamo siringa con soluzione finale elettrodo sul ghiaccio per preservare la ATP / GTP. Noi filtro sterile (0,2 micron) le soluzioni interna / esterna per inibire la crescita microbica e ridurre la possibilità di intasamento dei tubi e l&#39;elettrodo. 4,2 elettrodi Pulling Utilizziamo Narishige due fasi estrattore verticale e elettrodo di vetro borosilicato da Warner strumento (1,5 mm di diametro esterno, 0,86 mm di diametro interno e 7,5 cm di lunghezza) per ottenere elettrodi con 3-7 MΩ di resistenza quando è riempita di soluzione intracellulare. Nota: E &#39;necessario determinare sperimentalmente i parametri per l&#39;estrattore elettrodo e il tipo di vetro dell&#39;elettrodo nel vostro laboratorio. Per il nostro estrattore verticale, si usa una regolazione calore di 60,2 per il primo tiro e ~ 43 per la trazione secondo. 4,3 Whole-cell patch di bloccaggio <ol><li> Montare il coperchio scivolare in un piatto da 35 millimetri con piccola quantità di vaselina, coprire con soluzione esterna e piatto posto sul palco di un microscopio invertito a fluorescenza. Usa DIC di concentrarsi e trovare le celle, passare alla YFP fluorescenza per individuare YFP cellule positive. </li><li> Punta posizione di molteplici perfusione vicino a una cella verde (20-30 micron dalla cella di interesse = 2-3 lunghezza della cella a parte). </li><li> Riempire gli elettrodi con una soluzione, si attribuiscono alla headstage di amplificatore Axopatch 200B (Axon Instruments) con le seguenti impostazioni iniziali: Gain 1, Configurazione: intero a cellule β = 1, la modalità V-clamp. </li><li> Applicare una pressione positiva sul elettrodo per evitare l&#39;intasamento della pipetta, e usare il manipolatore di inserire punta dell&#39;elettrodo appena sopra la cella. </li><li> A zero il potenziale di pipetta, selezionare il pulsante di prova di tenuta per fornire un passo tensione di prova. I 5 step di tensione mV rettangolare appariranno nella finestra Sigillo Test di CLAMPEX. Regolare il potenziometro Pipettare Offset dell&#39;amplificatore di portare la linea di base corrente a 0 nA. In alternativa, zero il potenziale di pipetta, disattivando la modalità amplificatore selettore V-track e la manopola metro per VTrack e utilizzare il potenziometro Pipettare Offset dell&#39;amplificatore di portare la tensione sul display dello strumento amplificatore a &quot;0,00&quot;. </li><li> Controllare la resistenza di elettrodo di comando utilizzando il test di tenuta del software 8,2 CLAMPEX (dovrebbe essere 3-7 MΩ). </li><li> Aprire un file di protocollo salvato o creare un nuovo protocollo. Per aprire file di protocollo selezionare dal menu principale Acquisire protocollo aperto e poi scegliere un file salvato protocollo di tensione. Per questo esperimento, il protocollo è stato creato per tenere potenziale di membrana a-40mV, fornire un unico punto di tensione 50 ms a -100 mV e rampa a +40 mV oltre 200 ms. Questo protocollo viene eseguito ogni 2 secondi. Il protocollo consente di rampa per l&#39;osservazione della rettifica inversione di potenziale e verso l&#39;interno dei canali GIRK. Per tensione canali ionici, un passo di tensione rettangolare può essere più appropriato. </li><li> Cellula approccio con la regolazione fine del manipolatore, il rilascio a pressione positiva, dopo aver toccato la superficie della cellula applicare la pressione negativa, e monitorare aumento della resistenza nella finestra dell&#39;oscilloscopio Sigillo di prova. Una volta che la resistenza è nel range GΩ, l&#39;elettrodo ha sigillato sul membrana (Gigaseal si è formata). </li><li> Applicare un impulso di pressione negativa per rompere la membrana cellulare e accedere all&#39;interno della cellula. Una volta nella cellula intera configurazione, si registrerà un aumento correnti capacitive. </li><li> Passa alla prova membrana in CLAMPEX e scrivere l&#39;accesso resistenza Ra, la resistenza Rm membrana, Cm capacità di membrana e verificare ad occhio la misura esponenziale della curva teorica alla corrente reale capacitivo. Capacità della membrana è proporzionale alla dimensione della cella e saranno utilizzati successivamente per calcolare la densità di corrente. </li><li> Tornare alla prova di tenuta, insieme V-Out (potenziale di membrana) a -40 mV e filtro a 10 kHz </li><li> Compensare la capacità della membrana e la resistenza serie l&#39;amplificatore con le seguenti operazioni: <ol class="lalpha"><li> Accendere l&#39;interruttore TUTTO PAC su CELL. Regolare PAC cellule intere, e compone RESISTENZA SERIE avanti e indietro, fino ad ottenere un impulso di piatto prova. Potrebbe anche essere necessario per regolare capacità VELOCE pipetta manopola PAC. </li><li> Accendere la manopola% PREVISIONE a circa il 60-80%, ancora una volta ri-regolazione della PAC a cellule intere, e il quadrante resistenza in serie (potrebbe essere necessario regolare la capacità pipetta compensazione manopola VELOCE PAC pure). </li><li> Accendere% COMP-al 100% senza oscillante della cella, cercando di mantenere le pulsazioni piatto di ri-regolazione della PAC cellula intera e resistenza in serie (potrebbe essere necessario regolare la capacità pipetta compensazione VELOCE manopola PAC pure). Regolare il ritardo riducendo il tempo costante. </li><li> Annotare i valori di Cm (capacità di membrana), R (resistenza serie), COMP%,% PRED e tempo ritardo impostato sull&#39;amplificatore nel notebook. La Cm e Rs dovrebbe essere all&#39;incirca la stessa Cm e Rm misurata nel test a membrana di cui sopra. </li></ol></li><li> Accendere valvola soluzione esterna per controllare la soluzione del bagno. Impostare l&#39;amplificatore a 8 poli del filtro di Bessel per 2kHz, aprire un protocollo di tensione morsetto e iniziare la registrazione correnti. </li><li> Registriamo correnti GIRK utilizzando un protocollo rampa che passi a -100 mV per 50 ms poi rampe da 100 mV a +40 mV oltre 200 ms e viene consegnato ogni 2 secondi. Il protocollo consente di rampa per l&#39;osservazione del potenziale inversione e per raddrizzante verso l&#39;interno dei canali GIRK. A temperatura ambiente (22-25 ° C), il GIRK attuale dovrebbe invertire vicino a -50 mV (con 20 mM KCl nella vasca da bagno), che si trova vicino al potenziale di equilibrio calcolato per K (E K = -50 mV), quindi rimangono piuttosto piatto a potenziale positivo e K. </li><li> Protocollo sperimentale: Dopo la registrazione di una linea di base stabile, passare alla soluzione 20K + carbacolo e attendere picco di risposta, tornare a 20K soluzione del bagno, quindi applicare 20K Etanolo + e attendere risposta di picco, quindi passare alla 20K soluzione del