Usiamo questo protocollo per cercare nuovi candidati al vaccino contro la tubercolosi, ma posso essere applicato ad altre malattie infettive. Rispetto ai modelli di mammiferi questo metodo fornisce una procedura conveniente per lo screening preliminare di nuovi candidati al vaccino basati sul DNA. A dimostrare la procedura sarà Hannaleena Piippo, tecnico del nostro laboratorio.
Per iniziare, impostare il capillare di vetro nella scanalatura a V nella barra polare e stringere leggermente la manopola di bloccaggio. Spostare il supporto accanto al filamento e spingere delicatamente il capillare attraverso il filamento e nella barra polare dall'altra parte del filamento. Quindi, stringere le manopole di bloccaggio, impostare il vetro di sicurezza e premere il pulsante di trazione.
Successivamente, posizionare gli aghi su un pezzo di adesivo riutilizzabile all'interno di una piastra di Petri per proteggere le punte dell'ago. In primo luogo, preparare la miscela di iniezione utilizzando da 0,5 a 12 microgrammi di plasmide per dose. Preparare il volume appropriato di master mix per il numero di pesci nel gruppo.
Posizionare l'ago capillare sul lato appiccicoso di un pezzo di nastro adesivo sul supporto appropriato. Successivamente, goccioline di pipette di dosi plasmidiche su un pezzo di film di laboratorio. Dopo questo, utilizzare una punta di carico per trasferire le gocce plasmide dal film nell'ago.
Pipetta lentamente e con attenzione per evitare di pipettare bolle d'aria nell'ago. Posizionare il micro manipolatore e una sorgente luminosa. Quindi passare il rubinetto della pressione dell'aria in posizione aperta.
Sul pannello frontale del micro iniettore regolare la lunghezza dell'impulso a 10 secondi utilizzando la modalità a tempo. Quindi, mettere a punto la lunghezza dell'impulso con il quadrante del periodo di 10 giri. Quindi, impostare l'ago sul supporto della micro pipetta del micro manipolatore.
Utilizzare una pinzetta per tagliare la punta dell'ago per consentire l'esezione del liquido e utilizzare un microscopio per valutare la posizione dell'ago. Premere una volta l'interruttore remoto del piede per verificare che un impulso di un secondo spinga una piccola goccia fuori dall'ago. Quindi regolare le impostazioni dell'elettroporatore e collegare le pinzette all'elettroporatore.
Per mantenere il pesce in una posizione fissa durante l'iniezione utilizzare un pezzo di spugna con una scanalatura tagliata al centro come imbottitura. Immergere accuratamente la spugna nell'acqua del sistema e impostarla in una piastra di Petri. Utilizzando un cucchiaio di plastica, trasferire un zebrafish anestetizzato alla spugna bagnata con il lato ventrale del pesce verso il basso nel solco.
Al microscopio posizionare l'ago con un angolo di 45 gradi vicino al muscolo dorsale del pesce zebra, quindi trovare il piccolo punto senza squame davanti alla pinna dorsale e spingere l'ago nel muscolo. Se si sente una resistenza provare un punto adiacente. Utilizzare l'interruttore del piede per iniettare gradualmente la soluzione plasmide nel muscolo.
Al microscopio il rosso fenolo dovrebbe essere visibile quando entra nel tessuto muscolare. Elettroporare il pesce immediatamente dopo l'iniezione posizionando gli elettrodi di tipo tweezer su ciascun lato del sito di iniezione. Premere il pulsante di avvio sull'elettroporatore e dargli sei impulsi da 40 volt e 50 millisecondi.
Quindi, trasferire delicatamente il pesce in un serbatoio di recupero. Infine, dopo aver anaethisizing il pesce secondo il protocollo di testo, utilizzare una luce UV per vedere l'espressione EGFP vicino al sito di iniezione. In questo protocollo, gli antigeni del DNA sono stati clonati adiacenti alla GFP nel vettore di espressione.
Gli zebrafish sono stati iniettati con i plasmidi antigene del DNA per via intramuscolare con un micro iniettore, e il sito di iniezione è stato elettroporato per migliorare l'assunzione di plasmidi nelle cellule. Per l'imaging, l'espressione dell'antigene può essere visualizzato con microscopia a fluorescenza. In questo caso, l'espressione di tutte e tre le proteine di fusione GFP antigene è stata rilevata vicino al sito di iniezione, anche se la loro intensità variava.
Cinque settimane dopo l'immunizzazione con antigeni micobatterici, il pesce zebra è stato infettato da Mycobacterium marinum. QPCR è stato utilizzato per determinare il carico batterico in ogni pesce quattro settimane dopo l'infezione. Rispetto al gruppo di controllo, il pesce immunizzato con antigene ha mostrato una diminuzione dei carichi batterici dopo l'infezione da M.marinum.
Durante l'esecuzione di questo metodo è importante progettare attentamente il costrutto plasmide, convalidare l'espressione dell'antigene e praticare la tecnica di iniezione prima di esperimenti su larga scala. Questa tecnica può aprire la strada a uno screening preclinale economico di nuovi candidati al vaccino a base di DNA nel pesce zebra adulto. Non dimenticare che il benessere degli animali è molto importante e un'anestesia adeguata è essenziale durante l'esecuzione di questa procedura.