bagno e, infine, 20K + Ba 2 + soluzione. Durante l&#39;applicazione di questi farmaci si vedrà cambiamenti nella ampiezza di GIRK correnti (più pronunciata a -100 mV). Prendere nota del numero traccia corrispondente all&#39;applicazione di diverse soluzioni extracellulari nel notebook. Un file Clampfit singolo conterrà tutti i spazza per l&#39;intero esperimento. </li></ol> 5. Analisi dei dati Utilizziamo Clampfit 9,2 software per analizzare i dati correnti GIRK a -100 mV. <ol><li> Aprire il file con la registrazione, impostare il cursore a -100 mV. Per impostazione predefinita vedrete tutte le tracce sovrapposte sullo schermo. Premendo l&#39;icona &quot;Scrivi cursori&quot; creerete Excel come foglio di calcolo con dati numerici. </li><li> Da X assegnando alla colonna numero di traccia e Y alla colonna di cursore e premendo l&#39;icona &quot;Create Graph&quot; si può rapidamente disegnare una volta portate trama dell&#39;esperimento. </li><li> Calcolare la corrente basale sottraendo corrente in presenza di Ba 2 + da correnti registrate in soluzione perfusione esterno da solo (&quot;20K corrente&quot; meno &quot;20K + Ba 2 + corrente&quot;). Calcolare le correnti indotte sottraendo corrente basale a 20K dalle correnti attivati ​​(&quot;20K + carbacolo corrente&quot; meno &quot;20K corrente&quot;, &quot;20K + etanolo corrente&quot; meno &quot;20K corrente&quot;). Calcolare la densità di corrente (pA / pF) dividendo l&#39;attuale capacità di membrana (leggere direttamente dall&#39;amplificatore). Calcolare l&#39;attivazione per cento dividendo correnti indotte dalle correnti basale e moltiplicando per 100. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Dovreste essere in grado di registrare corrente da cellule trasfettate con wild-type canali. Per la misura GIRK canalid nella soluzione extracellulare contenente 20 mM K + (e 145 mM K + intracellulare) che deve presentare una forte correzione verso l&#39;interno e un potenziale inversione di circa -50 mV, che è una proprietà essenziale di canali del potassio. La wild-type corrente aumenterà fortemente su carbacolo applicazione (3-5 volte maggiore rispetto alle attuali basale) e di rispondere in modo simile al etanolo 100 mm. Nota: la convenzione di segno per elettrofisiologia è che la corrente interna è negativa e la corrente verso l&#39;esterno è positivo. Per la mutazione L257W nella tasca di legame alcool GIRK2, vedrete le risposte attenuato sia per carbacolo ed etanolo. Questo suggerisce che L257 è coinvolto in alcool e l&#39;attivazione delle proteine ​​G di GIRK2 canali. Per ulteriori esempi dei risultati di GIRK2 mutagenesi, vedi recente pubblicazione da parte Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Finestra di Clampfit 8,0 mostra i dati per il file di wild-type di registrazione GIRK2. Pannello in alto a sinistra mostra sovrapposte spazza registrato in risposta ad un protocollo di rampa di tensione in presenza di differenti soluzioni esterne bah. Cursore 1 è posizionato a -100 mV. I valori del cursore vengono scritti nel foglio di calcolo (pannello destro). Inferiore del pannello a sinistra mostra la trama del numero spazzare contro, la corrente. Si noti l&#39;aumento di corrente (deflessione verso il basso) con etanolo (EtOH) e carbacolo (CARB) e inibizione della corrente con Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Descrizioni finestra di Clampfit 8,0 file mostra dati per un mutante GIRK2-L257W registrazione. Sono come nella figura 1. Rilevare la perdita di carbacolo (CARB) l&#39;attivazione e la riduzione delle EtOH-correnti indotte nei canali mutanti.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mutagenesi sito-diretta è un classico approccio per lo studio relazioni struttura-funzione dei canali ionici. Si basa sul presupposto che modificando un residuo critico del canale ionico si dovrebbe essere in grado di osservare i cambiamenti pronunciato nella funzione del canale. Al contrario, le mutazioni in molti non critici posizione può essere introdotta senza perturbazioni importanti per la funzione di canale. Tipicamente, il residuo in questione è prima mutato in alanina, un piccolo non polare aminoacido, seguita dalla mutazione di triptofano, il più grande di aminoacidi 2. Se il residuo è importante per la funzione di canale, sia le mutazioni cambierà l&#39;attività del canale. Se un residuo meno essenziale è mutato, gli effetti della mutazione, in particolare ad alanina sono spesso irrilevanti. Mutazioni triptofano hanno maggiori probabilità di causare cambiamenti a causa di impedimenti sterici legata alle dimensioni triptofano. Spesso, quando l&#39;informazione strutturale è carente, mutazione sistematico alanina o triptofano all&#39;interno di un frammento di canale (chiamato alanina o triptofano scansione) possono essere utilizzati per individuare residui di critica. E &#39;importante notare che i cloni multipli con mutazioni puntiformi diverse possono essere preparati in parallelo permettendo di analisi dei residui multipli all&#39;interno di tempo relativamente breve. Di recente, strutture cristalline più dei canali si sono resi disponibili 3,4,5. Essi possono essere utilizzati per proporre eventuale presenza di residui chiave per essere testati utilizzando l&#39;approccio descritto in questo protocollo. Misure su wild-type canale dovrebbe sempre accompagnare la misura di un canale mutante per servire come controllo positivo per garantire che gli esperimenti di trasfezione ed elettrofisiologiche sono state fatte correttamente. Mutazioni puntiformi può portare alla mancanza di una corrente funzionale, una simile corrente al regolamento wild-type o alterata dell&#39;attività canale. La mancanza di corrente misurabile può essere dovuto al traffico improprio pieghevoli o alterato. In tal caso può essere utile per scoprire se il canale traffici correttamente alla superficie usando un test biotinilazione o immunofluorescenza contro tag extracellulare (senza permeabilizzazione cellulare) per distinguere tra non funzionali dei canali sulla membrana plasmatica e canali trattenuto all&#39;interno della cellula . Infine, è consigliabile indagare non solo l&#39;attività basale del canale, ma anche le conseguenze della mutazione sulla regolazione del canale. Diversi meccanismi di modulazione della funzione di canale potrebbe essere studiata in funzione del canale ionico di interesse, tra cui la regolamentazione da parte delle proteine ​​G, PIP2, ioni, concentrazione di ATP, fosforilazione (con tirosina, serina o treonina mutazione), ubiquitinazione o sumoilazione (utilizzando mutazione lisina) e apri canale diretto o bloccanti.

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 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

Dimostreremo come studiare gli effetti funzionali di introdurre una mutazione puntiforme in un canale ionico. Studiamo proteina G-dipendenti di potassio dentro rettificazione (denominato GIRK) canali, che sono importanti per la regolazione della eccitabilità dei neuroni. Ci sono quattro diversi mammiferi subunità del canale GIRK (GIRK1-GIRK4) - ci concentriamo sulla GIRK2 perché forma un homotetramer. La stimolazione di diversi tipi di proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR), come il recettore muscarinico (M2R), porta all&#39;attivazione di canali GIRK. L&#39;alcool inoltre attiva direttamente canali GIRK. Mostreremo come mutare uno specifico amminoacido da cambiare una o più nucleotidi nel cDNA per il canale GIRK. Questa sequenza mutata cDNA sarà amplificato nei batteri, purificata, e la presenza della mutazione puntiforme sarà confermata dal sequenziamento del DNA. Il cDNA per i canali mutato e wild-type GIRK saranno trasfettate in cellule renali embrionali umane HEK293T coltivati ​​in vitro. Infine, whole-cell patch-clamp elettrofisiologia saranno utilizzati per studiare le correnti macroscopiche di potassio attraverso i canali ectopica espresso GIRK wild-type o mutato. In questo esperimento, esamineremo l&#39;effetto di una mutazione L257W in GIRK2 canali di attivazione M2R-dipendente e l&#39;alcol-dipendente.

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Dimostreremo come studiare l&#39;effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  Salk Institute for Biological Studies. Dimostreremo come studiare l'effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

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Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

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Biologia

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...